Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa

RT-PCR

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) es una técnica de laboratorio que combina la transcripción inversa de ARN en ADN (en este contexto llamado ADN complementario o ADNc) y la amplificación de objetivos específicos de ADN utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utiliza principalmente para medir la cantidad de un ARN específico. Esto se logra monitoreando la reacción de amplificación usando fluorescencia, una técnica llamada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). La RT-PCR y la qPCR combinadas se utilizan habitualmente para el análisis de la expresión génica y la cuantificación del ARN viral en entornos clínicos y de investigación.

La estrecha asociación entre RT-PCR y qPCR ha llevado al uso metonímico del término qPCR para referirse a RT-PCR. Tal uso puede ser confuso, ya que la RT-PCR se puede usar sin qPCR, por ejemplo, para permitir la clonación molecular, la secuenciación o la detección simple de ARN. Por el contrario, la qPCR puede usarse sin RT-PCR, por ejemplo, para cuantificar el número de copias de una pieza específica de ADN.

Nomenclatura

La técnica combinada de RT-PCR y qPCR se ha descrito como RT-PCR cuantitativa o RT-PCR en tiempo real (a veces incluso llamada RT-PCR cuantitativa en tiempo real), se ha abreviado de diversas formas como qRT-PCR, RT- qPCR, RRT-PCR y rRT-PCR. Para evitar confusiones, las siguientes abreviaturas se utilizarán de forma coherente a lo largo de este artículo:

No todos los autores, especialmente los anteriores, usan esta convención y el lector debe tener cuidado al seguir enlaces. La RT-PCR se ha utilizado para indicar tanto la PCR en tiempo real (qPCR) como la PCR de transcripción inversa (RT-PCR).

Historia

Desde su introducción en 1977, el Northern blot se ha utilizado ampliamente para la cuantificación de ARN a pesar de sus deficiencias: (a) técnica que requiere mucho tiempo, (b) requiere una gran cantidad de ARN para la detección y (c) cuantitativamente inexacta en el baja abundancia de contenido de ARN. Sin embargo, desde que Kary Mullis inventó la PCR en 1983, la RT PCR ha desplazado a la transferencia Northern como método de elección para la detección y cuantificación de ARN.

RT-PCR se ha convertido en la tecnología de referencia para la detección y/o comparación de niveles de ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior a la PCR, (b) una amplia gama (>10⁷ veces) de la abundancia de ARN, y (c) proporciona información sobre datos tanto cualitativos como cuantitativos. Debido a su simplicidad, especificidad y sensibilidad, la RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones, desde experimentos tan simples como la cuantificación de células de levadura en el vino hasta usos más complejos como herramientas de diagnóstico para detectar agentes infecciosos como el virus de la gripe aviar y el SARS. -CoV-2.

Principios

En RT-PCR, la plantilla de ARN se convierte primero en un ADN complementario (ADNc) mediante una transcriptasa inversa (RT). A continuación, el ADNc se utiliza como molde para la amplificación exponencial mediante PCR. El uso de RT-PCR para la detección de transcritos de ARN ha revolucionado el estudio de la expresión génica de las siguientes maneras importantes:

• Hizo teóricamente posible detectar las transcripciones de prácticamente cualquier gen
• Amplificación de muestras habilitada y elimina la necesidad de abundante material inicial requerido al utilizar el análisis de blot norte
• Proporción de tolerancia para la degradación del ARN mientras el ARN que abarca la cartilla esté intacto

RT-PCR de un paso frente a RT-PCR de dos pasos

Un paso vs dos pasos RT-PCR

La cuantificación del ARNm mediante RT-PCR se puede lograr como una reacción de uno o dos pasos. La diferencia entre los dos enfoques radica en la cantidad de tubos utilizados al realizar el procedimiento. La reacción de dos pasos requiere que la reacción de transcriptasa inversa y la amplificación por PCR se realicen en tubos separados. La desventaja del enfoque de dos pasos es la susceptibilidad a la contaminación debido al manejo más frecuente de las muestras. Por otro lado, toda la reacción desde la síntesis de cDNA hasta la amplificación por PCR ocurre en un solo tubo en el enfoque de un solo paso. Se cree que el enfoque de un solo paso minimiza la variación experimental al contener todas las reacciones enzimáticas en un solo entorno. Elimina los pasos de pipetear el producto de ADNc, que requiere mucha mano de obra y es propenso a la contaminación, a la reacción de PCR. El uso adicional de polimerasas tolerantes a inhibidores, potenciadores de polimerasa con una condición optimizada de RT-PCR de un solo paso, respalda la transcripción inversa del ARN de muestras no purificadas o crudas, como sangre completa y suero. Sin embargo, las plantillas de ARN iniciales son propensas a la degradación en el enfoque de un solo paso, y no se recomienda el uso de este enfoque cuando se requieren ensayos repetidos de la misma muestra. Además, se informa que el enfoque de un paso es menos preciso en comparación con el enfoque de dos pasos. También es el método de análisis preferido cuando se utilizan tintes de unión al ADN como SYBR Green, ya que la eliminación de los dímeros de cebadores se puede lograr mediante un simple cambio en la temperatura de fusión. Sin embargo, el enfoque de un solo paso es una solución relativamente conveniente para la detección rápida de ARN diana directamente en la biodetección.

RT-PCR de punto final frente a RT-PCR en tiempo real

La cuantificación de los productos de RT-PCR se puede dividir en gran medida en dos categorías: de punto final y en tiempo real. Se prefiere el uso de la RT-PCR de punto final para medir los cambios en la expresión génica en un pequeño número de muestras, pero la RT-PCR en tiempo real se ha convertido en el método estándar de oro para validar los resultados cuantitativos obtenidos a partir de análisis de matrices o cambios en la expresión génica en un escala global.

RT-PCR de punto final

Los enfoques de medición de la RT-PCR de punto final requieren la detección de los niveles de expresión génica mediante el uso de tintes fluorescentes como el bromuro de etidio, el etiquetado P32 de los productos de la PCR mediante el uso de un fosforoimager o mediante el conteo de centelleo. La RT-PCR de punto final suele lograrse mediante tres métodos diferentes: relativo, competitivo y comparativo.

relativa RT-PCR

Las cuantificaciones relativas de RT-PCR implican la coamplificación de un control interno simultáneamente con el gen de interés. El control interno se utiliza para normalizar las muestras. Una vez normalizado, se puede hacer una comparación directa de las abundancias de transcripciones relativas en múltiples muestras de mRNA. Una precaución a tener en cuenta es que el control interno debe ser elegido para que no se vea afectado por el tratamiento experimental. El nivel de expresión debe ser constante en todas las muestras y con el mRNA de interés para que los resultados sean precisos y significativos. Debido a que la cuantificación de los resultados se analiza comparando el rango lineal del objetivo y la amplificación de control, es crucial tener en cuenta la concentración de moléculas de destino inicial y su tasa de amplificación antes de iniciar el análisis. Los resultados del análisis se expresan como los ratios de señal de gen a señal de control interno, que los valores pueden utilizarse para la comparación entre las muestras en la estimación de la expresión relativa de ARN objetivo.

Competitive RT-PCR

La técnica de RT-PCR competitiva se utiliza para la cuantificación absoluta. Implica el uso de un ARN sintético “competidor” que puede distinguirse del ARN objetivo por una pequeña diferencia de tamaño o secuencia. Es importante que el diseño del ARN sintético sea idéntico en secuencia pero ligeramente más corto que el ARN objetivo para obtener resultados precisos. Una vez diseñado y sintetizado, una cantidad conocida del RNA competidor se añade a muestras experimentales y se co-amplifica con el objetivo utilizando RT-PCR. Luego se produce una curva de concentración del ARN competidor y se utiliza para comparar las señales RT-PCR producidas a partir de las transcripciones endógenas para determinar la cantidad de objetivo presente en la muestra.

Comparative RT-PCR

El RT-PCR comparativo es similar al RT-PCR competitivo, ya que el ARN objetivo compite por reactivos de amplificación dentro de una sola reacción con un estándar interno de secuencia no relacionada. Una vez que la reacción está completa, los resultados se comparan con una curva estándar externa para determinar la concentración de ARN objetivo. En comparación con los métodos de cuantificación relativos y competitivos, se considera que la RT-PCR comparativa es el método más conveniente de utilizar ya que no requiere que el investigador realice un experimento piloto; en relación con la RT-PCR, el rango de amplificación exponencial del mRNA debe ser predeterminado y en la RT-PCR competitiva, un competidor sintético debe ser sintetizado.

RT-PCR en tiempo real

La aparición de nuevas técnicas de marcado de ADN fluorescente en los últimos años ha permitido el análisis y la detección de productos de PCR en tiempo real y, en consecuencia, ha llevado a la adopción generalizada de la RT-PCR en tiempo real para el análisis de la expresión génica.. La RT-PCR en tiempo real no solo es ahora el método de elección para la cuantificación de la expresión génica, sino que también es el método preferido para obtener resultados de análisis de matrices y expresiones génicas a escala global. Actualmente, hay cuatro sondas de ADN fluorescente diferentes disponibles para la detección de productos de PCR mediante RT-PCR en tiempo real: SYBR Green, TaqMan, balizas moleculares y sondas de escorpión. Todas estas sondas permiten la detección de productos de PCR generando una señal fluorescente. Mientras que el tinte SYBR Green emite su señal fluorescente simplemente al unirse al ADN de doble cadena en solución, las sondas TaqMan, las balizas moleculares, las balizas moleculares. y escorpiones' la generación de fluorescencia depende del acoplamiento de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) de la molécula de colorante y un resto extintor a los sustratos de oligonucleótidos.

SYBR Verde

Cuando el SYBR Green se une al ADN de doble tirada de los productos PCR, emitirá luz sobre la excitación. La intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que los productos PCR se acumulan. Esta técnica es fácil de usar ya que el diseño de sondas no es necesario dada la falta de especificidad de su unión. Sin embargo, dado que el tinte no discrimina el ADN de doble tirada de los productos de PCR y los de los primeros dímeros, la sobreestimación de la concentración de objetivo es un problema común. Cuando la cuantificación precisa es una necesidad absoluta, se debe realizar un nuevo ensayo para la validación de los resultados. Sin embargo, entre los métodos de detección de productos RT-PCR en tiempo real, SYBR Green es el más económico y fácil de usar.

Sondas de Taqman

Sondas de TaqMan

Las sondas TaqMan son oligonucleótidos que tienen una sonda fluorescente adjunta al final de 5' y un quencher al final de 3'. Durante la amplificación PCR, estas sondas se hibridizarán a las secuencias de objetivos ubicadas en el amplicon y como la polimerasa replica la plantilla con TaqMan encuadernado, también acumula la sonda fluorescente debido a la actividad de polimerasa 5'- nucleasa. Debido a que la estrecha proximidad entre la molécula de quench y la sonda fluorescente normalmente evita que se detecte fluorescencia a través de FRET, los resultados de desacoplamiento en el aumento de intensidad de fluorescencia proporcional al número de ciclos de escote de sonda. Aunque las sondas TaqMan bien diseñadas producen resultados RT-PCR exactos en tiempo real, es costoso y consume mucho tiempo para sintetizar cuando se deben hacer sondas separadas para cada objetivo de MRNA analizado. Además, esas sondas son sensibles a la luz y deben congelarse cuidadosamente como coacción para prevenir la degradación.

Sondas de faro molecular

Similar a las sondas TaqMan, las balizas moleculares también hacen uso de la detección FRET con sondas fluorescentes conectadas al extremo 5' y un quencher unido al extremo 3' de un sustrato de oligonucleótido. Sin embargo, mientras que las sondas fluorescentes de TaqMan se clean durante la amplificación, las sondas moleculares de beacon permanecen intactas y se rebinan a un nuevo objetivo durante cada ciclo de reacción. Cuando es libre en solución, la proximidad cercana de la sonda fluorescente y la molécula quencher evita la fluorescencia a través de FRET. Sin embargo, cuando las sondas moleculares de beacon hibridizan a un objetivo, el tinte fluorescente y el quencher están separados resultando en la emisión de luz sobre la excitación. Al igual que con las sondas TaqMan, las balizas moleculares son caras para sintetizar y requieren sondas separadas para cada objetivo de ARN.

Sondas escorpión

Las sondas escorpión, como los beacons moleculares, no serán fluorescentes activos en un estado inhibridizado, de nuevo, debido a la sonda fluorescente en el extremo 5' siendo apagado por la moiedad en el extremo 3 de un oligonucleótido. Con Escorpiones, sin embargo, el final de 3' también contiene secuencia que es complementaria al producto de extensión de la cartilla en el extremo 5'. Cuando la extensión Escorpión se une a su complemento en el amplicon, la estructura Escorpión se abre, previene FRET y permite medir la señal fluorescente.

Sondas multiplex

Las sondas TaqMan, los balizas moleculares y los escorpiones permiten la medición simultánea de los productos PCR en un solo tubo. Esto es posible porque cada uno de los diferentes tintes fluorescentes puede estar asociado con un espectro de emisión específico. No sólo el uso de sondas multiplex ahorra tiempo y esfuerzo sin comprometer la utilidad de prueba, su aplicación en amplias áreas de investigación como análisis de eliminación de genes, análisis de mutación y polimorfismo, análisis cuantitativo y detección de ARN, lo convierten en una técnica invaluable para laboratorios de mucha disciplina.

Dos estrategias se emplean comúnmente para cuantificar los resultados obtenidos por RT-PCR en tiempo real; el método de la curva estándar y el método del umbral comparativo.

Solicitud

La amplificación exponencial a través de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa proporciona una técnica muy sensible en la que se puede detectar un número muy bajo de copias de moléculas de ARN. La RT-PCR se usa ampliamente en el diagnóstico de enfermedades genéticas y, semicuantitativamente, en la determinación de la abundancia de diferentes moléculas de ARN específicas dentro de una célula o tejido como medida de la expresión génica.

Métodos de investigación

La RT-PCR se usa comúnmente en métodos de investigación para medir la expresión génica. Por ejemplo, Lin et al. utilizó qRT-PCR para medir la expresión de genes Gal en células de levadura. Primero, Lin et al. diseñó una mutación de una proteína sospechosa de participar en la regulación de los genes Gal. Se planteó la hipótesis de que esta mutación suprimía selectivamente la expresión de Gal. Para confirmar esto, los niveles de expresión génica de las células de levadura que contenían esta mutación se analizaron mediante qRT-PCR. Los investigadores pudieron determinar de manera concluyente que la mutación de esta proteína reguladora reducía la expresión de Gal. El análisis de transferencia Northern se utiliza para estudiar más a fondo la expresión génica del ARN.

Inserción de genes

La RT-PCR también puede ser muy útil en la inserción de genes eucariotas en procariotas. Debido a que la mayoría de los genes eucarióticos contienen intrones, que están presentes en el genoma pero no en el ARNm maduro, el ADNc generado a partir de una reacción de RT-PCR es la secuencia de ADN exacta (sin tener en cuenta la naturaleza propensa a errores de las transcriptasas inversas) que sería traducido directamente a proteína después de la transcripción. Cuando estos genes se expresan en células procarióticas en aras de la producción o purificación de proteínas, el ARN producido directamente a partir de la transcripción no necesita someterse a corte y empalme ya que la transcripción contiene solo exones. (Los procariotas, como E. coli, carecen del mecanismo de empalme de ARNm de los eucariotas).

Diagnóstico de enfermedades genéticas

La RT-PCR se puede usar para diagnosticar enfermedades genéticas como el síndrome de Lesch-Nyhan. Esta enfermedad genética es causada por un mal funcionamiento en el gen HPRT1, que clínicamente conduce a cálculos urinarios de ácido úrico fatales y síntomas similares a la gota.[6] El análisis de los niveles de expresión de ARNm de HPRT1 en una madre embarazada y un feto revelará si la madre es portadora y si es probable que el feto desarrolle el síndrome de Lesch-Nyhan.

Detección de cáncer

Los científicos están trabajando en formas de usar la RT-PCR en la detección del cáncer para ayudar a mejorar el pronóstico y monitorear la respuesta a la terapia. Las células tumorales circulantes producen transcripciones de ARNm únicas según el tipo de cáncer. El objetivo es determinar qué transcritos de ARNm sirven como los mejores biomarcadores para un tipo de célula cancerosa en particular y luego analizar sus niveles de expresión con RT-PCR.

La RT-PCR se usa comúnmente para estudiar los genomas de virus cuyos genomas están compuestos de ARN, como el Influenzavirus A, retrovirus como el VIH y el SARS-CoV-2.

Desafíos

A pesar de sus importantes ventajas, la RT-PCR no está exenta de inconvenientes. El crecimiento exponencial del ADN complementario transcrito de forma inversa (ADNc) durante los múltiples ciclos de PCR produce una cuantificación imprecisa del punto final debido a la dificultad para mantener la linealidad. Para proporcionar una detección y cuantificación precisas del contenido de ARN en una muestra, se desarrolló qRT-PCR utilizando una modificación basada en fluorescencia para monitorear los productos de amplificación durante cada ciclo de PCR. La extrema sensibilidad de la técnica puede ser un arma de doble filo, ya que incluso la más mínima contaminación de ADN puede conducir a resultados no deseados. Un método simple para la eliminación de resultados falsos positivos es incluir anclas o etiquetas en el 5' región de un cebador específico de gen. Además, la planificación y el diseño de estudios de cuantificación pueden ser técnicamente desafiantes debido a la existencia de numerosas fuentes de variación, incluida la concentración de plantilla y la eficiencia de amplificación. La adición de una cantidad conocida de ARN en una muestra, la adición de una serie de diluciones de ARN que generan una curva estándar y la adición de una muestra sin copia de plantilla (sin ADNc) se pueden usar como controles.

Protocolo

La RT-PCR se puede realizar mediante el protocolo RT-PCR de un paso o el protocolo RT-PCR de dos pasos.

RT-PCR de un solo paso

La RT-PCR de un solo paso somete los objetivos de ARNm (hasta 6 kb) a la transcripción inversa seguida de amplificación por PCR en un solo tubo de ensayo. Es importante tener en cuenta que el uso de ARN intacto de alta calidad y un cebador específico de secuencia producirán los mejores resultados.

Una vez que se selecciona un kit de RT-PCR de un solo paso con una mezcla de transcriptasa inversa, Taq ADN polimerasa y una polimerasa correctora y se obtienen todos los materiales y equipos necesarios, se debe preparar una mezcla de reacción. La mezcla de reacción incluye dNTP, cebadores, plantilla de ARN, las enzimas necesarias y una solución tampón. La mezcla de reacción se agrega a un tubo de PCR para cada reacción, seguida del ARN molde. Luego, los tubos de PCR se colocan en un termociclador para comenzar el ciclo. En el primer ciclo, se produce la síntesis de ADNc. El segundo ciclo es la desnaturalización inicial en la que se inactiva la transcriptasa inversa. Los 40-50 ciclos restantes son la amplificación, que incluye desnaturalización, recocido y elongación. Cuando se completa la amplificación, los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel.

(Manual de aplicaciones PCR y Biotools)

RT-PCR en dos pasos

La RT-PCR de dos pasos, como su nombre lo indica, ocurre en dos pasos. Primero la transcripción inversa y luego la PCR. Este método es más sensible que el método de un solo paso. Los kits también son útiles para la RT-PCR de dos pasos. Al igual que para la PCR de un solo paso, use solo ARN intacto de alta calidad para obtener los mejores resultados. El cebador para la PCR en dos pasos no tiene que ser específico de secuencia.

Paso uno

Primero combine la plantilla de ARN, el cebador, la mezcla de dNTP y el agua libre de nucleasas en un tubo de PCR. Luego, agregue un inhibidor de ARNasa y una transcriptasa inversa al tubo de PCR. A continuación, coloque el tubo de PCR en un termociclador durante un ciclo en el que se produce la hibridación, extensión e inactivación de la transcriptasa inversa. Por último, proceda directamente al paso dos, que es la PCR, o almacene el producto en hielo hasta que se pueda realizar la PCR.

Paso dos

Agregue la mezcla maestra que contiene tampón, mezcla de dNTP, MgCl₂, Taq polimerasa y agua libre de nucleasas a cada tubo de PCR. Luego agregue la imprimación necesaria a los tubos. A continuación, coloque los tubos PCR en un termociclador durante 30 ciclos del programa de amplificación. Esto incluye: desnaturalización, recocido y elongación. Los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel.

Directrices de publicación

El ensayo de RT-PCR cuantitativa se considera el estándar de oro para medir la cantidad de copias de objetivos de cDNA específicos en una muestra, pero está poco estandarizado. Como resultado, si bien existen numerosas publicaciones que utilizan la técnica, muchas proporcionan detalles experimentales inadecuados y utilizan análisis de datos inadecuados para sacar conclusiones inapropiadas. Debido a la variabilidad inherente en la calidad de cualquier dato de PCR cuantitativo, los revisores no solo tienen dificultades para evaluar estos manuscritos, sino que los estudios también se vuelven imposibles de replicar. Reconociendo la necesidad de estandarizar el informe de las condiciones experimentales, un consorcio internacional de científicos académicos ha publicado las pautas de información mínima para la publicación de experimentos de PCR en tiempo real cuantitativos (MIQE, pronunciado mykee). Las pautas MIQE describen la información mínima necesaria para evaluar los experimentos de PCR cuantitativa que se debe exigir para su publicación a fin de fomentar mejores prácticas experimentales y garantizar la relevancia, precisión, interpretación correcta y repetibilidad de los datos de PCR cuantitativa.

Además de las pautas de reporte, el MIQE enfatiza la necesidad de estandarizar la nomenclatura asociada con PCR cuantitativa para evitar confusiones; por ejemplo, la abreviatura qPCR debe usarse para PCR cuantitativa en tiempo real, mientras que RT-qPCR debe usarse para transcripción inversa-qPCR, y los genes utilizados para la normalización deben ser denominados genes de referencia en lugar de genes domésticos. También propone que no se utilicen términos derivados comercialmente como sonda TaqMan, sino que se denominen sonda de hidrólisis. Además, se propone que el ciclo de cuantificación (Cq) se utilice para describir el ciclo de PCR utilizado para la cuantificación en lugar del ciclo de umbral (Ct), el punto de cruce (Cp) y el punto de despegue (TOP), que se refieren al mismo valor pero fueron acuñado por diferentes fabricantes de instrumentos de tiempo real.

La guía consta de los siguientes elementos: 1) diseño experimental, 2) muestra, 3) extracción de ácido nucleico, 4) transcripción inversa, 5) información del objetivo de qPCR, 6) oligonucleótidos, 7) protocolo, 8) validación y 9) análisis de datos. Elementos específicos dentro de cada elemento llevan una etiqueta de E (esencial) o D (deseable). Los etiquetados E se consideran críticos e indispensables, mientras que los etiquetados D se consideran periféricos pero importantes para las mejores prácticas.