Ribozima

Estructura 3D de una costilla de martillo

ribozimas (riboenzimas de ácido nucleico) son moléculas de ARN que tienen la capacidad de catalizar reacciones bioquímicas específicas, incluido el empalme del ARN en expresión génica, similar a la acción de las enzimas proteicas. El descubrimiento de las ribozimas en 1982 demostró que el ARN puede ser tanto material genético (como el ADN) como un catalizador biológico (como las enzimas proteicas), y contribuyó a la hipótesis del mundo del ARN, que sugiere que el ARN puede haber sido importante en la evolución de la autodeterminación prebiótica. sistemas replicantes.

Las actividades más comunes de las ribozimas naturales o in vitro son la división (o ligadura) de ARN y ADN y la formación de enlaces peptídicos. Por ejemplo, la ribozima más pequeña conocida (GUGGC-3') puede aminoacilar una GCCU-3' secuencia en presencia de PheAMP. Dentro del ribosoma, las ribozimas funcionan como parte de la subunidad grande del ARN ribosómico para unir aminoácidos durante la síntesis de proteínas. También participan en una variedad de reacciones de procesamiento de ARN, incluido el empalme de ARN, la replicación viral y la biosíntesis de ARN de transferencia. Los ejemplos de ribozimas incluyen la ribozima de cabeza de martillo, la ribozima VS, la ribozima de plomo y la ribozima de horquilla.

Los investigadores que investigan los orígenes de la vida a través de la hipótesis del mundo del ARN han estado trabajando en el descubrimiento de una ribozima con capacidad de autorreplicación, lo que requeriría que tuviera la capacidad de sintetizar catalíticamente polímeros de ARN. Esto debería poder suceder en condiciones prebióticamente plausibles con altas tasas de precisión de copia para evitar la degradación de la información, pero también permitir la aparición de errores ocasionales durante el proceso de copia para permitir que continúe la evolución darwiniana.

Se han realizado intentos para desarrollar ribozimas como agentes terapéuticos, como enzimas que se dirigen a secuencias de ARN definidas para la escisión, como biosensores y para aplicaciones en genómica funcional y descubrimiento de genes.

Descubrimiento

Esquemática mostrando ribozyme cleavage de ARN

Antes del descubrimiento de las ribozimas, las enzimas, que se definen como proteínas catalíticas, eran los únicos catalizadores biológicos conocidos. En 1967, Carl Woese, Francis Crick y Leslie Orgel fueron los primeros en sugerir que el ARN podría actuar como catalizador. Esta idea se basó en el descubrimiento de que el ARN puede formar estructuras secundarias complejas. Estas ribozimas se encontraron en el intrón de una transcripción de ARN, que se eliminó a sí misma de la transcripción, así como en el componente de ARN del complejo RNasa P, que está involucrado en la maduración de los pre-ARNt. En 1989, Thomas R. Cech y Sidney Altman compartieron el Premio Nobel de química por su "descubrimiento de las propiedades catalíticas del ARN". El término ribozima fue introducido por primera vez por Kelly Kruger et al. en un artículo publicado en Cell en 1982.

Había sido una creencia firmemente establecida en biología que la catálisis estaba reservada para las proteínas. Sin embargo, la idea de la catálisis del ARN está motivada en parte por la vieja pregunta sobre el origen de la vida: ¿Qué viene primero, las enzimas que hacen el trabajo de la célula o los ácidos nucleicos que transportan la información necesaria para producir las enzimas? El concepto de "ácidos ribonucleicos como catalizadores" evita este problema. El ARN, en esencia, puede ser tanto el huevo como la gallina.

En la década de 1980, Thomas Cech, de la Universidad de Colorado Boulder, estaba estudiando la escisión de intrones en un gen de ARN ribosomal en Tetrahymena thermophila. Mientras intentaba purificar la enzima responsable de la reacción de empalme, descubrió que el intrón podía separarse en ausencia de cualquier extracto celular agregado. Por mucho que lo intentaron, Cech y sus colegas no pudieron identificar ninguna proteína asociada con la reacción de empalme. Después de mucho trabajo, Cech propuso que la porción de la secuencia del intrón del ARN podría romper y reformar los enlaces fosfodiéster. Casi al mismo tiempo, Sidney Altman, profesor de la Universidad de Yale, estaba estudiando la forma en que se procesan las moléculas de ARNt en la célula cuando él y sus colegas aislaron una enzima llamada ARNasa-P, que es responsable de la conversión de un ARNt precursor en el ARNt activo. Para su sorpresa, descubrieron que la RNasa-P contenía ARN además de proteína y que el ARN era un componente esencial de la enzima activa. Esta era una idea tan extraña que tuvieron dificultades para publicar sus hallazgos. Al año siguiente, Altman demostró que el ARN puede actuar como catalizador al demostrar que la subunidad de ARN RNasa-P podría catalizar la escisión del precursor de ARNt en ARNt activo en ausencia de cualquier componente proteico.

Desde el descubrimiento de Cech y Altman, otros investigadores han descubierto otros ejemplos de moléculas de ARN catalítico o de ARN autoescindible. Muchas ribozimas tienen un centro activo en forma de horquilla o cabeza de martillo y una estructura secundaria única que les permite dividir otras moléculas de ARN en secuencias específicas. Ahora es posible fabricar ribozimas que escindirán específicamente cualquier molécula de ARN. Estos catalizadores de ARN pueden tener aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, se ha diseñado una ribozima para escindir el ARN del VIH. Si tal ribozima fuera producida por una célula, todas las partículas de virus entrantes tendrían su genoma de ARN cortado por la ribozima, lo que evitaría la infección.

Estructura y mecanismo

A pesar de tener solo cuatro opciones para cada unidad de monómero (nucleótidos), en comparación con las cadenas laterales de 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas, las ribozimas tienen diversas estructuras y mecanismos. En muchos casos, pueden imitar el mecanismo utilizado por sus contrapartes proteicas. Por ejemplo, en los ARN de ribozima autoescindibles, se lleva a cabo una reacción SN2 en línea utilizando el grupo hidroxilo 2' como nucleófilo que ataca al fosfato puente y hace que el oxígeno 5' de la base N+1 actúe como grupo saliente. En comparación, la RNasa A, una proteína que cataliza la misma reacción, utiliza una histidina y una lisina coordinadas para actuar como base para atacar el esqueleto de fosfato.

Al igual que muchas enzimas proteicas, la unión de metales también es fundamental para el funcionamiento de muchas ribozimas. A menudo, estas interacciones utilizan tanto el esqueleto de fosfato como la base del nucleótido, lo que provoca cambios conformacionales drásticos. Hay dos clases de mecanismos para la escisión de un esqueleto de fosfodiéster en presencia de metal. En el primer mecanismo, el grupo 2'-OH interno ataca el centro del fósforo en un mecanismo SN₂. Los iones metálicos promueven esta reacción coordinando primero el oxígeno del fosfato y luego estabilizando el oxianión. El segundo mecanismo también sigue un desplazamiento SN₂, pero el nucleófilo proviene del agua o de los grupos hidroxilo exógenos en lugar del propio ARN. La ribozima más pequeña es UUU, que puede promover la escisión entre G y A del tetranucleótido GAAA a través del primer mecanismo en presencia de Mn²⁺. La razón por la que este trinucleótido (en lugar del tetrámero complementario) cataliza esta reacción puede deberse a que el emparejamiento UUU-AAA es el trinucleótido más débil y flexible entre las 64 conformaciones, que proporciona el sitio de unión para Mn²⁺.

La transferencia de fosforilo también se puede catalizar sin iones metálicos. Por ejemplo, la ribonucleasa A pancreática y las ribozimas del virus de la hepatitis delta (HDV) pueden catalizar la escisión del esqueleto de ARN mediante catálisis ácido-base sin iones metálicos. La ribozima en horquilla también puede catalizar la autoescisión del ARN sin iones metálicos, pero el mecanismo aún no está claro.

La ribozima también puede catalizar la formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos adyacentes al reducir la entropía de activación.

Imagen mostrando la diversidad de estructuras ribozyme. De izquierda a derecha: plomozyme, costilla de martillo, ribozyme torcido

Actividades

Un ribosoma es una máquina biológica que utiliza una ribozima para traducir el ARN en proteínas.

Aunque las ribozimas son bastante raras en la mayoría de las células, a veces sus funciones son esenciales para la vida. Por ejemplo, la parte funcional del ribosoma, la máquina biológica que traduce el ARN en proteínas, es fundamentalmente una ribozima, compuesta por motivos estructurales terciarios de ARN que a menudo se coordinan con iones metálicos como Mg²⁺ como cofactores. En un sistema modelo, no se requieren cationes divalentes en un ARN de cinco nucleótidos que cataliza la trans-fenilalanación de un sustrato de cuatro nucleótidos con 3 pares de bases complementarios con el catalizador, donde el catalizador/sustrato fueron ideado por truncamiento de la ribozima C3.

Las ribozimas mejor estudiadas son probablemente aquellas que se cortan a sí mismas oa otros ARN, como en el descubrimiento original de Cech y Altman. Sin embargo, las ribozimas se pueden diseñar para catalizar una variedad de reacciones, muchas de las cuales pueden ocurrir en la vida pero no se han descubierto en las células.

El ARN puede catalizar el plegamiento de la conformación proteica patológica de un prión de manera similar a la de una chaperonina.

Ribozimas y el origen de la vida

El ARN también puede actuar como una molécula hereditaria, lo que animó a Walter Gilbert a proponer que en el pasado distante, la célula usaba el ARN como material genético y como molécula estructural y catalítica en lugar de dividir estas funciones entre el ADN y la proteína como lo hacían. son hoy; esta hipótesis se conoce como la "hipótesis del mundo de ARN" del origen de la vida. Dado que los nucleótidos y el ARN (y, por lo tanto, las ribozimas) pueden surgir de sustancias químicas inorgánicas, son candidatos para las primeras enzimas y, de hecho, los primeros "replicadores" (es decir, macromoléculas que contienen información que se replican a sí mismas). En 2002 se describió un ejemplo de una ribozima autorreplicante que liga dos sustratos para generar una copia exacta de sí misma. El descubrimiento de la actividad catalítica del ARN resolvió el 'huevo y la gallina'. paradoja del origen de la vida, resolviendo el problema del origen del dogma central de péptidos y ácidos nucleicos. Según este escenario, en el origen de la vida, toda la actividad enzimática y la codificación de la información genética la realizaba una molécula: el ARN.

En el laboratorio se han producido ribozimas que son capaces de catalizar la síntesis de otras moléculas de ARN a partir de monómeros activados en condiciones muy específicas, siendo estas moléculas conocidas como ribozimas de ARN polimerasa. La primera ribozima de ARN polimerasa se informó en 1996 y era capaz de sintetizar polímeros de ARN de hasta 6 nucleótidos de longitud. La mutagénesis y la selección se han realizado en una ribozima de ARN ligasa de un gran grupo de secuencias de ARN aleatorias, lo que ha dado como resultado el aislamiento de la 'Round-18' mejorada. ribozima polimerasa en 2001, que podría catalizar polímeros de ARN que ahora tienen hasta 14 nucleótidos de longitud. Tras la aplicación de una selección adicional en la ribozima Round-18, se generó la ribozima B6.61 y pudo agregar hasta 20 nucleótidos a una plantilla de cebador en 24 horas, hasta que se descompone por escisión de sus enlaces fosfodiéster.

La velocidad a la que las ribozimas pueden polimerizar una secuencia de ARN se multiplica sustancialmente cuando tiene lugar dentro de una micela.

La siguiente ribozima descubierta fue la "tC19Z" ribozima, que puede sumar hasta 95 nucleótidos con una fidelidad de 0,0083 mutaciones/nucleótido. A continuación, el "tC9Y" La ribozima fue descubierta por los investigadores y fue capaz de sintetizar cadenas de ARN de hasta 206 nucleótidos de largo en las condiciones de la fase eutéctica a temperatura bajo cero, condiciones que previamente se demostró que promueven la actividad de la ribozima polimerasa.

La ribozima de ARN polimerasa (RPR) llamada tC9-4M fue capaz de polimerizar cadenas de ARN más largas que ella misma (es decir, más de 177 nt) en concentraciones de iones de magnesio cercanas a los niveles fisiológicos, mientras que las RPR anteriores requerían concentraciones prebióticamente inverosímiles de hasta 200 mM. El único factor requerido para lograr esto fue la presencia de un polímero de aminoácidos muy simple llamado decapéptido de lisina.

El RPR más complejo sintetizado en ese momento se llamó 24-3, que recientemente fue capaz de polimerizar las secuencias de una variedad sustancial de secuencias de nucleótidos y navegar a través de estructuras secundarias complejas de sustratos de ARN inaccesibles a las ribozimas anteriores. De hecho, este experimento fue el primero en utilizar una ribozima para sintetizar una molécula de ARNt. Comenzando con la ribozima 24-3, Tjhung et al. aplicó otras catorce rondas de selección para obtener una ribozima de ARN polimerasa por evolución in vitro denominada '38-6' que tiene un nivel de actividad sin precedentes en la copia de moléculas de ARN complejas. Sin embargo, esta ribozima no puede copiarse a sí misma y sus productos de ARN tienen una alta tasa de mutación. En un estudio posterior, los investigadores comenzaron con la ribozima 38-6 y aplicaron otras 14 rondas de selección para generar el '52-2' ribozima, que en comparación con 38-6, fue nuevamente muchas veces más activa y podría comenzar a generar niveles detectables y funcionales de la ligasa de clase I, aunque todavía estaba limitada en su fidelidad y funcionalidad en comparación con la copia de la misma plantilla por proteínas como como la ARN polimerasa T7.

Un RPR llamado t5(+1) agrega nucleótidos de triplete a la vez en lugar de solo un nucleótido a la vez. Este RPR heterodimérico puede navegar por estructuras secundarias inaccesibles para 24-3, incluidas las horquillas. En el conjunto inicial de variantes de ARN derivadas únicamente de un RPR previamente sintetizado conocido como Z RPR, surgieron dos secuencias por separado y evolucionaron para ser mutuamente dependientes entre sí. El ARN de tipo 1 evolucionó para ser catalíticamente inactivo, pero la formación de complejos con el ARN de tipo 5 aumentó su capacidad de polimerización y permitió interacciones intermoleculares con el sustrato de la plantilla de ARN, lo que eliminó la necesidad de unir la plantilla directamente a la secuencia de ARN del RPR, lo cual era una limitación. de estudios anteriores. No solo t5 (+1) no necesitaba atarse a la plantilla, sino que tampoco se necesitaba un cebador ya que t5 (+1) tenía la capacidad de polimerizar una plantilla tanto en 3 & # 39; → 5' y 5' 3 → 3' direcciones.

Una ribozima de ARN polimerasa altamente evolucionada pudo funcionar como una transcriptasa inversa, es decir, puede sintetizar una copia de ADN utilizando una plantilla de ARN. Se considera que tal actividad fue crucial para la transición de los genomas de ARN a ADN durante la historia temprana de la vida en la Tierra. La capacidad de transcripción inversa podría haber surgido como una función secundaria de una ribozima de polimerasa de ARN dependiente de ARN temprana.

Una secuencia de ARN que se pliega en una ribozima es capaz de invadir ARN duplicado, reorganizarse en un complejo de holopolimerasa abierto y luego buscar una secuencia promotora de ARN específica y, al reconocerla, reorganizarse nuevamente en una forma procesiva que polimeriza una hebra complementaria de la secuencia. Esta ribozima es capaz de extender el ARN duplicado hasta en 107 nucleótidos, y lo hace sin necesidad de unir la secuencia que se polimeriza.

Ribozimas artificiales

Desde el descubrimiento de las ribozimas que existen en los organismos vivos, ha habido interés en el estudio de nuevas ribozimas sintéticas hechas en el laboratorio. Por ejemplo, se han producido ARN autoescindibles producidos artificialmente con buena actividad enzimática. Tang y Breaker aislaron ARN autoescindibles mediante selección in vitro de ARN que se originaban a partir de ARN de secuencia aleatoria. Algunas de las ribozimas sintéticas que se produjeron tenían estructuras novedosas, mientras que otras eran similares a la ribozima de cabeza de martillo natural.

En 2015, investigadores de la Universidad Northwestern y la Universidad de Illinois Chicago diseñaron un ribosoma anclado que funciona casi tan bien como el componente celular auténtico que produce todas las proteínas y enzimas dentro de la célula. Llamado Ribosoma-T, o Ribo-T, el ribosoma artificial fue creado por Michael Jewett y Alexander Mankin. Las técnicas utilizadas para crear ribozimas artificiales involucran evolución dirigida. Este enfoque aprovecha la naturaleza dual del ARN como catalizador y polímero informativo, lo que facilita que un investigador produzca grandes poblaciones de catalizadores de ARN utilizando enzimas polimerasas. Las ribozimas se mutan mediante transcripción inversa con transcriptasa inversa en varios ADNc y se amplifican con PCR propensa a errores. Los parámetros de selección en estos experimentos a menudo difieren. Un enfoque para seleccionar una ribozima de ligasa implica el uso de etiquetas de biotina, que están unidas covalentemente al sustrato. Si una molécula posee la actividad de ligasa deseada, se puede usar una matriz de estreptavidina para recuperar las moléculas activas.

Lincoln y Joyce utilizaron la evolución in vitro para desarrollar ribozima ligasas capaces de autorreplicarse en aproximadamente una hora, mediante la unión de oligonucleótidos altamente complementarios presintetizados.

Aunque no son verdaderos catalizadores, la creación de riboconmutadores artificiales de autoescisión, denominados aptazimas, también ha sido un área activa de investigación. Los ribointerruptores son motivos de ARN reguladores que cambian su estructura en respuesta a un ligando de molécula pequeña para regular la traducción. Si bien hay muchos riboconmutadores naturales conocidos que se unen a una amplia gama de metabolitos y otras moléculas orgánicas pequeñas, solo se ha descrito una ribozima basada en un riboconmutador: glmS. Los primeros trabajos en la caracterización de los ribointerruptores de autoescisión se centraron en el uso de teofilina como ligando. En estos estudios, se forma una horquilla de ARN que bloquea el sitio de unión al ribosoma, inhibiendo así la traducción. En presencia del ligando, en estos casos teofilina, la región reguladora del ARN se escinde, lo que permite que el ribosoma se una y traduzca el gen objetivo. Gran parte de este trabajo de ingeniería de ARN se basó en un diseño racional y estructuras de ARN previamente determinadas en lugar de una evolución dirigida como en los ejemplos anteriores. Trabajos más recientes han ampliado los ligandos utilizados en los riboconmutadores de ribozima para incluir el pirofosfato de timina. La clasificación de células activada por fluorescencia también se ha utilizado para diseñar aptazimas.

Aplicaciones

Se han propuesto y desarrollado ribozimas para el tratamiento de enfermedades mediante terapia génica. Uno de los principales desafíos del uso de enzimas basadas en ARN como tratamiento es la corta vida media de las moléculas catalíticas de ARN en el cuerpo. Para combatir esto, la posición 2' de la ribosa se modifica para mejorar la estabilidad del ARN. Un área de la terapia génica con ribozima ha sido la inhibición de virus basados en ARN.

Se ha desarrollado un tipo de ribozima sintética dirigida contra el ARN del VIH llamada cortes de genes y ha entrado en pruebas clínicas para la infección por VIH.

Del mismo modo, las ribozimas se han diseñado para atacar el ARN del virus de la hepatitis C, el coronavirus del SARS (SARS-CoV), el adenovirus y el ARN del virus de la influenza A y B. La ribozima es capaz de escindir las regiones conservadas del genoma del virus, lo que se ha demostrado que reduce el virus en cultivos de células de mamíferos. A pesar de estos esfuerzos de los investigadores, estos proyectos se han mantenido en la etapa preclínica.

Ribozimas conocidas

Clases de ribozimas naturales bien validadas:

Notas y referencias