Quimera de dedo de zinc

Las quimeras de proteína con dedo de zinc son proteínas quiméricas compuestas por un dominio de proteína con dedo de zinc que se une al ADN y otro dominio a través del cual la proteína ejerce su efecto. El dominio efector puede ser un activador transcripcional (A) o un represor (R), un dominio de metilación (M) o una nucleasa (N).

La modificación del dominio endógeno de dedo de zinc que se une al ADN es la base del campo más avanzado en la construcción de factores de transcripción artificiales específicos para genes. La unión de seis ZFP produce un sitio diana de 18-19 pb. Suponiendo especificidad para esa secuencia única y que la secuencia del genoma es aleatoria, 18 pb es lo suficientemente largo como para ser único en todos los genomas conocidos. De hecho, el espaciamiento entre subsitios se convierte en parte de la secuencia diana debido a restricciones en la flexibilidad de la proteína, que pueden controlarse. La selección de sitios diana de tan solo 9 pb proporciona cierto grado de especificidad, casi con certeza atribuible en parte a la oclusión de la cromatina.Dependiendo de los requisitos de la investigación, existen varias técnicas disponibles para definir un dominio de reconocimiento de ADN que confiera la especificidad de un factor de transcripción basado en ZFP. Se han descrito tres estrategias de visualización de fagos, que implican la selección paralela, secuencial o bipartita de los dedos de zinc constituyentes.El enfoque de selección paralela (Fig. 1 (A)) asume que los dominios individuales de dedos de zinc son funcionalmente independientes. Sobre esta base, los dominios predeterminados existentes deberían poder utilizarse sin necesidad de diseño ni selección adicionales, lo que la convierte en una técnica rápida y accesible para cualquier laboratorio. Esto no siempre es así, por lo que esta estrategia puede presentar problemas relacionados con la superposición de sitios diana en varias secuencias diana, como se explica más adelante. De ser necesario, podría ser posible superar el problema de la superposición de sitios diana aleatorizando los residuos de aminoácidos en la interfaz de dos dedos de zinc donde se produce.La selección secuencial (Fig. 1 (B)), propuesta por el grupo Pabo en 1997, adopta la unión cooperativa entre dedos de zinc para producir dominios de unión al ADN de gran afinidad y especificidad. Como su nombre indica, cada dedo se selecciona de una biblioteca aleatorizada en el contexto del dedo previamente seleccionado. Las técnicas utilizadas en la selección son similares a las descritas a continuación, salvo que el oligonucleótido diana utilizado contiene la secuencia diana completa. Como se muestra en la Fig. 1, se crea una biblioteca en la que el dedo tres contiene la hélice alfa aleatorizada. Se selecciona el dominio con las mejores características de unión y se incluye en otra biblioteca en la que se elimina el ancla del dedo uno y se añade otro dedo aleatorizado en el extremo opuesto. Esto continúa y da como resultado un dominio de unión al ADN en el que todos los dedos se seleccionaron en el contexto del dedo vecino. Dado que cada ronda de selección se aplica a la misma secuencia diana final, el solapamiento del sitio diana sigue produciéndose, pero es una ventaja en lugar de un obstáculo.La principal desventaja de este enfoque es la necesidad de producir una biblioteca separada para cada dedo de zinc, lo que excede la capacidad de la mayoría de los laboratorios.El método de selección bipartita (Fig. 1 (C)) fue propuesto por Isalan et al., 2001, como una solución intermedia entre las estrategias de selección paralela y secuencial. Los primeros y los últimos 5 pb del sitio diana de 9 pb se seleccionan en paralelo y se combinan para producir una biblioteca de la cual se selecciona la ZFP final.Para mantener el tamaño de la biblioteca dentro de límites razonables, esta técnica se limita a la aleatorización de los residuos clave involucrados en el reconocimiento de bases. Además, a diferencia de la selección paralela, esta técnica requiere múltiples análisis de genes antes de poder construir una nueva ZFP.Para determinar la secuencia de aminoácidos más adecuada en la hélice alfa de un dedo de zinc para su unión a una secuencia de ADN dada, se puede emplear una técnica de visualización de fagos. Al alterar el genoma de un bacteriófago seleccionado, es posible crear un fago que muestre una ZFP como parte de su cubierta proteica. Posteriormente, se puede analizar la adherencia de dicho fago, mediante los dedos de zinc unidos, a un oligonucleótido que contiene la secuencia de interés, mientras que otros fagos no adherentes se eliminan por lavado. El ADN del fago codifica las ZFP expresadas, por lo que la extracción y secuenciación del ADN del fago unido proporciona información sobre las configuraciones de aminoácidos adecuadas para la unión a una secuencia específica. Esto constituye la base de la investigación de la unión de ZFP mediante visualización de fagos.El trabajo se realiza típicamente utilizando el ZFP-TF murino Zif268 o uno de sus derivados, como base para las modificaciones de la secuencia de dedo de zinc, dado que es la proteína de dedo de zinc mejor caracterizada. Sus derivados C7 o C7.GAT se utilizan a menudo por su superior afinidad y especificidad de unión. C7.GAT se ha utilizado para investigar las familias de secuencias 5'-ANN-3' y 5'-CNN-3', ya que el tercer dedo de C7 define una guanina o timina en la posición 5' de la secuencia del dedo dos (superposición del sitio diana). El fago auxiliar filamentoso y el ADN del fago lambda se utilizan en la visualización de fagos. Debido a las limitaciones en el tamaño de las bibliotecas que se pueden construir rutinariamente, la aleatorización puede limitarse a los aminoácidos más influyentes en la secuencia de ZFP, según se infiere mediante cristalografía de rayos X. Las posiciones se identificaron como posiciones de hélice -1, 2, 3, 4, 5 y 6 en los dedos uno y tres, y posiciones -2, -1, 1, 2, 3 y 4 en el dedo dos en un estudio publicado por Wu et al. (1995). Sin embargo, otro estudio de Segal et al. (1999) sugiere la importancia de todas las posiciones de la -2 a la 6 debido a la afinidad inespecífica de algunos aminoácidos y la capacidad de otros para estabilizar las interacciones adyacentes.Se utiliza como diana un ADN en horquilla corto (~34 nt) que contiene el sitio de unión de ZFP, con alteraciones en un único subsitio. El oligonucleótido utilizado puede sintetizarse para incluir un grupo n-hexil amino primario en su extremo 5', que posteriormente se utiliza para fijar la albúmina de suero bovino (BSA). En este caso, el conjugado se utiliza para precubrir un pocillo de microtitulación, antes de aplicar ~10¹³ unidades formadoras de colonias de fago. Tras la incubación, se retiran los fagos y la placa se lava con un tampón que contiene Tween 20 al 0,5 % para eliminar los fagos no adherentes. Utilizando un tampón de elución ácido, se eliminan los fagos adherentes y se neutralizan con Tris. Se realizan rondas adicionales de cribado para asegurar el enriquecimiento de la muestra, infectando células bacterianas con el fago eluido y el fago auxiliar, y luego recolectando el fago [que muestra ZFP] producido para la siguiente ronda de cribado. Como alternativa a la BSA, el ADN diana en horquilla puede biotinilarse y posteriormente extraerse con microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina (la estreptavidina forma enlaces muy fuertes con la biotina).Para aumentar la especificidad del fago seleccionado, especialmente cuando se investigan bibliotecas más grandes, se utilizan oligonucleótidos competidores para secuestrar las proteínas con dedos de zinc de menor especificidad antes de añadir el oligonucleótido diana biotinilado. El ADN de esperma de arenque cortado, por ejemplo, se une al fago con una adherencia inespecífica al ADN. Las rondas posteriores de cribado implican concentraciones crecientes de oligonucleótidos no diana sintetizados específicamente, donde todo, excepto la secuencia del subsitio diana, permanece igual, con una sola diferencia de nucleótido. En particular, la secuencia diana de la ZFP original, sometida a mutagénesis, se utiliza en grandes cantidades para seleccionar contra el fago parental que contamina la biblioteca. La unión de las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina puede bloquearse mediante blotto y fagos (irrelevantes) que muestran anticuerpos, de modo que la unión solo se produce con moléculas con una afinidad tan alta como la biotina. Los fagos inespecíficos se eliminan como antes, utilizando un tampón que incluye Tween 20 diluido. Los fagos unidos se recogen mediante microesferas magnéticas y pueden eluirse mediante incubación con tripsina. De esta forma, solo se seleccionarán los fagos que presenten ZFP altamente específicos.Tras la elución, el fago se puede sembrar en placa y extraer el ADN de las unidades formadoras de placa individuales, restringirlo y extraer los fragmentos de tamaño adecuado tras la separación mediante PAGE. El ADN se puede secuenciar para descubrir la estructura primaria de la proteína que produce la adherencia a la secuencia diana. Este proceso se repite para cada uno de los subsitios de dedo único 5'-NNN-3' que se investigan.La generación de matrices de dedos de zinc Cys₂His₂ diseñados es el método más desarrollado para crear proteínas capaces de dirigirse a las secuencias de ADN genómico deseadas. La mayoría de las matrices de dedos de zinc diseñadas se basan en el dominio de dedo de zinc del factor de transcripción murino Zif268, aunque algunos grupos han utilizado matrices de dedos de zinc basadas en el factor de transcripción humano SP1. Zif268 posee tres motivos de dedos de zinc individuales que se unen colectivamente a una secuencia de 9 pb con alta afinidad. La estructura de esta proteína unida al ADN se resolvió en 1991 e impulsó un gran volumen de investigación sobre matrices de dedos de zinc diseñadas. En 1994 y 1995, varios grupos utilizaron la visualización de fagos para alterar la especificidad de un solo dedo de zinc de Zif268. Carlos F. Barbas et al. También se ha informado sobre el desarrollo de la tecnología de dedos de zinc en la literatura de patentes y se han concedido varias patentes importantes para su desarrollo comercial. Las matrices de dedos de zinc diseñadas típicamente tienen entre 3 y 6 motivos individuales y se unen a sitios diana con una longitud de entre 9 y 18 pares de bases. Las matrices con 6 motivos de dedos de zinc son particularmente atractivas porque se unen a un sitio diana lo suficientemente largo como para tener una alta probabilidad de ser único en el genoma de un mamífero. Actualmente, se utilizan dos métodos principales para generar matrices de dedos de zinc diseñadas: el ensamblaje modular y un sistema de selección bacteriana, y existe cierto debate sobre cuál es el método más adecuado para la mayoría de las aplicaciones.El método más sencillo para generar nuevas matrices de dedos de zinc consiste en combinar módulos de dedos de zinc más pequeños con especificidad conocida. La estructura de la proteína dedo de zinc Zif268 unida al ADN, descrita por Pavletich y Pabo en su publicación de 1991, ha sido clave para gran parte de este trabajo y describe el concepto de obtener dedos para cada uno de los 64 tripletes de pares de bases posibles y, posteriormente, mezclarlos y combinarlos para diseñar proteínas con la especificidad de secuencia deseada. El proceso de ensamblaje modular más común consiste en combinar dedos de zinc separados, cada uno capaz de reconocer una secuencia de ADN de 3 pares de bases, para generar matrices de 3, 4, 5 o 6 dedos que reconocen sitios diana con una longitud de entre 9 y 18 pares de bases. Otro método utiliza módulos de 2 dedos para generar matrices de dedos de zinc con hasta seis dedos de zinc individuales. El Laboratorio Barbas del Instituto de Investigación Scripps utilizó la visualización de fagos para desarrollar y caracterizar dominios de dedos de zinc que reconocen la mayoría de las secuencias de tripletes de ADN, mientras que otro grupo aisló y caracterizó dedos individuales del genoma humano. Una posible desventaja del ensamblaje modular en general es que las especificidades de cada dedo de zinc pueden solaparse y depender del contexto de los dedos de zinc circundantes y del ADN. Un estudio reciente demostró que una alta proporción de matrices de dedos de zinc de 3 dedos generadas mediante ensamblaje modular no se unen a su diana con suficiente afinidad en un ensayo bacteriano de dos híbridos y no funcionan como nucleasas de dedos de zinc. Sin embargo, la tasa de éxito fue ligeramente mayor cuando se dirigieron a sitios de la forma GNNGNNGNN. Un estudio posterior utilizó ensamblaje modular para generar nucleasas de dedos de zinc con matrices de 3 y 4 dedos, y observó una tasa de éxito mucho mayor con las matrices de 4 dedos. También se ha descrito una variante del ensamblaje modular que tiene en cuenta el contexto de los dedos vecinos, y este método tiende a producir proteínas con un rendimiento mejorado en comparación con el ensamblaje modular estándar.

Se han utilizado numerosos métodos de selección para generar matrices de dedos de zinc capaces de identificar las secuencias deseadas. Los primeros esfuerzos de selección utilizaron la visualización de fagos para seleccionar proteínas que se unían a una diana de ADN dada de un amplio conjunto de matrices de dedos de zinc parcialmente aleatorizadas. Esta técnica es difícil de usar con más de un dedo de zinc a la vez, por lo que se desarrolló un proceso de varios pasos que generó una matriz de tres dedos completamente optimizada añadiendo y optimizando un dedo de zinc a la vez. Estudios más recientes han utilizado sistemas de un híbrido en levaduras, sistemas bacterianos de uno y dos híbridos, y células de mamíferos. Un nuevo método prometedor para seleccionar nuevas matrices de dedos de zinc de tres dedos utiliza un sistema bacteriano de dos híbridos y ha sido denominado "OPEN" por sus creadores. Este sistema combina conjuntos preseleccionados de dedos de zinc individuales, cada uno seleccionado para unirse a un triplete determinado, y luego utiliza una segunda ronda de selección para obtener matrices de 3 dedos capaces de unirse a la secuencia deseada de 9 pb. Este sistema fue desarrollado por el Consorcio de Dedos de Zinc como alternativa a las fuentes comerciales de matrices de dedos de zinc diseñadas. Resulta algo difícil comparar directamente las propiedades de unión de las proteínas generadas con este método con las proteínas generadas por ensamblaje modular, ya que nunca se han descrito los perfiles de especificidad de las proteínas generadas por el método OPEN.Las matrices de dedos de zinc diseñadas pueden utilizarse en numerosas aplicaciones, como factores de transcripción artificiales, metilasas de dedos de zinc, recombinasas de dedos de zinc y nucleasas de dedos de zinc. Si bien los estudios iniciales con otro dominio de unión al ADN de efectores TAL bacterianos son prometedores, aún está por verse si estos dominios son adecuados para algunas o todas las aplicaciones en las que se utilizan actualmente los dedos de zinc diseñados. Los factores de transcripción artificiales con matrices de dedos de zinc diseñadas se han utilizado en numerosos estudios científicos, y actualmente se está evaluando en humanos un factor de transcripción artificial que activa la expresión de VEGF como posible tratamiento para diversas indicaciones clínicas. Las nucleasas de dedos de zinc se han convertido en reactivos útiles para manipular genomas de muchos organismos superiores, como Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, tabaco, maíz, pez cebra, varios tipos de células de mamíferos y ratas. Un ensayo clínico en curso evalúa las nucleasas de dedo de zinc que alteran el gen CCR5 en las células T CD4+ humanas como posible tratamiento para el VIH/SIDA.Estas investigaciones requieren el uso de ZFP solubles, ya que la unión a fagos puede alterar las características de unión de los dedos de zinc. Una vez seleccionada una ZFP, su secuencia se subclona desde pComb3H en un vector de expresión bacteriano modificado, pMal-c2, vinculándola a una secuencia que codifica la proteína de unión a maltosa. El recombinante se transforma posteriormente en células XL1-Blue y se induce la expresión mediante la adición de isopropil β-D-tiogalactósido (IPTG). Los extractos de congelación/descongelación pueden purificarse para su uso en los siguientes experimentos. Si bien la purificación no es necesaria para el ELISA multidiana, es esencial para medir la afinidad de unión mediante resonancia de plasmones y huellas de DNasa. Puede realizarse utilizando una columna FPLC de heparina-sefarosa equilibrada con tampón de zinc, seguida de la confirmación de homogeneidad mediante densitometría en gel SDS-PAGE. Las mismas técnicas se utilizan para examinar las propiedades de unión de la quimera ZFP polidactil completa.La especificidad de las ZFP seleccionadas mediante visualización de fagos se evalúa mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) multidiana. Las ZFP se aplican a pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina y un oligonucleótido diana biotinilado. Tras la incubación, se lavan los pocillos para eliminar los dedos de zinc si no se adhieren a la secuencia diana. A continuación, se aplica un anticuerpo anti-MBP (proteína de unión a maltosa) de ratón y se incuba. Se añade un anticuerpo anti-ratón de cabra acoplado a fosfatasa alcalina y se deja que se una. A continuación, se lava para eliminar el anticuerpo si no se une a los dedos de zinc. Se añade el sustrato de fosfatasa alcalina y, tras detener la reacción, se determina la densidad óptica a 405 nm (DO405) mediante espectrofotometría.La lectura del espectrofotómetro depende de la cantidad de fosfatasa alcalina presente en el pocillo, que a su vez es proporcional a la unión de la ZFP en cuestión. Si la ZFP se une a una secuencia para la que no fue seleccionada con mucha afinidad, no es lo suficientemente específica para la mayoría de los fines médicos y, con toda probabilidad, será rechazada.Estos ensayos se repiten utilizando diferentes oligonucleótidos diana. Por ejemplo, al investigar la unión de los dedos de zinc a las secuencias 5'-XNN-3', será necesario investigar las 16 posibles secuencias de oligonucleótidos. Además, para evaluar la especificidad del nucleótido 5', se utiliza el complemento completo de las cuatro familias 5'-ANN-3', 5'-CNN-3', 5'-GNN-3' y 5'-TNN-3' como dianas en cuatro reacciones separadas y se compara la unión relativa en cada una.El análisis cinético proporciona información sobre la afinidad y la especificidad de la adherencia del dedo de zinc a la diana. Puede realizarse con equipos comerciales que utilizan resonancia plasmónica de superficie. La superficie del chip sensor se recubre con estreptavidina purificada por afinidad antes de aplicar oligonucleótidos biotinilados que también se adhieren a la superficie. La tasa de asociación (k_on) se calcula midiendo la velocidad de unión de la ZFP a la superficie utilizando diferentes concentraciones de proteína, mientras que la tasa de disociación (k_off) puede calcularse aumentando la velocidad de flujo tras la asociación. El cálculo se realiza mediante el software incluido con el instrumento.Como alternativa, la K_d puede calcularse mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad en gel, en el que la misma proteína purificada se incuba con diluciones seriadas de oligonucleótido diana purificado en gel y marcado con 32P en el extremo. Las reacciones de incubación se resuelven, a lo largo de un corto periodo, en un gel de poliacrilamida y se cuantifican utilizando un generador de imágenes y un software comercial. La K_d se calcula mediante el análisis de Scatchard, utilizando la ecuación de la isoterma de unión: θ_b = [péptido]/([péptido] + K_d).

Para determinar el espacio que ocupa una ZFP al unirse a su diana de ADN, se amplifica un fragmento del gen diana mediante PCR y se mezcla con un fragmento promotor marcado con 32P en el extremo. Esta reacción se incuba con diferentes concentraciones de ZFP producida y purificada mediante uno de los métodos de sobreexpresión descritos previamente (p. ej., pMal-c2 y XL1-Blue) y de purificación. La digestión con DNasa I produce fragmentos de longitud variable, pero cuando la ZFP se une a alta concentración, las longitudes de fragmento correspondientes no están presentes en la mezcla, ya que la actividad de la DNasa ha sido ocluida por la ZFP en estas ubicaciones. Las muestras se separan en un gel de acrilamida (~6 %), urea (8 M), se utilizan para exponer las placas de imagen de fósforo y se registran con un equipo de imagen de fósforo comercial. El análisis por software también puede utilizarse para obtener valores de K_d.Ciertas secuencias de residuos de aminoácidos pueden reconocer y son específicas de un sitio diana extendido de cuatro o incluso cinco nucleótidos. Cuando esto ocurre en una ZFP en la que los subsitios de tres nucleótidos son contiguos, un dedo de zinc interfiere con el sitio diana del dedo de zinc adyacente, una situación conocida como superposición del sitio diana.Los ZFP-TF, compuestos por activadores y represores, son factores de transcripción compuestos por un dominio proteico de dedo de zinc y cualquier dominio efector de factores de transcripción que ejercen su efecto modulador en cualquier secuencia a la que se une el dominio ZFP.Las nucleasas de dedo de zinc incluyen un dominio de nucleasa como FokI, capaz de introducir roturas de doble cadena en el locus de cualquier secuencia a la que se une el dominio proteico de dedo de zinc.

• Terapia genética
• nucleasa de dedo Zinc
• Proteína de dedo Zinc
• Factor de transcripción de proteína de dedo zinc