Recombinación Cre-Lox

Cre-Lox Recombination es una tecnología de recombinasa específica del sitio, utilizada para llevar a cabo deleciones, inserciones, translocaciones e inversiones en sitios específicos en el ADN de las células. Permite que la modificación del ADN sea dirigida a un tipo de célula específico o se active por un estímulo externo específico. Se implementa tanto en sistemas eucariotas como procariotas. El sistema de recombinación CRE-LOX ha sido particularmente útil para ayudar a los neurocientíficos a estudiar el cerebro en el que los tipos de células complejas y los circuitos neuronales se unen para generar cognición y comportamientos. El plan de NIH para la investigación de neurociencia ha creado varios cientos de líneas de ratones de controlador CRE que actualmente utilizan la comunidad mundial de neurociencia.

Una aplicación importante del sistema CRE-LOX es la escisión de marcadores seleccionables en el reemplazo de genes. Las estrategias de reemplazo de genes comúnmente utilizados introducen marcadores seleccionables en el genoma para facilitar la selección de mutaciones genéticas que pueden causar retraso en el crecimiento. Sin embargo, la expresión del marcador puede tener efectos polares en la expresión de genes aguas arriba y aguas abajo. La eliminación de marcadores seleccionables del genoma por recombinación Cre-Lox es una forma elegante y eficiente de eludir este problema y, por lo tanto, se usa ampliamente en plantas, líneas celulares de ratón, levadura, etc.

El sistema consiste en una sola enzima, Cre Recombinasa, que recombina un par de secuencias objetivo cortas llamadas secuencias lox . Este sistema se puede implementar sin insertar proteínas o secuencias adicionales de soporte. La enzima cre y el sitio original lox llamado secuencia loxp se derivan del bacteriófago P1.

La colocación de secuencias de LOX permite que los genes se activen, repriman o intercambien por otros genes. A nivel de ADN se pueden llevar a cabo muchos tipos de manipulaciones. La actividad de la enzima CRE se puede controlar para que se exprese en un tipo de célula particular o se active por un estímulo externo como una señal química o un choque térmico. Estos cambios de ADN dirigidos son útiles en el rastreo de linaje celular y cuando los mutantes son letales si se expresan a nivel mundial.

El sistema CRE-LOX es muy similar en acción y en uso al sistema de recombinación FLP-FRT.

recombinación Cre-Lox es un tipo especial de recombinación específica del sitio desarrollada por el Dr. Brian Sauer y patentada por DuPont que operaba en células mitóticas y no mitóticas, y se usó inicialmente para activar la expresión génica en líneas celulares de mamíferos. Posteriormente, los investigadores en el laboratorio del Dr. Jamey Marth demostraron que la recombinación Cre-Lox podría usarse para eliminar las secuencias de ADN cromosómicas flanqueadas por LOXP a una alta eficiencia en las células T en desarrollo específicas de animales transgénicos, y los autores proponen que este enfoque pueda ser Utilizado para definir la función del gen endógeno en tipos de células específicas, marcar indeleble los progenitores en los estudios de determinación del destino celular, inducir reordenamientos cromosómicos específicos para el modelado biológico y de enfermedades, y determinar los roles de las lesiones genéticas tempranas en el mantenimiento de la enfermedad (y fenotipo).

Poco después, los investigadores en el laboratorio del Prof. Klaus Rajewsky informaron la producción de células madre embrionarias pluripotentes que llevan un gen de ADN polimerasa de flujo de LOXP dirigido (floxado). Combinando estos avances en la colaboración, los laboratorios de los Dres. Marth y Rajewsky informaron en 1994 que la recombinación Cre-Lox podría usarse para la orientación de genes condicionales. Observaron que ≈50% del gen beta de ADN polimerasa se eliminó en las células T en función de la transferencia de ADN. No estaba claro si solo un alelo en cada célula T o el 50% de las células T tenían una eliminación del 100% en ambos alelos. Desde entonces, los investigadores han informado mutagénesis de genes condicionados Cre-LOX más eficientes en las células T en desarrollo por el Laboratorio Marth en 1995. La deleción incompleta por la recombinasa CRE no es infrecuente en las células cuando existen dos copias de secuencias floxadas, y permite la formación y estudio de la quimeric de quimericlo tejidos. Se ha demostrado que todos los tipos de células probados en ratones se someten a recombinación transgénica Cre.

Independientemente, Joe Z. Tsien ha sido pionero en el uso del sistema CRE-Loxp para la manipulación de genes específicos de tipo celular y región en el cerebro adulto donde pueden existir cientos de tipos de neuronas distintas y casi todas las neuronas en el cerebro adulto se conocen para ser posmitótico. Tsien y sus colegas demostraron que la recombinación mediada por Cre puede ocurrir en las neuronas piramidales posmitóticas en la cerveza delantera del ratón adulto.

Estos desarrollos han llevado a un uso generalizado de la mutagénesis condicional en la investigación biomédica, que abarca muchas disciplinas en las que se convierte en una plataforma poderosa para determinar la función de genes en tipos de células específicas y en tiempos de desarrollo específicos. En particular, la clara demostración de su utilidad al definir con precisión la relación compleja entre las células/circuitos y los comportamientos específicos para la investigación del cerebro, ha promovido el NIH para iniciar el plan de NIH para los proyectos de ratones de conducción de la investigación de neurociencia a principios de 2000. Hasta la fecha, hasta la fecha, El plan de NIH para los proyectos de CRE de Neurocience Research CRE ha creado varios cientos de líneas de ratones de controlador CRE que actualmente utilizan la comunidad mundial de neurociencia.

recombinación Cre-Lox implica la orientación de una secuencia específica de ADN y empalmándola con la ayuda de una enzima llamada Cre Recombinasa. La recombinación Cre-Lox se usa comúnmente para eludir la letalidad embrionaria causada por la inactivación sistémica de muchos genes. A partir de febrero de 2019, la recombinación CRE -LOX es una herramienta poderosa y se usa en el modelado de animales transgénicos para vincular los genotipos a los fenotipos.

El sistema CRE-LOX se utiliza como una herramienta genética para controlar los eventos de recombinación específicos del sitio en el ADN genómico. Este sistema ha permitido a los investigadores manipular una variedad de organismos genéticamente modificados para controlar la expresión génica, eliminar las secuencias de ADN no deseadas y modificar la arquitectura cromosómica.

La proteína Cre es una recombinasa de ADN específica del sitio que puede catalizar la recombinación de ADN entre sitios específicos en una molécula de ADN. Estos sitios, conocidos como secuencias LOXP , contienen sitios de unión específicos para CRE que rodean una secuencia de núcleo direccional donde puede ocurrir recombinación.

Cuando las células que tienen sitios LOXP en su genoma expreso CRE, puede ocurrir un evento de recombinación entre los sitios loxp . Las proteínas CRE recombinasa se unen a la primera y las últimas 13 BP regiones de un sitio LOX que forman un dímero. Este dímero luego se une a un dímero en otro sitio LOX para formar un tetrámero. Los sitios LOX son direccionales y los dos sitios unidos por el tetrámero son paralelos de orientación. El ADN de doble cadena se corta en ambos sitios LOXP por la proteína Cre. Luego se reincorporan las hebras con la ADN ligasa en un proceso rápido y eficiente. El resultado de la recombinación depende de la orientación de los sitios LOXP . Para dos sitios LOX en el mismo brazo cromosómico, los sitios invertidos LOXP causarán una inversión del ADN intermedio, mientras que una repetición directa de los sitios LOXP causará un evento de deleción. Si LOXP se encuentran en diferentes cromosomas, es posible que los eventos de translocación sean catalizados por recombinación inducida por Cre. Se pueden unir dos plásmidos utilizando los sitios Variant Lox 71 y 66.

recombinasa Cre se puede sintetizar mediante el gen correspondiente bajo la dirección de los promotores específicos de la célula, incluidos los promotores bajo el control de la doxiciclina. Se puede lograr un nivel adicional de control utilizando su recombinasa Cre, diseñada para activarse de manera reversible en presencia del análogo de estrógeno 4-hidroxi tamoxifeno. Esto proporciona la ventaja de que la recombinasa CRE está activa por un corto tiempo. Esto evita que las acciones no específicas de la recombinasa CRE. La recombinasa CRE puede reconocer sitios crípticos en el genoma del huésped e inducir la recombinación no autorizada, dañando el ADN del huésped. Esta herramienta es adecuada para eliminar los genes de resistencia a los antibióticos, pero sobre todo permite que los knockouts condicionales que se pueden inducir en momentos específicos en el tipo de opción celular. Los modelos así obtenidos tienen más probabilidades de imitar la situación fisiológica.

La proteína Cre (codificada por el locus originalmente nombrada como " causa recombinación ", con " ciclación recombinasa " que se encuentra en algunas referencias) consta de 4 subunidades y dos dominios: el más grande dominio carboxilo (C-terminal) y dominio amino más pequeño (N-terminal). La proteína total tiene 343 aminoácidos. El dominio C es similar en estructura al dominio en la familia de enzimas integrasas aisladas del fago lambda. Este es también el sitio catalítico de la enzima.

loxp (locus de X-Over P1) es un sitio en el bacteriófago P1 que consta de 34 pb. El sitio incluye una secuencia asimétrica de 8 pb, variable, excepto las dos bases medias, entre dos conjuntos de secuencias simétricas de 13 pb. La secuencia exacta se da a continuación; ' N ' Indica bases que pueden variar, y las letras minúsculas indican bases que han sido mutadas del tipo salvaje. Las secuencias de 13 pb son palindrómicas, pero el espaciador de 8 pb no lo es, lo que le da a la secuencia LOXP una cierta dirección. Por lo general, los sitios LOXP vienen en pares para la manipulación genética. Si los dos sitios LOXP están en la misma orientación, la secuencia floxed (secuencia flanqueada por dos sitios LOXP) se extirma; Sin embargo, si los dos sitios LOXP están en la orientación opuesta, la secuencia floxed está invertida. Si existe una secuencia de donantes floxed, la secuencia del donante se puede cambiar con la secuencia original. Esta técnica se llama intercambio de cassette mediado por recombinasa y es una forma muy conveniente y que ahorra tiempo para la manipulación genética. La advertencia, sin embargo, es que la reacción de recombinación puede ocurrir al revés, lo que hace que el intercambio de cassette sea ineficiente. Además, la escisión de secuencia puede ocurrir en trans en lugar de un evento de intercambio de cassette cis cis . Los mutantes LOXP se crean para evitar estos problemas.

Durante la recombinación genética, se forma una unión de Holliday entre las dos cadenas de ADN y una rotura de doble cadena en una molécula de ADN deja expuesto un extremo 3'OH. Esta reacción se ve facilitada por la actividad endonucleasa de una enzima. Los extremos fosfato 5' suelen ser los sustratos para esta reacción, por lo que quedan regiones 3' extendidas. Este grupo 3' OH es muy inestable y la cadena en la que está presente debe encontrar su complemento. Dado que la recombinación homóloga se produce después de la replicación del ADN, hay dos cadenas de ADN disponibles y, por lo tanto, el grupo 3' OH debe aparearse con su complemento, y lo hace, con una cadena intacta en el otro dúplex. Ahora, se ha producido un punto de cruce, que es lo que se denomina intermediario de Holliday.

El extremo 3'OH se alarga (es decir, se añaden bases) con la ayuda de la ADN polimerasa. El apareamiento de cadenas opuestas es lo que constituye el evento de entrecruzamiento o recombinación, que es común a todos los organismos vivos, ya que el material genético de una cadena de un dúplex se ha apareado con una cadena de otro dúplex y ha sido alargado por la ADN polimerasa. La escisión posterior de los intermediarios de Holliday da como resultado la formación de ADN híbrido.

Esta nueva división o "resolvación" la realiza un grupo especial de enzimas llamadas Resolvasas. RuvC es solo una de estas Resolvasas que se han aislado en bacterias y levaduras.

Durante muchos años se creyó que cuando se formaba el intermediario de la unión de Holliday, el punto de ramificación de la unión (donde se cruzan las hebras) se ubicaba en el primer sitio de escisión. La migración del punto de ramificación al segundo sitio de escisión desencadenaría de algún modo la segunda mitad de la vía. Este modelo proporcionó una explicación conveniente para el estricto requisito de homología entre los sitios de recombinación, ya que la migración de la ramificación se detendría en un desajuste y no permitiría que se produjera el segundo intercambio de hebras. Sin embargo, en años más recientes, esta visión ha sido cuestionada y la mayoría de los modelos actuales para la recombinación de Int, Xer y Flp implican solo una migración de ramificación limitada (1–3 pares de bases del intermediario de Holliday), acoplada a un evento de isomerización que es responsable de cambiar la especificidad de escisión de la hebra.

La recombinación específica de sitio (SSR, por sus siglas en inglés) involucra sitios específicos para la acción catalizadora de enzimas especiales llamadas recombinasas. Cre, o recombinasa cíclica, es una de esas enzimas. La recombinación específica de sitio es, por lo tanto, la escisión y ligación mediada por enzimas de dos secuencias de desoxinucleótidos definidas.

Se han descrito varios sistemas conservados de recombinación en sitios específicos, tanto en organismos procariotas como eucariotas. En general, estos sistemas utilizan una o más proteínas y actúan sobre secuencias asimétricas de ADN únicas. Los productos del evento de recombinación dependen de la orientación relativa de estas secuencias asimétricas. Muchas otras proteínas, además de la recombinasa, participan en la regulación de la reacción. Durante la recombinación de ADN en sitios específicos, que produce la reorganización genética en procesos como la integración y escisión viral y la segregación cromosómica, estas enzimas recombinasas reconocen secuencias de ADN específicas y catalizan el intercambio recíproco de cadenas de ADN entre estos sitios.

La iniciación de la recombinación específica del sitio comienza con la unión de las proteínas de recombinación a sus respectivos objetivos de ADN. Una recombinasa independiente reconoce y se une a cada uno de los dos sitios de recombinación en dos moléculas de ADN diferentes o dentro de la misma cadena de ADN. En el sitio específico dado en el ADN, el grupo hidroxilo de la tirosina en la recombinasa ataca a un grupo fosfato en la cadena principal del ADN utilizando un mecanismo de transesterificación directa. Esta reacción une la proteína recombinasa al ADN a través de un enlace fosfotirosina. Esto conserva la energía del enlace fosfodiéster, lo que permite revertir la reacción sin la participación de un cofactor de alta energía.

La escisión en la otra hebra también provoca un enlace de fosfotirosina entre el ADN y la enzima. En ambos dúplex de ADN, la unión del grupo fosfato a los residuos de tirosina deja un grupo OH 3' libre en la cadena principal del ADN. De hecho, el complejo enzima-ADN es una etapa intermedia, a la que le sigue la ligación del grupo OH 3' de una hebra de ADN al grupo fosfato 5' de la otra hebra de ADN, que está unido covalentemente al residuo de tirosina; es decir, se rompe el enlace covalente entre el extremo 5' y el residuo de tirosina. Esta reacción sintetiza la unión de Holliday que se ha comentado anteriormente.

De esta manera, se unen las cadenas de ADN opuestas. La escisión y la unión posteriores hacen que las cadenas de ADN intercambien sus segmentos. Las interacciones proteína-proteína impulsan y dirigen el intercambio de cadenas. La energía no se ve comprometida, ya que el enlace proteína-ADN compensa la pérdida del enlace fosfodiéster, que se produjo durante la escisión.

La recombinación específica de sitio también es un proceso importante que adoptan los virus, como los bacteriófagos, para integrar su material genético en el huésped infectado. El virus, llamado profago en ese estado, logra esto mediante la integración y la escisión. Los puntos donde ocurren las reacciones de integración y escisión se denominan sitios de unión (att). Un sitio attP en el fago intercambia segmentos con un sitio attB en el ADN bacteriano. Por lo tanto, estos son específicos de sitio y ocurren solo en los respectivos sitios att. La clase de enzimas integrasa cataliza esta reacción particular.

Se ha demostrado que dos factores afectan la eficiencia de la escisión de Cre en el par lox. En primer lugar, la identidad de la secuencia de nucleótidos en la región espaciadora del sitio lox. Las variantes de lox modificadas genéticamente que difieren en la región espaciadora tienden a tener una eficiencia de recombinación variable pero generalmente menor en comparación con el loxP de tipo salvaje, presumiblemente a través de la afectación de la formación y resolución del intermediario de recombinación.

Otro factor es la longitud del ADN entre el par lox. Aumentar la longitud del ADN conduce a una disminución de la eficiencia de la recombinación Cre/lox, posiblemente a través de la regulación de la dinámica de la reacción. La ubicación genética de la secuencia floxada también afecta la eficiencia de la recombinación, probablemente al influir en la disponibilidad de ADN por parte de la recombinasa Cre. La elección del controlador Cre también es importante, ya que la baja expresión de la recombinasa Cre tiende a dar como resultado una recombinación no paralela. La recombinación no paralela es especialmente problemática en un escenario de mapeo del destino donde un evento de recombinación está diseñado para manipular el gen en estudio y el otro evento de recombinación es necesario para activar un gen reportero (que generalmente codifica una proteína fluorescente) para el rastreo del linaje celular. La falla en la activación simultánea de ambos eventos de recombinación confunde la interpretación de los resultados del mapeo del destino celular.

La activación inducible de Cre se logra utilizando la variante de CreER (receptor de estrógeno), que solo se activa después de la administración de tamoxifeno. Esto se realiza a través de la fusión de un dominio de unión de ligando mutado del receptor de estrógeno a la recombinasa Cre, lo que hace que Cre se active específicamente por tamoxifeno. En ausencia de tamoxifeno, CreER provocará el traslado de la recombinasa mutada al citoplasma. La proteína permanecerá en esta ubicación en su estado inactivado hasta que se administre tamoxifeno. Una vez que se introduce tamoxifeno, se metaboliza en 4-hidroxitamoxifeno, que luego se une al RE y da como resultado la translocación de CreER al núcleo, donde luego puede escindir los sitios lox. Es importante destacar que, a veces, los reporteros fluorescentes pueden activarse en ausencia de tamoxifeno, debido a la fuga de unas pocas moléculas de recombinasa Cre al núcleo que, en combinación con reporteros muy sensibles, da como resultado un marcaje celular no deseado. CreER(T2) fue desarrollado para minimizar la recombinación independiente del tamoxifeno y maximizar la sensibilidad al tamoxifeno.

Las células modifican su fenotipo en respuesta a numerosos estímulos ambientales y pueden perder la expresión de genes que normalmente se utilizan para marcar su identidad, lo que dificulta la investigación de la contribución de ciertos tipos de células a la enfermedad. Por lo tanto, los investigadores a menudo utilizan ratones transgénicos que expresan la recombinasa CreER^t2 inducida por la administración de tamoxifeno, bajo el control de un promotor de un gen que marca el tipo celular específico de interés, con un reportero proteico fluorescente dependiente de Cre. La recombinasa Cre está fusionada a una forma mutante del receptor de estrógeno, que se une al estrógeno sintético 4-hidroxitamoxifeno en lugar de su ligando natural 17β-estradiol. CreER(T2) reside dentro del citoplasma y solo puede translocarse al núcleo después de la administración de tamoxifeno, lo que permite un control temporal estricto de la recombinación. El casete de reportero fluorescente contendrá un promotor para permitir una alta expresión del reportero transgénico fluorescente (por ejemplo, un promotor CAG) y un casete de terminación flanqueado por loxP, asegurando que la expresión del transgén sea dependiente de la recombinasa Cre y de la secuencia del reportero. Tras la recombinación impulsada por Cre, se elimina el casete de terminación, lo que permite que los genes reporteros se expresen específicamente en células en las que la expresión de Cre está siendo impulsada por el promotor marcador específico de la célula. Dado que la eliminación del casete de terminación es permanente, los genes reporteros se expresan en toda la progenie producida por las células iniciales en las que alguna vez se activó el Cre. Este rastreo de linaje condicional ha demostrado ser extremadamente útil para identificar de manera eficiente y específica las células musculares lisas vasculares (VSMC) y las células derivadas de VSMC y se ha utilizado para probar los efectos sobre las VSMC y las células derivadas de VSMC in vivo.

El fago P1 es un fago templado que provoca un ciclo lisogénico o lítico cuando infecta una bacteria. En su estado lítico, una vez que su genoma viral se inyecta en la célula huésped, se producen proteínas virales, se ensamblan los viriones y la célula huésped se lisa para liberar los fagos, continuando el ciclo. En el ciclo lisogénico, el genoma del fago se replica con el resto del genoma bacteriano y se transmite a las células hijas en cada división celular posterior. Puede pasar al ciclo lítico mediante un evento posterior, como la radiación UV o la inanición.

Los fagos como el fago lambda utilizan sus recombinasas específicas para integrar su ADN en el genoma del huésped durante la lisogenia. El ADN del fago P1, por otro lado, existe como plásmido en el huésped. El sistema Cre-lox cumple varias funciones en el fago: circulariza el ADN del fago en un plásmido, separa los anillos plasmídicos interconectados para que se transmitan a ambas bacterias hijas por igual y puede ayudar a mantener el número de copias a través de un medio alternativo de replicación.

El ADN del fago P1, cuando se libera en el huésped desde el virión, se presenta en forma de una molécula de ADN bicatenario lineal. La enzima Cre se dirige a los sitios loxP en los extremos de esta molécula y cicla el genoma. Esto también puede ocurrir en ausencia del sistema lox de Cre con la ayuda de otras proteínas bacterianas y virales. El plásmido P1 es relativamente grande (≈90 Kbp) y, por lo tanto, existe en un número bajo de copias, generalmente una por célula. Si los dos plásmidos hijos se entrelazan, una de las células hijas del huésped perderá el plásmido. El sistema de recombinación Cre-lox evita estas situaciones desligando los anillos de ADN mediante la realización de dos eventos de recombinación (anillos enlazados -> anillo único fusionado -> dos anillos no enlazados). También se propone que la replicación en círculo rodante seguida de recombinación permitirá que el plásmido aumente su número de copias cuando ciertos reguladores (repA) sean limitantes.

Una estrategia clásica para generar variantes de deleción de genes se basa en la doble integración cruzada de vectores no replicantes en el genoma. Además, los sistemas de recombinación como Cre-lox se utilizan ampliamente, principalmente en eucariotas. Las propiedades versátiles de la recombinasa Cre la hacen ideal para su uso en muchas estrategias de ingeniería genética. Como tal, el sistema Cre lox se ha utilizado en una amplia variedad de eucariotas, incluidas las plantas.

Los investigadores han utilizado múltiples variantes de loxP, en particular lox2272 y loxN, con la combinación de diferentes acciones de Cre (transitorias o constitutivas) para crear un sistema llamado "Arco Iris Cerebral" que permite la coloración múltiple del cerebro de ratones con cuatro proteínas fluorescentes.

Otro informe que utiliza dos pares de variantes de lox, pero que regula la longitud del ADN en un par, da como resultado una activación genética estocástica con un nivel regulado de escasez.

• Introducción a la tecnología Cre-lox por el "Bolson Laboratory" Archivado 2009-10-09 en la máquina Wayback