Recombinación específica del sitio
La recombinación específica de sitio, también conocida como recombinación específica de sitio conservativa, es un tipo de recombinación genética en la que se produce un intercambio de cadenas de ADN entre segmentos que poseen al menos un cierto grado de homología de secuencia. Las enzimas conocidas como recombinasas específicas de sitio (SSR) realizan reordenamientos de segmentos de ADN al reconocer y unirse a secuencias de ADN cortas y específicas (sitios), en las que escinden la estructura principal del ADN, intercambian las dos hélices de ADN involucradas y vuelven a unir las cadenas de ADN. En algunos casos, la presencia de una enzima recombinasa y los sitios de recombinación es suficiente para que se lleve a cabo la reacción; en otros sistemas se requieren varias proteínas accesorias y/o sitios accesorios. Muchas estrategias diferentes de modificación del genoma, entre ellas el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE), un enfoque avanzado para la introducción dirigida de unidades de transcripción en loci genómicos predeterminados, se basan en las SSR.
Los sistemas de recombinación sitio-específica son muy específicos, rápidos y eficientes, incluso cuando se trata de genomas eucariotas complejos. Se emplean de forma natural en una variedad de procesos celulares, incluida la replicación, diferenciación y patogénesis del genoma bacteriano, y el movimiento de elementos genéticos móviles. Por las mismas razones, presentan una base potencial para el desarrollo de herramientas de ingeniería genética.
Los sitios de recombinación tienen típicamente entre 30 y 200 nucleótidos de longitud y consisten en dos motivos con una simetría de repetición invertida parcial, a los que se une la recombinasa, y que flanquean una secuencia de cruce central en la que tiene lugar la recombinación. Los pares de sitios entre los que se produce la recombinación suelen ser idénticos, pero hay excepciones (p. ej. attP y attB de la λ integrasa).
Clasificación: tirosina- vs. serine- recombinases
Top: Vista tradicional incluyendo intercambio de hilos seguido de la filial-migración (relección impermeable). El mecanismo se produce en el marco de un complejo sináptico (1) incluyendo ambos sitios de ADN en orientación paralela. Si bien la filial-migración explica los requisitos específicos de homología y la reversibilidad del proceso de manera sencilla, no puede conciliarse con las subunidades recombinase de mociones tienen que someterse en tres dimensiones.
Tema: Vista actual. Dos cinturones simultáneos, cada uno dependiendo de la complementariedad de tres bases sucesivas en (o cerca) los bordes de la espaciadora de 8 bp (líneas envejecidas indican el ajuste de base). Las complicaciones didácticas surgen del hecho de que, en este modelo, el complejo sináptico debe acomodar ambos sustratos en una orientación antiparalela.
Este complejo sináptico (1) surge de la asociación de dos subunidades individuales recombinase ("protomers"; ovalados grises) con el sitio de destino respectivo. Su formación depende de contactos interprotómeros y doblación de ADN, que a su vez definen las subunidades (verde) con un papel activo durante la primera reacción cruzada. Ambas representaciones ilustran sólo la mitad del camino respectivo. Estas partes están separadas por un paso de unión/isomerización Holliday antes de que el producto (3) pueda ser liberado.
Contrariamente a Tyr-recombinases, las cuatro cadenas de ADN participantes se cortan en sincronía en puntos estancados por sólo 2 bp (saliendo poco espacio para la corrección de pruebas). La subunidad-rotación (180°) permite el intercambio de hilos mientras está covalentemente ligada a la proteína asociada. La exposición intermedia de las pausas de doble distancia conlleva riesgos de desencadenar una recombinación ilegítima y, por tanto, reacciones secundarias.
Aquí, el complejo sináptico surge de la asociación de dimers recombinase preformados con los respectivos sitios de destino (CTD/NTD, C-/N-terminal domain). Como para Tyr-recombinases, cada sitio contiene dos brazos, cada uno acomodando un protomer. A medida que ambos brazos se estructuran ligeramente de manera diferente, las subunidades se afinan conformacionalmente y se preparan para su función respectiva en el ciclo de recombinación. Contrariamente a los miembros de la clase Tyr, la ruta de recombinación convierte dos sitios de sustratos diferentes (attP y attB) a sitios-hibridos (attL y attR). Esto explica la naturaleza irreversible de esta vía de recombinación particular, que sólo puede superarse por "factores auxiliares de direccionalidad de la recombinación" (FRD).
Basándose en las homologías de secuencias de aminoácidos y en la relación mecanística, la mayoría de las recombinasas específicas de sitio se agrupan en una de dos familias: la familia de las recombinasas de tirosina (Tyr) o la familia de las recombinasas de serina (Ser). Los nombres se derivan del residuo de aminoácido nucleofílico conservado presente en cada clase de recombinasa que se utiliza para atacar el ADN y que se une covalentemente a él durante el intercambio de hebras. Los primeros miembros identificados de la familia de las recombinasas de serina se conocían como resolvasas o invertasas de ADN, mientras que el miembro fundador de las recombinasas de tirosina, la integrasa del fago lambda (que utiliza los sitios de reconocimiento attP/B), difiere de las enzimas ahora bien conocidas como Cre (del fago P1) y FLP (de la levadura Saccharomyces cerevisiae). Entre las recombinasas de serina más conocidas se encuentran enzimas como la resolvasa gamma-delta (del transposón Tn1000), la resolvasa Tn3 (del transposón Tn3) y la integrasa φC31 (del fago φC31). Existen varias clases de recombinasas de serina, que consisten en la recombinasa de serina pequeña, la resolvasa ISXc5, la transposasa de serina y la recombinasa de serina grande.
Aunque los miembros individuales de las dos familias de recombinasas pueden realizar reacciones con los mismos resultados prácticos, las familias no están relacionadas entre sí y tienen diferentes estructuras proteínicas y mecanismos de reacción. A diferencia de las recombinasas de tirosina, las recombinasas de serina son altamente modulares, como se insinuó por primera vez mediante estudios bioquímicos y se demostró más tarde mediante estructuras cristalográficas. El conocimiento de estas estructuras proteínicas podría resultar útil al intentar rediseñar las proteínas recombinasas como herramientas para la manipulación genética.
Mecanismo
La recombinación entre dos sitios de ADN comienza con el reconocimiento y la unión de estos sitios (un sitio en cada una de dos moléculas de ADN bicatenario separadas, o al menos dos segmentos distantes de la misma molécula) por la enzima recombinasa. A esto le sigue la sinapsis, es decir, la unión de los sitios para formar el complejo sináptico. Es dentro de este complejo sináptico donde tiene lugar el intercambio de hebras, ya que el ADN se corta y se vuelve a unir mediante reacciones de transesterificación controladas. Durante el intercambio de hebras, cada molécula de ADN bicatenario se corta en un punto fijo dentro de la región de cruce del sitio de reconocimiento, liberando un grupo hidroxilo desoxirribosa, mientras que la enzima recombinasa forma un enlace covalente transitorio con un fosfato de la cadena principal del ADN. Este enlace fosfodiéster entre el grupo hidroxilo del residuo nucleófilo de serina o tirosina conserva la energía que se gastó en la escisión del ADN. La energía almacenada en este enlace se utiliza posteriormente para unir nuevamente el ADN al grupo hidroxilo desoxirribosa correspondiente en la otra molécula de ADN. Por lo tanto, toda la reacción se lleva a cabo sin necesidad de cofactores externos ricos en energía, como el ATP.
Aunque la reacción química básica es la misma para las recombinasas de tirosina y serina, existen algunas diferencias entre ellas. Las recombinasas de tirosina, como Cre o FLP, cortan una hebra de ADN a la vez en puntos escalonados entre 6 y 8 pb, uniendo el extremo 3' de la hebra al grupo hidroxilo del nucleófilo de tirosina (Fig. 1). El intercambio de hebras se produce a través de un intermediario de hebras cruzadas análogo a la unión de Holliday en la que solo se ha intercambiado un par de hebras.
El mecanismo y el control de las recombinasas de serina son mucho menos conocidos. Este grupo de enzimas se descubrió recién a mediados de los años 1990 y aún es relativamente pequeño. Los miembros ahora clásicos, gamma-delta y resolvasa Tn3, pero también las nuevas incorporaciones como las integrasas φC31, Bxb1 y R4, cortan las cuatro cadenas de ADN simultáneamente en puntos escalonados por 2 pb (Fig. 2). Durante la escisión, se forma un enlace proteína-ADN a través de una reacción de transesterificación, en la que un enlace fosfodiéster se reemplaza por un enlace fosfoserina entre un fosfato 5' en el sitio de escisión y el grupo hidroxilo del residuo de serina conservado (S10 en la resolvasa).
Aún no está del todo claro cómo se produce el intercambio de cadenas después de que el ADN se ha escindido. Sin embargo, se ha demostrado que las cadenas se intercambian mientras están unidas covalentemente a la proteína, con una rotación neta resultante de 180°. El modelo más citado (pero no el único) que explica estos hechos es el "modelo de rotación de subunidades" (Fig. 2). Independientemente del modelo, los dúplex de ADN están situados fuera del complejo proteico y se necesita un gran movimiento de la proteína para lograr el intercambio de cadenas. En este caso, los sitios de recombinación son ligeramente asimétricos, lo que permite a la enzima distinguir los extremos izquierdo y derecho del sitio. Al generar productos, los extremos izquierdos siempre se unen a los extremos derechos de sus sitios asociados y viceversa. Esto hace que se reconstituyan diferentes sitios híbridos de recombinación en los productos de recombinación. La unión de extremos izquierdos con izquierdos o derechos con derechos se evita debido a la "superposición" asimétrica. secuencia entre los puntos escalonados de intercambio de la cadena superior e inferior, lo que contrasta marcadamente con el mecanismo empleado por las recombinasas de tirosina.
La reacción catalizada por la Cre-recombinasa, por ejemplo, puede conducir a la escisión del segmento de ADN flanqueado por los dos sitios (Fig. 3A), pero también puede conducir a la integración o inversión de la orientación del segmento de ADN flanqueado (Fig. 3B). El resultado de la reacción está determinado principalmente por las ubicaciones y orientaciones relativas de los sitios que se van a recombinar, pero también por la especificidad innata del sistema específico del sitio en cuestión. Las escisiones y las inversiones ocurren si la recombinación tiene lugar entre dos sitios que se encuentran en la misma molécula (recombinación intramolecular), y si los sitios están en la misma orientación (repetición directa) o en una orientación opuesta (repetición invertida), respectivamente. Las inserciones, por otro lado, tienen lugar si la recombinación ocurre en sitios que están situados en dos moléculas de ADN diferentes (recombinación intermolecular), siempre que al menos una de estas moléculas sea circular. La mayoría de los sistemas de sitios específicos son altamente especializados, catalizan solo uno de estos diferentes tipos de reacción y han evolucionado para ignorar los sitios que están en la orientación "incorrecta".
Véase también
- Cre recombinase
- Cre-Lox recombinación
- FLP-FRT recombinación
- Recobinación genética
- Recobinación homologosa
- Cambio de casete mediado por el ajuste
- Tecnología de recombinase específica del sitio
Referencias
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