Reacción en cadena de la polimerasa inversa

La Reacción en cadena de la polimerasa inversa (PCR inversa) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa que se utiliza para amplificar ADN con una sola secuencia conocida. Una limitación de la PCR convencional es que requiere cebadores complementarios a ambos extremos del ADN diana, pero este método permite llevar a cabo la PCR incluso si sólo hay disponible una secuencia a partir de la cual se pueden diseñar los cebadores.

La PCR inversa es especialmente útil para determinar las ubicaciones de los insertos. Por ejemplo, varios retrovirus y transposones se integran aleatoriamente en el ADN genómico. Para identificar los sitios donde han entrado, se utilizan los conocidos, "internos" Se pueden utilizar secuencias virales o de transposones para diseñar cebadores que amplifiquen una pequeña porción de la secuencia "externa" ADN genómico. Luego, el producto amplificado puede secuenciarse y compararse con bases de datos de ADN para localizar la secuencia que se ha alterado.

El método de PCR inversa implica una serie de digestiones de restricción y ligación, lo que da como resultado un fragmento en bucle que puede prepararse para la PCR a partir de una única sección de secuencia conocida. Luego, al igual que otros procesos de reacción en cadena de la polimerasa, el ADN es amplificado por la ADN polimerasa termoestable:

1. Se identifica una región objetivo con una sección interna de secuencia conocida y regiones de flanque desconocidas
2. El ADN genómico se digiere en fragmentos de unos pocos kilos por una enzima de restricción de baja frecuencia (6-8 base).
3. Bajo concentraciones bajas de ADN o condiciones de ligación rápidas, la autoligación se induce a dar un producto circular de ADN.
4. PCR se lleva a cabo como de costumbre con la plantilla circular, con imprimaciones complementarias a secciones de la secuencia interna conocida apuntando hacia fuera.

Finalmente, la secuencia del producto de PCR secuenciado se compara con bases de datos de secuencias. Se utiliza en caso de rastreo de cromosomas.