Schizosaccharomyces pombe

Schizosaccharomyces pombe, también llamada "levadura de fisión", es una especie de levadura utilizada en la elaboración tradicional de cerveza y como organismo modelo en biología molecular y celular. Es un eucariota unicelular, cuyas células tienen forma de bastón. Las células suelen medir de 3 a 4 micrómetros de diámetro y de 7 a 14 micrómetros de longitud. Se estima que su genoma, que tiene aproximadamente 14,1 millones de pares de bases, contiene 4.970 genes que codifican proteínas y al menos 450 ARN no codificantes.

Estas células mantienen su forma al crecer exclusivamente a través de las puntas de las células y dividirse por fisión medial para producir dos células hijas de igual tamaño, lo que las convierte en una poderosa herramienta en la investigación del ciclo celular.

La levadura de fisión fue aislada en 1893 por Paul Lindner de la cerveza de mijo de África Oriental. El nombre de la especie pombe es la palabra swahili para cerveza. Fue desarrollado por primera vez como modelo experimental en la década de 1950: por Urs Leupold para estudiar genética y por Murdoch Mitchison para estudiar el ciclo celular.

Paul Nurse, un investigador de la levadura de fisión, fusionó con éxito las escuelas independientes de genética de la levadura de fisión y la investigación del ciclo celular. Junto con Lee Hartwell y Tim Hunt, Nurse ganó el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2001 por su trabajo sobre la regulación del ciclo celular.

La secuencia de la S. pombe fue publicado en 2002 por un consorcio liderado por el Instituto Sanger, convirtiéndose en el sexto organismo eucariota modelo cuyo genoma ha sido completamente secuenciado. Los investigadores de S. pombe cuentan con el apoyo de PomBase MOD (base de datos de organismos modelo). Esto ha desbloqueado por completo el poder de este organismo, con muchos genes ortólogos a los genes humanos identificados: el 70% hasta la fecha, incluidos muchos genes involucrados en enfermedades humanas. En 2006, la localización subcelular de casi todas las proteínas en S. pombe se publicó utilizando proteína fluorescente verde como etiqueta molecular.

Schizosaccharomyces pombe también se ha convertido en un organismo importante en el estudio de las respuestas celulares al daño del ADN y el proceso de replicación del ADN.

Aproximadamente 160 cepas naturales de S. pombe han sido aisladas. Estos se han recopilado de una variedad de lugares, incluidos Europa, América del Norte y del Sur y Asia. La mayoría de estas cepas han sido recolectadas de frutas cultivadas como manzanas y uvas, o de diversas bebidas alcohólicas, como la cachaza brasileña. S. pombe también se sabe que está presente en el té fermentado, kombucha. No está claro en la actualidad si S. pombe es el fermentador principal o un contaminante en tales brebajes. La ecología natural de las levaduras Schizosaccharomyces no está bien estudiada.

Historia

Schizosaccharomyces pombe se descubrió por primera vez en 1893 cuando un grupo que trabajaba en un Laboratorio de la Asociación de Cervecerías en Alemania estaba observando sedimentos encontrados en la cerveza de mijo importada de África Oriental que le daba un sabor ácido. El término esquizoide, que significa "dividido" o "fisión", se había utilizado previamente para describir otros Schizosaccharomycetes. La adición de la palabra pombe se debió a su aislamiento de la cerveza de África Oriental, ya que pombe significa "cerveza" en swahili. El estándar S. pombe fueron aisladas por Urs Leupold en 1946 y 1947 a partir de un cultivo que obtuvo de la colección de levaduras en Delft, Países Bajos. Fue depositado allí por A. Osterwalder bajo el nombre S. pombevar. liquefaciens, después de que lo aislara en 1924 del vino francés (probablemente rancio) en la Estación Experimental Federal de Vini- y Horticultura en Wädenswil, Suiza. El cultivo utilizado por Urs Leupold contenía (además de otras) células con los tipos de apareamiento h90 (cepa 968), h- (cepa 972) y h+ (cepa 975). Posteriormente a esto, ha habido dos grandes esfuerzos para aislar S. pombe a partir de frutas, néctar o fermentaciones: una de Florenzano et al. en los viñedos del oeste de Sicilia, y el otro por Gomes et al. (2002) en cuatro regiones del sureste de Brasil.

Ecología

La levadura de fisión S. pombe pertenece a la divisio Ascomycota, que representa el grupo de hongos más grande y diverso. Los ascomicetos de vida libre se encuentran comúnmente en los exudados de los árboles, en las raíces de las plantas y en el suelo circundante, en frutos maduros y en descomposición, y en asociación con insectos vectores que los transportan entre sustratos. Muchas de estas asociaciones son simbióticas o saprofitas, aunque numerosos ascomicetos (y sus primos basidiomicetos) representan importantes patógenos de plantas que se dirigen a innumerables especies de plantas, incluidos los cultivos comerciales. Entre los géneros de levaduras ascomicetas, la levadura de fisión Schizosaccharomyces es única debido a la deposición de α-(1,3)-glucano o pseudonigeran en la pared celular además de los β-glucanos más conocidos y el ausencia virtual de quitina. Las especies de este género también difieren en la composición de mananos, que muestra azúcares terminales de d-galactosa en las cadenas laterales de sus mananos. S. pombe se someten a una fermentación aeróbica en presencia de un exceso de azúcar. S. pombe puede degradar el ácido L-málico, uno de los ácidos orgánicos dominantes en el vino, lo que los hace diferentes entre otras cepas de Saccharomyces.

Comparación con la levadura en ciernes (Saccharomyces cerevisiae)

Las especies de levadura Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae se han estudiado exhaustivamente; estas dos especies divergieron aproximadamente entre 300 y 600 millones de años antes del presente y son herramientas importantes en biología molecular y celular. Algunos de los discriminantes técnicos entre estas dos especies son:

• S. cerevisiae tiene aproximadamente 5.600 marcos de lectura abierta; S. pombe tiene aproximadamente 5,070 marcos de lectura abierta.
• A pesar de números gen similares, S. cerevisiae tiene sólo unos 250 intrones, mientras S. pombe tiene casi 5.000.
• S. cerevisiae tiene 16 cromosomas, S. pombe tiene 3.
• S. cerevisiae es a menudo diploide mientras S. pombe es generalmente haploid.
• S. pombe tiene un complejo de telomere tipo refugio mientras S. cerevisiae No.
• S. cerevisiae se encuentra en la fase G1 del ciclo celular durante un período prolongado (como consecuencia, la transición G1-S está muy controlada), mientras que S. pombe permanece en la fase G2 del ciclo celular durante un período prolongado (como consecuencia, la transición G2-M está bajo control estricto).
• Ambas especies comparten genes con eucariotas superiores que no comparten entre sí. S. pombe tiene genes de maquinaria RNAi como los de los vertebrados, mientras que esto falta S. cerevisiae. S. cerevisiae también tiene heterocromotina grandemente simplificada en comparación con S. pombe. Por el contrario, S. cerevisiae tiene peróxidos bien desarrollados, mientras S. pombe No.
• S. cerevisiae tiene pequeño punto centromere de 125 bp, y los orígenes de replicación definida por secuencia de aproximadamente el mismo tamaño. En el converso, S. pombe tiene centrosmeres grandes y repetitivos (40–100 kb) más parecidos a los centromeres mamíferos, y orígenes de replicación degenerados de al menos 1kb.

S. vías pombe y procesos celulares

S. Los productos del gen pombe (proteínas y ARN) participan en muchos procesos celulares comunes a lo largo de toda la vida. La levadura de fisión GO slim proporciona una descripción categórica de alto nivel del papel biológico de todos los productos genéticos de S. pombe.

Ciclo de vida

La levadura de fisión es un hongo unicelular con un genoma simple, completamente caracterizado y una tasa de crecimiento rápida. Se ha utilizado durante mucho tiempo en la elaboración de cerveza, la cocción y la genética molecular. S. pombe es una célula en forma de bastón, de aproximadamente 3 μm de diámetro, que crece completamente por elongación en los extremos. Después de la mitosis, la división se produce por la formación de un tabique, o placa celular, que divide la célula en su punto medio.

Los eventos centrales de la reproducción celular son la duplicación cromosómica, que tiene lugar en la fase S (sintética), seguida de la segregación cromosómica y la división nuclear (mitosis) y la división celular (citocinesis), que se denominan colectivamente fase M (mitótica). G1 es la brecha entre las fases M y S, y G2 es la brecha entre las fases S y M. En la levadura de fisión, la fase G2 está particularmente extendida y la citocinesis (segregación de células hijas) no ocurre hasta que se lanza una nueva fase S (sintética).

La levadura de fisión gobierna la mitosis mediante mecanismos similares a los de los animales multicelulares. Normalmente prolifera en un estado haploide. Cuando mueren de hambre, las células de tipos de apareamiento opuestos (P y M) se fusionan para formar un cigoto diploide que inmediatamente entra en meiosis para generar cuatro esporas haploides. Cuando las condiciones mejoran, estas esporas germinan para producir células haploides en proliferación.

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  Características generales del ciclo celular.

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  El ciclo celular particular de una levadura de fisión.

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  Etapas de la División Schizosaccharomyces en brillante y oscuro campo luz microscopia

Citocinesis

Aquí se muestran las características generales de la citocinesis. El sitio de división celular se determina antes de la anafase. El huso de la anafase (en verde en la figura) se coloca de manera que los cromosomas segregados estén en lados opuestos del plano de división predeterminado.

Control de tamaño

En la levadura de fisión, donde el crecimiento gobierna la progresión a través de G2/M, una mutación wee1 provoca la entrada en la mitosis con un tamaño anormalmente pequeño, lo que da como resultado un G2 más corto. G1 se alarga, lo que sugiere que la progresión a través de Inicio (comienzo del ciclo celular) responde al crecimiento cuando se pierde el control de G2/M. Además, las células en malas condiciones de nutrientes crecen lentamente y, por lo tanto, tardan más en duplicar su tamaño y dividirse. Los niveles bajos de nutrientes también restablecen el umbral de crecimiento para que la célula progrese a través del ciclo celular a un tamaño más pequeño. Tras la exposición a condiciones estresantes [calor (40 °C) o el agente oxidante peróxido de hidrógeno] S. pombe las células experimentan un envejecimiento medido por el aumento del tiempo de división celular y el aumento de la probabilidad de muerte celular. Finalmente, las células de levadura de fisión mutantes wee1 son más pequeñas que las células de tipo salvaje, pero tardan el mismo tiempo en pasar por el ciclo celular. Esto es posible porque las células de levadura pequeñas crecen más lentamente, es decir, su masa total añadida por unidad de tiempo es menor que la de las células normales.

Se cree que un gradiente espacial coordina el tamaño celular y la entrada mitótica en la levadura de fisión. La proteína quinasa Pom1 (verde) se localiza en la corteza celular, con la concentración más alta en las puntas de las células. Los reguladores del ciclo celular Cdr2, Cdr1 y Wee1 están presentes en los nódulos corticales en el centro de la célula (puntos azules y rojos). a, En las células pequeñas, el gradiente de Pom1 llega a la mayoría de los nódulos corticales (puntos azules). Pom1 inhibe Cdr2, evitando que Cdr2 y Cdr1 inhiban Wee1, y permitiendo que Wee1 fosforile a Cdk1, inactivando así la actividad de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) y evitando la entrada en mitosis. b, En las células largas, el gradiente de Pom1 no llega a los nodos corticales (puntos rojos), por lo que Cdr2 y Cdr1 permanecen activos en los nodos. Cdr2 y Cdr1 inhiben Wee1, lo que impide la fosforilación de Cdk1 y, por lo tanto, conduce a la activación de CDK y la entrada mitótica. (Este diagrama simplificado omite varios otros reguladores de la actividad de CDK).

Conmutación de tipo de acoplamiento

La levadura de fisión cambia el tipo de apareamiento mediante un evento de recombinación acoplado a la replicación, que tiene lugar durante la fase S del ciclo celular. La levadura de fisión utiliza la asimetría intrínseca del proceso de replicación del ADN para cambiar el tipo de apareamiento; fue el primer sistema en el que se demostró que la dirección de replicación era necesaria para el cambio del tipo de célula. Los estudios del sistema de cambio de tipo de apareamiento conducen al descubrimiento y la caracterización de un sitio de terminación de replicación RTS1 específico del sitio, un sitio de pausa de replicación específico del sitio MPS1 y un tipo novedoso de impronta cromosómica, que marca una de las cromátidas hermanas en el apareamiento. -tipo locus mat1. Además, el trabajo en la región donante silenciada ha llevado a grandes avances en la comprensión de la formación y el mantenimiento de la heterocromatina.

Respuestas al daño del ADN

Schizosaccharomyces pombe es un microorganismo sexual facultativo que puede aparearse cuando los nutrientes son limitantes. Exposición de S. pombe al peróxido de hidrógeno, un agente que causa estrés oxidativo que conduce al daño oxidativo del ADN, induce fuertemente el apareamiento y la formación de esporas meióticas. Este hallazgo sugiere que la meiosis, y en particular la recombinación meiótica, puede ser una adaptación para reparar el daño del ADN. Apoyando este punto de vista está el hallazgo de que las lesiones de una sola base del tipo dU:dG en el ADN de S. pombe estimulan la recombinación meiótica. Esta recombinación requiere uracilo-ADN glicosilasa, una enzima que elimina el uracilo del esqueleto del ADN e inicia la reparación por escisión de bases. Sobre la base de este hallazgo, se propuso que la reparación por escisión de base de una base de uracilo, un sitio abásico o una muesca de una sola hebra es suficiente para iniciar la recombinación en S. pombe. Otros experimentos con S. pombe indicó que el procesamiento defectuoso de los intermedios de replicación del ADN, es decir, los fragmentos de Okazaki, provoca daños en el ADN, como muescas o huecos en una sola hebra, y que estos estimulan la recombinación meiótica.

Como sistema modelo

La levadura de fisión se ha convertido en un sistema modelo notable para estudiar los principios básicos de una célula que se puede utilizar para comprender organismos más complejos como los mamíferos y, en particular, los humanos. Este eucariota unicelular no es patógeno y se cultiva y manipula fácilmente en el laboratorio. La levadura de fisión contiene uno de los números más pequeños de genes de una secuencia genómica conocida para un eucariota, y tiene solo tres cromosomas en su genoma. Muchos de los genes responsables de la división celular y la organización celular en las células de levadura de fisión también se encuentran en el genoma humano. La regulación y división del ciclo celular son cruciales para el crecimiento y desarrollo de cualquier célula. Los genes conservados de la levadura de fisión se han estudiado intensamente y son la razón de muchos desarrollos biomédicos recientes. La levadura de fisión también es un sistema modelo práctico para observar la división celular porque las levaduras de fisión son eucariotas unicelulares de forma cilíndrica que se dividen y reproducen por fisión media. Esto se puede ver fácilmente usando microscopía. La levadura de fisión también tiene un tiempo de generación extremadamente corto, de 2 a 4 horas, lo que también la convierte en un sistema modelo fácil de observar y cultivar en el laboratorio. La levadura de fisión está haciendo muchas contribuciones a la investigación en biomedicina y biología celular, y es un sistema modelo para el análisis genético.

Genoma

Schizosaccharomyces pombe se usa a menudo para estudiar la división y el crecimiento celular debido a las regiones genómicas conservadas que también se observan en humanos, incluidas: proteínas de heterocromatina, grandes orígenes de replicación, centrómeros grandes, puntos de control celulares conservados, función de los telómeros, empalme de genes y muchos otros procesos celulares. S. El genoma de pombe' se secuenció por completo en 2002, el sexto genoma eucariótico que se secuenció como parte de el Proyecto Genoma. Se estima que se descubrieron 4.979 genes dentro de tres cromosomas que contenían alrededor de 14 Mb de ADN. Este ADN está contenido dentro de 3 cromosomas diferentes en el núcleo con espacios en las regiones centroméricas (40 kb) y teloméricas (260 kb). Después de la secuenciación inicial del genoma de la levadura de fisión, se han secuenciado otras regiones de los genes no secuenciadas previamente. El análisis estructural y funcional de estas regiones de genes se puede encontrar en bases de datos de levadura de fisión a gran escala como PomBase.

Se descubrió que el cuarenta y tres por ciento de los genes del Proyecto Genoma contenían intrones en 4.739 genes. La levadura de fisión no tiene tantos genes duplicados en comparación con la levadura en ciernes, solo contiene un 5 %, lo que convierte a la levadura de fisión en un gran modelo de genoma para observar y brinda a los investigadores la capacidad de crear enfoques de investigación más funcionales. S. pombe's tener una gran cantidad de intrones brinda oportunidades para aumentar el rango de tipos de proteínas producidos de empalmes alternativos y genes que codifican genes comparables en humanos. Se ha secuenciado el 81% de los tres centrómeros de la levadura de fisión. Se encontró que las longitudes de los tres centrómeros eran 34, 65 y 110 kb. Esto es de 300 a 100 veces más largo que los centrómeros de la levadura en ciernes. También se observa un nivel extremadamente alto de conservación (97 %) en la región de 1780 pb en las regiones DGS del centrómero. Esta elongación de los centrómeros y sus secuencias conservativas hace que la levadura de fisión sea un sistema modelo práctico para observar la división celular y en humanos debido a su similitud.

PomBase informa que más del 69 % de los genes que codifican proteínas tienen ortólogos humanos y más de 500 de ellos están asociados con enfermedades humanas. Esto hace que S. pombe un gran sistema para estudiar genes humanos y vías de enfermedades, especialmente el ciclo celular y los sistemas de puntos de control de ADN.

Diversidad genética

El estudio de la biodiversidad y la evolución de la levadura de fisión se llevó a cabo en 161 cepas de Schizosaccharomyces pombe recolectadas en 20 países. El modelado de la tasa evolutiva mostró que todas las cepas derivan de un ancestro común que ha vivido desde hace unos 2300 años. El estudio también identificó un conjunto de 57 cepas de levadura de fisión que diferían cada una en ≥1900 SNP; y todas detectaron 57 cepas de levadura de fisión que eran prototróficas (capaces de crecer en el mismo medio mínimo que la cepa de referencia). Varios estudios sobre el genoma de S.pombe respaldan la idea de que la diversidad genética de las cepas de levadura de fisión es ligeramente menor que la de la levadura en ciernes. De hecho, solo se producen variaciones limitadas de S.pombe en la proliferación en diferentes entornos. Además, la cantidad de variación fenotípica que se segrega en la levadura de fisión es menor que la observada en S. cerevisiae. Dado que la mayoría de las cepas de levadura de fisión se aislaron de bebidas elaboradas, no existe un contexto ecológico o histórico para esta dispersión.

Análisis del ciclo celular

Muchos investigadores han estudiado cada vez más la replicación del ADN en la levadura. Una mayor comprensión de la replicación del ADN, la expresión génica y los mecanismos conservados en la levadura puede proporcionar a los investigadores información sobre cómo funcionan estos sistemas en las células de mamíferos en general y en las células humanas en particular. También se observan otras etapas, como el crecimiento celular y el envejecimiento, en la levadura para comprender estos mecanismos en sistemas más complejos.

S. pombe las células en fase estacionaria experimentan un envejecimiento cronológico debido a la producción de especies reactivas de oxígeno que causan daños en el ADN. La mayoría de estos daños normalmente pueden repararse mediante la reparación por escisión de bases de ADN y la reparación por escisión de nucleótidos. Los defectos en estos procesos de reparación conducen a una supervivencia reducida.

La citocinesis es uno de los componentes de la división celular que a menudo se observa en la levadura de fisión. Los componentes bien conservados de la citocinesis se observan en la levadura de fisión y nos permiten observar varios escenarios genómicos y detectar mutaciones. La citocinesis es un paso permanente y muy crucial para el bienestar de la célula. La formación de anillos contráctiles en particular es muy estudiada por investigadores que utilizan S. pombe como sistema modelo. El anillo contráctil está muy conservado tanto en la levadura de fisión como en la citocinesis humana. Las mutaciones en la citocinesis pueden dar lugar a muchas disfunciones de la célula, incluida la muerte celular y el desarrollo de células cancerosas. Este es un proceso complejo en la división celular humana, pero en S. pombe los experimentos más simples pueden arrojar resultados que luego se pueden aplicar para la investigación en sistemas modelo de orden superior, como los humanos.

Una de las precauciones de seguridad que toma la célula para garantizar que se produzca una división celular precisa es el punto de control del ciclo celular. Estos puntos de control aseguran que se elimine cualquier mutágeno. Esto se hace a menudo mediante señales de retransmisión que estimulan la ubiquitinación de los objetivos y retrasan la citocinesis. Sin puntos de control mitóticos como estos, los mutágenos se crean y replican, lo que da como resultado multitud de problemas celulares, incluida la muerte celular o la tumorigénesis que se observa en las células cancerosas. Paul Nurse, Leland Hartwell y Tim Hunt recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2001. Descubrieron puntos de control conservados clave que son cruciales para que una célula se divida correctamente. Estos hallazgos se han relacionado con el cáncer y las células enfermas y son un hallazgo notable para la biomedicina.

Los investigadores que utilizan la levadura de fisión como sistema modelo también analizan la dinámica y las respuestas de los orgánulos y las posibles correlaciones entre las células de levadura y las células de mamífero. Las enfermedades de las mitocondrias y varios sistemas de orgánulos, como el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico, se pueden comprender mejor al observar la dinámica cromosómica de la levadura de fisión y los niveles y la regulación de la expresión de proteínas.

Herramienta biomédica

Sin embargo, existen limitaciones con el uso de levadura de fisión como sistema modelo: su resistencia a múltiples fármacos. "La respuesta MDR implica la sobreexpresión de dos tipos de bombas de salida de fármacos, la familia de cassettes de unión a ATP (ABC)... y la superfamilia de facilitadores principales". Paul Nurse y algunos de sus colegas crearon recientemente S. pombe cepas sensibles a los inhibidores químicos y sondas comunes para ver si es posible utilizar la levadura de fisión como un sistema modelo de investigación de fármacos químicos.

Por ejemplo, la doxorrubicina, un antibiótico quimioterapéutico muy común, tiene muchos efectos secundarios adversos. Los investigadores están buscando formas de comprender mejor cómo funciona la doxorrubicina mediante la observación de los genes vinculados a la resistencia mediante el uso de levadura de fisión como sistema modelo. Se observaron vínculos entre los efectos secundarios adversos de la doxorrubicina y el metabolismo cromosómico y el transporte de membrana. Los modelos metabólicos para el direccionamiento de fármacos ahora se están utilizando en biotecnología, y se esperan más avances en el futuro utilizando el sistema de modelo de levadura de fisión.

Enfoques experimentales

La levadura de fisión es fácilmente accesible, fácil de cultivar y manipular para hacer mutantes y se puede mantener en un estado haploide o diploide. S. pombe es normalmente una célula haploide pero, cuando se la somete a condiciones estresantes, generalmente deficiencia de nitrógeno, dos células se conjugarán para formar un diploide que luego formará cuatro esporas dentro de una tétrada asca. Este proceso es fácilmente visible y observable bajo cualquier microscopio y nos permite observar la meiosis en un sistema modelo más simple para ver cómo opera este fenómeno.

Por lo tanto, prácticamente cualquier experimento o técnica genética puede aplicarse a este sistema modelo, como: disección de tétradas, análisis de mutágenos, transformaciones y técnicas de microscopía como FRAP y FRET. También se están utilizando nuevos modelos, como Tug-Of-War (gTOW), para analizar la robustez de la levadura y observar la expresión génica. Hacer genes knock-in y knock-out es bastante fácil y con la secuenciación del genoma de la levadura de fisión, esta tarea es muy accesible y bien conocida.