Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

A reacción en cadena de polimerasa en tiempo real ()PCR en tiempo realo qPCR cuando se utiliza cuantitativamente) es una técnica de laboratorio de biología molecular basada en la reacción de cadena de polimerasa (PCR). Monitoriza la amplificación de una molécula de ADN dirigida durante el PCR (es decir, en tiempo real), no en su extremo, como en el PCR convencional. PCR en tiempo real se puede utilizar cuantitativa y semi-cuantitativamente (es decir, arriba/bajo una cierta cantidad de moléculas de ADN).

Dos métodos comunes para la detección de productos de PCR en tiempo real son (1) tintes fluorescentes no específicos que se intercalan con cualquier ADN bicatenario y (2) sondas de ADN de secuencia específica que consisten en oligonucleótidos marcados con un indicador fluorescente, que permite la detección sólo después de la hibridación de la sonda con su secuencia complementaria.

Las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativos en tiempo real (MIQE) proponen que se utilice la abreviatura qPCR para la PCR cuantitativa en tiempo real y que RT-qPCR utilizarse para la transcripción inversa: qPCR. El acrónimo "RT-PCR" comúnmente denota reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa y no PCR en tiempo real, pero no todos los autores se adhieren a esta convención.

Fondo

Las células de todos los organismos regulan la expresión genética mediante el recambio de transcritos de genes (ARN monocatenario): la cantidad de un gen expresado en una célula se puede medir por el número de copias de un transcrito de ARN de ese gen presente en una muestra. Para detectar y cuantificar de forma sólida la expresión génica a partir de pequeñas cantidades de ARN, es necesaria la amplificación de la transcripción del gen. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método común para amplificar el ADN; para la PCR basada en ARN, la muestra de ARN primero se transcribe de forma inversa a ADN complementario (ADNc) con transcriptasa inversa.

Para amplificar pequeñas cantidades de ADN se utiliza la misma metodología que en la PCR convencional utilizando un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, desoxirribonucleótidos trifosfato, una solución tampón adecuada y una ADN polimerasa termoestable. A esta mezcla se añade una sustancia marcada con un fluoróforo en un ciclador térmico que contiene sensores para medir la fluorescencia del fluoróforo después de haber sido excitado a la longitud de onda requerida, lo que permite medir la tasa de generación para uno o más productos específicos. Esto permite medir la velocidad de generación del producto amplificado en cada ciclo de PCR. Los datos así generados pueden analizarse mediante software para calcular la expresión genética relativa (o el número de copias de ARNm) en varias muestras. La PCR cuantitativa también se puede aplicar a la detección y cuantificación de ADN en muestras para determinar la presencia y abundancia de una secuencia de ADN particular en estas muestras. Esta medición se realiza después de cada ciclo de amplificación, por lo que este método se denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata o simultánea).

La PCR cuantitativa y los microarrays de ADN son metodologías modernas para estudiar la expresión genética. Se utilizaron métodos más antiguos para medir la abundancia de ARNm: visualización diferencial, ensayo de protección de ARNasa y transferencia Northern. La transferencia Northern se utiliza a menudo para estimar el nivel de expresión de un gen visualizando la abundancia de su transcripción de ARNm en una muestra. En este método, el ARN purificado se separa mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfiere a una matriz sólida (como una membrana de nailon) y se sonda con una sonda de ADN o ARN específica que sea complementaria al gen de interés. Aunque esta técnica todavía se utiliza para evaluar la expresión genética, requiere cantidades relativamente grandes de ARN y sólo proporciona información cualitativa o semicuantitativa de los niveles de ARNm. Los errores de estimación que surgen de variaciones en el método de cuantificación pueden ser el resultado de la integridad del ADN, la eficiencia de la enzima y muchos otros factores. Por esta razón se han desarrollado varios sistemas de estandarización (a menudo llamados métodos de normalización). Algunos se han desarrollado para cuantificar la expresión genética total, pero los más comunes tienen como objetivo cuantificar el gen específico que se está estudiando en relación con otro gen llamado gen normalizador, que se selecciona por su nivel de expresión casi constante. Estos genes a menudo se seleccionan a partir de genes constitutivos, ya que sus funciones relacionadas con la supervivencia celular básica normalmente implican una expresión genética constitutiva. Esto permite a los investigadores informar una relación para la expresión de los genes de interés dividida por la expresión del normalizador seleccionado, permitiendo así la comparación del primero sin conocer realmente su nivel absoluto de expresión.

Los genes normalizadores más utilizados son aquellos que codifican las siguientes moléculas: tubulina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina y ARN ribosómico.

Principios básicos

La PCR en tiempo real se realiza en un termociclador con capacidad de iluminar cada muestra con un haz de luz de al menos una longitud de onda especificada y detectar la fluorescencia emitida por el fluoróforo excitado. El termociclador también puede calentar y enfriar rápidamente muestras, aprovechando así las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y la ADN polimerasa.

El proceso de PCR generalmente consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten entre 25 y 50 veces. Estos ciclos normalmente constan de tres etapas: la primera, a unos 95 °C, permite la separación de la doble cadena del ácido nucleico; el segundo, a una temperatura de alrededor de 50-60 °C, permite la unión de los cebadores con la plantilla de ADN; el tercero, entre 68 y 72 °C, facilita la polimerización realizada por la ADN polimerasa. Debido al pequeño tamaño de los fragmentos, el último paso suele omitirse en este tipo de PCR, ya que la enzima es capaz de replicar el amplicón de ADN durante el cambio entre la etapa de alineación y la etapa de desnaturalización. Además, en la PCR de cuatro pasos la fluorescencia se mide durante fases de temperatura cortas que duran sólo unos segundos en cada ciclo, con una temperatura de, por ejemplo, 80 °C, para reducir la señal provocada por la presencia de dímeros de cebador. cuando se utiliza un tinte no específico. Las temperaturas y los tiempos utilizados para cada ciclo dependen de una amplia variedad de parámetros, tales como: la enzima utilizada para sintetizar el ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP) en la reacción y la temperatura de enlace de los cebadores.

Clasificación química

La técnica de PCR en tiempo real se puede clasificar según la química utilizada para detectar el producto de PCR, fluorocromos específicos o no específicos.

Detección no específica: PCR en tiempo real con colorantes de unión al ADN de doble cadena como indicadores

Un tinte de unión al ADN se une a todo el ADN bicatenario (ds) en la PCR, aumentando el rendimiento cuántico de fluorescencia del tinte. Por tanto, un aumento del producto de ADN durante la PCR conduce a un aumento de la intensidad de fluorescencia medida en cada ciclo. Sin embargo, los tintes de ADNds como SYBR Green se unirán a todos los productos de PCR de ADNds, incluidos los productos de PCR no específicos (como el dímero de cebador). Esto puede potencialmente interferir o impedir la monitorización precisa de la secuencia objetivo prevista.

En la PCR en tiempo real con tintes de ADNds, la reacción se prepara como de costumbre, con la adición de tintes de ADNds fluorescentes. Luego, la reacción se ejecuta en un instrumento de PCR en tiempo real y, después de cada ciclo, se mide la intensidad de la fluorescencia con un detector; el tinte solo fluoresce cuando se une al dsDNA (es decir, al producto de la PCR). Este método tiene la ventaja de que sólo necesita un par de cebadores para realizar la amplificación, lo que mantiene bajos los costos; Se pueden monitorear múltiples secuencias objetivo en un tubo usando diferentes tipos de tintes.

Detección específica: método de sonda indicadora fluorescente

Las sondas informadoras fluorescentes detectan sólo el ADN que contiene la secuencia complementaria a la sonda; por lo tanto, el uso de la sonda indicadora aumenta significativamente la especificidad y permite realizar la técnica incluso en presencia de otro ADNbc. Utilizando etiquetas de diferentes colores, las sondas fluorescentes se pueden utilizar en ensayos múltiples para monitorear varias secuencias diana en el mismo tubo. La especificidad de las sondas indicadoras fluorescentes también evita la interferencia de las mediciones causada por los dímeros del cebador, que son posibles subproductos indeseables en la PCR. Sin embargo, las sondas indicadoras fluorescentes no previenen el efecto inhibidor de los dímeros del cebador, que pueden disminuir la acumulación de los productos deseados en la reacción.

El método se basa en una sonda basada en ADN con un indicador fluorescente en un extremo y un extintor de fluorescencia en el extremo opuesto de la sonda. La proximidad del informador al extintor impide la detección de su fluorescencia; rotura de la sonda por el 5' a 3' La actividad exonucleasa de la polimerasa Taq rompe la proximidad entre el informador y el extintor y, por lo tanto, permite una emisión ininterrumpida de fluorescencia, que puede detectarse después de la excitación con un láser. Por lo tanto, un aumento en el producto objetivo de la sonda indicadora en cada ciclo de PCR provoca un aumento proporcional de la fluorescencia debido a la ruptura de la sonda y la liberación del indicador.

1. El PCR se prepara como de costumbre (ver PCR), y se añade la sonda del reportero.
2. A medida que comienza la reacción, durante la etapa de aneación de la PCR tanto la sonda como las cepas anales al objetivo de ADN.
3. La polimerización de una nueva cadena de ADN se inicia de las cepas, y una vez que la polimerasa alcanza la sonda, su 5'-3'-exonucleasa degrada la sonda, separando físicamente al reportero fluorescente del quencher, lo que da lugar a un aumento de fluorescencia.
4. La fluorescencia se detecta y se mide en una máquina PCR en tiempo real, y su aumento geométrico correspondiente al aumento exponencial del producto se utiliza para determinar el ciclo de cuantificación (Cq) en cada reacción.

Análisis de temperatura de fusión

La PCR en tiempo real permite la identificación de fragmentos de ADN amplificados específicos mediante el análisis de su temperatura de fusión (también llamado valor T_m, de fusión ttemperatura). El método utilizado suele ser la PCR con colorantes de unión al ADN de doble cadena como indicadores y el colorante utilizado suele ser SYBR Green. La temperatura de fusión del ADN es específica del fragmento amplificado. Los resultados de esta técnica se obtienen comparando las curvas de disociación de las muestras de ADN analizadas.

A diferencia de la PCR convencional, este método evita el uso previo de técnicas de electroforesis para demostrar los resultados de todas las muestras. Esto se debe a que, a pesar de ser una técnica cinética, la PCR cuantitativa suele evaluarse en un punto final distinto. Por lo tanto, la técnica suele proporcionar resultados más rápidos y/o utiliza menos reactivos que la electroforesis. Si se requiere electroforesis posterior sólo será necesario analizar aquellas muestras que la PCR en tiempo real haya demostrado ser dudosas y/o ratificar los resultados de las muestras que hayan resultado positivas para un determinante específico.

Modelado

A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite monitorear el producto deseado en cualquier punto del proceso de amplificación midiendo la fluorescencia (en tiempo real, se mide su nivel por encima de un umbral determinado). Un método comúnmente empleado de cuantificación de ADN mediante PCR en tiempo real se basa en representar la fluorescencia frente al número de ciclos en una escala logarítmica. Se establece un umbral para la detección de fluorescencia basada en ADN de 3 a 5 veces la desviación estándar del ruido de la señal por encima del fondo. El número de ciclos en los que la fluorescencia supera el umbral se denomina ciclo umbral (C_t) o, según las directrices MIQE, ciclo de cuantificación (Cq).

Durante la fase de amplificación exponencial, la cantidad de plantilla de ADN objetivo (amplicón) se duplica en cada ciclo. Por ejemplo, una muestra de ADN cuya C_q precede a la de otra muestra en 3 ciclos contenía 2³ = 8 veces más plantilla. Sin embargo, la eficacia de la amplificación suele variar entre cebadores y moldes. Por lo tanto, la eficacia de una combinación cebador-plantilla se evalúa en un experimento de titulación con diluciones en serie de plantilla de ADN para crear una curva estándar del cambio en (Cq) con cada dilución. Luego se utiliza la pendiente de la regresión lineal para determinar la eficiencia de la amplificación, que es del 100% si una dilución de 1:2 da como resultado una diferencia (Cq) de 1. El método del umbral del ciclo hace varias suposiciones sobre el mecanismo de reacción y tiene una dependencia de datos de regiones de baja señal-ruido del perfil de amplificación que pueden introducir una variación sustancial durante el análisis de datos.

Para cuantificar la expresión genética, la (Cq) de un ARN o ADN del gen de interés se resta de la (Cq) de ARN/ADN de un gen constitutivo en la misma muestra para normalizar la variación en la cantidad y calidad. de ARN entre diferentes muestras. Este procedimiento de normalización se denomina comúnmente ΔC_t-método y permite comparar la expresión de un gen de interés entre diferentes muestras. Sin embargo, para dicha comparación, la expresión del gen de referencia normalizador debe ser muy similar en todas las muestras. Por lo tanto, elegir un gen de referencia que cumpla este criterio es de gran importancia y, a menudo, un desafío, porque sólo muy pocos genes muestran niveles iguales de expresión en una variedad de condiciones o tejidos diferentes. Aunque el análisis del umbral del ciclo está integrado con muchos sistemas de software comerciales, existen métodos más precisos y confiables para analizar los datos del perfil de amplificación que deben considerarse en los casos en que la reproducibilidad sea una preocupación.

También se han sugerido métodos de cuantificación de qPCR basados en mecanismos, que tienen la ventaja de que no requieren una curva estándar para la cuantificación. Se ha demostrado que métodos como MAK2 tienen un rendimiento cuantitativo igual o mejor que los métodos de curva estándar. Estos métodos basados en mecanismos utilizan el conocimiento sobre el proceso de amplificación de la polimerasa para generar estimaciones de la concentración de la muestra original. Una extensión de este enfoque incluye un modelo preciso de todo el perfil de reacción de PCR, que permite el uso de datos de alta relación señal-ruido y la capacidad de validar la calidad de los datos antes del análisis.

Según la investigación de Ruijter et al. MAK2 asume una eficiencia de amplificación constante durante la reacción de PCR. Sin embargo, el análisis teórico de la reacción en cadena de la polimerasa, de la que se derivó MAK2, ha revelado que la eficiencia de la amplificación no es constante durante toda la PCR. Si bien la cuantificación de MAK2 proporciona estimaciones confiables de la concentración objetivo de ADN en una muestra en condiciones normales de qPCR, MAK2 no cuantifica de manera confiable la concentración objetivo para ensayos de qPCR con competímetros.

Aplicaciones

Existen numerosas aplicaciones para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en el laboratorio. Se utiliza comúnmente tanto para diagnóstico como para investigación básica. Los usos de la técnica en la industria incluyen la cuantificación de la carga microbiana en alimentos o materia vegetal, la detección de OGM (organismos genéticamente modificados) y la cuantificación y genotipado de patógenos virales humanos.

Cuantificación de la expresión genética

La cuantificación de la expresión genética mediante métodos tradicionales de detección de ADN no es fiable. La detección de ARNm en una transferencia Northern o de productos de PCR en un gel o transferencia Southern no permite una cuantificación precisa. Por ejemplo, durante los 20 a 40 ciclos de una PCR típica, la cantidad de producto de ADN alcanza un nivel que no se correlaciona directamente con la cantidad de ADN objetivo en la PCR inicial.

La PCR en tiempo real se puede utilizar para cuantificar ácidos nucleicos mediante dos métodos comunes: cuantificación relativa y cuantificación absoluta. La cuantificación absoluta proporciona el número exacto de moléculas de ADN objetivo en comparación con los estándares de ADN mediante una curva de calibración. Por tanto, es fundamental que la PCR de la muestra y el estándar tengan la misma eficacia de amplificación. La cuantificación relativa se basa en genes de referencia internos para determinar las diferencias en la expresión del gen diana. La cuantificación se expresa como el cambio en los niveles de expresión del ARNm interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por transcripción inversa de ARNm). La cuantificación relativa es más fácil de realizar ya que no requiere una curva de calibración ya que la cantidad del gen estudiado se compara con la cantidad de un gen de referencia de control.

Como las unidades utilizadas para expresar los resultados de la cuantificación relativa no son importantes, los resultados se pueden comparar entre varias RTqPCR diferentes. El motivo para utilizar uno o más genes constitutivos es corregir variaciones no específicas, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN utilizado, que pueden afectar a la eficacia de la transcripción inversa y, por tanto, a la de todo el proceso de PCR. Sin embargo, el aspecto más crucial del proceso es que el gen de referencia debe ser estable.

La selección de estos genes de referencia se realizaba tradicionalmente en biología molecular mediante estudios cualitativos o semicuantitativos como el examen visual de geles de ARN, la densitometría de transferencia Northern o la PCR semicuantitativa (simuladores de PCR). Ahora, en la era del genoma, es posible realizar una estimación más detallada de muchos organismos utilizando tecnologías transcriptómicas. Sin embargo, las investigaciones han demostrado que la amplificación de la mayoría de los genes de referencia utilizados para cuantificar la expresión del ARNm varía según las condiciones experimentales. Por tanto, es necesario realizar un primer estudio metodológico estadísticamente sólido para seleccionar el gen de referencia más adecuado.

Se han desarrollado varios algoritmos estadísticos que pueden detectar qué gen o genes son más adecuados para su uso en determinadas condiciones. Aquellos como geNORM o BestKeeper pueden comparar pares o medias geométricas para una matriz de diferentes genes y tejidos de referencia.

Usos diagnósticos

La PCR cualitativa de diagnóstico se aplica para detectar rápidamente ácidos nucleicos que son diagnósticos de, por ejemplo, enfermedades infecciosas, cáncer y anomalías genéticas. La introducción de ensayos de PCR cualitativos en el laboratorio de microbiología clínica ha mejorado significativamente el diagnóstico de enfermedades infecciosas y se utiliza como herramienta para detectar enfermedades emergentes, como nuevas cepas de gripe y coronavirus, en pruebas de diagnóstico.

Usos microbiológicos

La PCR cuantitativa también la utilizan los microbiólogos que trabajan en los campos de la seguridad alimentaria, el deterioro y la fermentación de los alimentos y para la evaluación del riesgo microbiano de la calidad del agua (agua potable y recreativa) y en la protección de la salud pública.

La qPCR también se puede utilizar para amplificar marcadores taxonómicos o funcionales de genes en el ADN tomado de muestras ambientales. Los marcadores están representados por fragmentos genéticos de ADN o ADN complementario. Al amplificar un determinado elemento genético, se puede cuantificar la cantidad del elemento en la muestra antes de la amplificación. El uso de marcadores taxonómicos (genes ribosómicos) y qPCR puede ayudar a determinar la cantidad de microorganismos en una muestra y puede identificar diferentes familias, géneros o especies según la especificidad del marcador. El uso de marcadores funcionales (genes codificadores de proteínas) puede mostrar la expresión genética dentro de una comunidad, lo que puede revelar información sobre el medio ambiente.

Detección de fitopatógenos

La industria agrícola se esfuerza constantemente por producir propágulos o plántulas de plantas libres de patógenos para evitar pérdidas económicas y salvaguardar la salud. Se han desarrollado sistemas que permiten detectar pequeñas cantidades de ADN de Phytophthora ramorum, un oomiceto que mata robles y otras especies, mezclado con el ADN de la planta huésped. La discriminación entre el ADN del patógeno y el de la planta se basa en la amplificación de secuencias ITS, espaciadores situados en la zona de codificación del gen del ARN ribosómico, que son característicos de cada taxón. También se han desarrollado versiones de campo de esta técnica para identificar el mismo patógeno.

Detección de organismos genéticamente modificados

La qPCR mediante transcripción inversa (RT-qPCR) se puede utilizar para detectar OGM dada su sensibilidad y rango dinámico en la detección de ADN. Alternativas como el análisis de ADN o proteínas suelen ser menos sensibles. Se utilizan cebadores específicos que amplifican no el transgén sino el promotor, el terminador o incluso las secuencias intermedias utilizadas durante el proceso de ingeniería del vector. Como el proceso de creación de una planta transgénica normalmente conduce a la inserción de más de una copia del transgén, también se suele evaluar su cantidad. Esto se lleva a cabo a menudo mediante cuantificación relativa utilizando un gen de control de la especie tratada que sólo está presente como una copia única.

Cuantificación clínica y genotipado

Los virus pueden estar presentes en humanos debido a infección directa o coinfecciones, lo que dificulta el diagnóstico mediante técnicas clásicas y puede dar lugar a un pronóstico y tratamiento incorrectos. El uso de qPCR permite tanto la cuantificación como el genotipado (caracterización de la cepa, realizada mediante curvas de fusión) de un virus como el de la hepatitis B. El grado de infección, cuantificado como las copias del genoma viral por unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos; por ejemplo, la probabilidad de que el virus del herpes simple tipo 1 se reactive está relacionada con la cantidad de neuronas infectadas en los ganglios. Esta cuantificación se realiza con transcripción inversa o sin ella, como ocurre si el virus se integra en el genoma humano en algún momento de su ciclo, como ocurre en el caso del VPH (virus del papiloma humano), donde algunas de sus variantes se asociado con la aparición de cáncer de cuello uterino. La PCR en tiempo real también ha permitido la cuantificación del citomegalovirus humano (CMV), que se observa en pacientes inmunodeprimidos después de un trasplante de órgano sólido o de médula ósea.