Punto de control del ciclo celular

Los puntos de control del ciclo celular son mecanismos de control en el ciclo celular eucariota que aseguran su correcta progresión. Cada punto de control sirve como un punto de terminación potencial a lo largo del ciclo celular, durante el cual se evalúan las condiciones de la célula, y la progresión a través de las distintas fases del ciclo celular ocurre solo cuando se cumplen las condiciones favorables. Hay muchos puntos de control en el ciclo celular, pero los tres principales son: el punto de control G1, también conocido como punto de control de inicio o de restricción o punto de control principal; el punto de control G2/M; y la transición de metafase a anafase, también conocido como punto de control del huso. La progresión a través de estos puntos de control está determinada en gran medida por la activación de las quinasas dependientes de ciclina por subunidades proteicas reguladoras llamadas ciclinas, de las cuales se producen diferentes formas en cada etapa del ciclo celular para controlar los eventos específicos que ocurren en ella.

Antecedentes

Todos los organismos vivos son el producto de repetidas rondas de crecimiento y división celular. Durante este proceso, conocido como ciclo celular, una célula duplica su contenido y luego se divide en dos. El propósito del ciclo celular es duplicar con precisión el ADN de cada organismo y luego dividir la célula y su contenido de manera uniforme entre las dos células resultantes. En los eucariotas, el ciclo celular consta de cuatro etapas principales: G1, durante la cual una célula es metabólicamente activa y crece continuamente; fase S, durante la cual tiene lugar la replicación del ADN; G2, durante la cual continúa el crecimiento celular y la célula sintetiza varias proteínas en preparación para la división; y la fase M (mitosis), durante la cual los cromosomas duplicados (conocidos como cromátidas hermanas) se separan en dos núcleos hijos, y la célula se divide en dos células hijas, cada una con una copia completa de ADN. En comparación con el ciclo celular eucariota, el ciclo celular procariota (conocido como fisión binaria) es relativamente simple y rápido: el cromosoma se replica desde el origen de replicación, se ensambla una nueva membrana y la pared celular forma un tabique que divide la célula en dos.

Como el ciclo celular eucariota es un proceso complejo, los eucariotas han desarrollado una red de proteínas reguladoras, conocida como el sistema de control del ciclo celular, que supervisa y dicta la progresión de la célula a través del ciclo celular. Este sistema actúa como un cronómetro, o un reloj, que establece una cantidad fija de tiempo para que la célula pase en cada fase del ciclo celular, mientras que al mismo tiempo también responde a la información recibida de los procesos que controla. Los puntos de control del ciclo celular desempeñan un papel importante en el sistema de control al detectar defectos que ocurren durante procesos esenciales como la replicación del ADN o la segregación cromosómica, e inducir una detención del ciclo celular en respuesta hasta que se reparen los defectos. El principal mecanismo de acción de los puntos de control del ciclo celular es a través de la regulación de las actividades de una familia de proteínas quinasas conocidas como quinasas dependientes de ciclina (CDK), que se unen a diferentes clases de proteínas reguladoras conocidas como ciclinas, formándose y activándose complejos ciclina-CDK específicos en diferentes fases del ciclo celular. Estos complejos, a su vez, activan diferentes dianas posteriores para promover o prevenir la progresión del ciclo celular.

Punto de control G1 (restricción)

El punto de control G1, también conocido como punto de restricción en las células de mamíferos y punto de inicio en las levaduras, es el punto en el que la célula se compromete a entrar en el ciclo celular. A medida que la célula avanza a través de G1, dependiendo de las condiciones internas y externas, puede retrasar G1, entrar en un estado de reposo conocido como G0 o continuar más allá del punto de restricción. El daño del ADN es la principal indicación para que una célula se "restringa" y no entre en el ciclo celular. La decisión de comprometerse a una nueva ronda de división celular ocurre cuando la célula activa la transcripción dependiente de ciclina-CDK que promueve la entrada en la fase S. Este punto de control asegura el proceso posterior.

Durante la G1 temprana, hay tres represores transcripcionales, conocidos como proteínas de bolsillo, que se unen a los factores de transcripción E2F. La familia de genes E2F es un grupo de factores de transcripción que se dirigen a muchos genes que son importantes para el control del ciclo celular, incluyendo ciclinas, CDK, reguladores de puntos de control y proteínas de reparación del ADN. La regulación incorrecta de la familia E2F se encuentra a menudo en casos de cáncer, lo que proporciona evidencia de que la familia E2F es esencial para la regulación estricta de la replicación y división del ADN. Las tres proteínas de bolsillo son Retinoblastoma (Rb), p107 y p130, que se unen a los factores de transcripción E2F para prevenir la progresión más allá del punto de control G1.

La familia de genes E2F contiene algunas proteínas con mecanismos activadores y algunas proteínas con mecanismos represores. P107 y p130 actúan como correpresores de E2F 4 y E2F 5, que trabajan para reprimir la transcripción de factores promotores de G1 a S. La proteína del tercer bolsillo, Rb, se une a E2F 1, E2F 2 y E2F 3, que son las proteínas E2F con capacidades activadoras, y las reprime.

La retroalimentación positiva desempeña un papel esencial en la regulación de la progresión de la fase G1 a la fase S, en particular en la fosforilación de Rb por un complejo proteico Ciclina/CDK. Rb sin fosfato, o Rb no fosforilado, regula la salida del ciclo celular G0 y la diferenciación. Durante el comienzo de la fase G1, los factores de crecimiento y el daño del ADN indican el aumento de los niveles de ciclina D, que luego se une a Cdk4 y Cdk6 para formar el complejo CiclinaD:Cdk4/6. Se sabe que este complejo inactiva Rb por fosforilación. Sin embargo, los detalles de la fosforilación de Rb son bastante complejos y específicos en comparación con el conocimiento previo sobre el punto de control G1. CiclinaD:Cdk4/6 coloca solo un fosfato, o monofosforila, a Rb en uno de sus catorce sitios de fosforilación accesibles y únicos. Cada una de las catorce isoformas monofosforiladas específicas tiene una preferencia de unión diferencial con los miembros de la familia E2F, lo que probablemente contribuye a la diversidad de los procesos celulares dentro del cuerpo de los mamíferos.

E2F 4 y E2F 5 dependen de p107 y p130 para mantener su localización nuclear. Sin embargo, la ciclina D:Cdk 4/6 también fosforila p107 y p130, un proceso que libera su unión de E2F 4 y 5 (que luego escapan al citoplasma), y permite que E2F 1–3 se una al ADN e inicie la transcripción de la ciclina E. Las proteínas Rb mantienen su estado monofosforilado durante la fase G1 temprana, mientras que la ciclina E se acumula y se une a Cdk2.

La ciclina E:Cdk2 desempeña un papel adicional importante en la fosforilación de la transición de G1 a S. En particular, la ciclina E:Cdk2 promueve un ciclo de retroalimentación positiva que crea un cambio de “todo o nada”. En muchas redes de control genético, la retroalimentación positiva garantiza que las células no se deslicen de una fase a otra del ciclo celular. La ciclina E:Cdk2 procede a fosforilar Rb en todos sus sitios de fosforilación, también denominado “hiperfosforilación”, lo que garantiza la inactivación completa de Rb. La hiperfosforilación de Rb se considera el punto de restricción G1 tardío, después del cual la célula no puede retroceder en el ciclo celular. En este punto, las proteínas E2F 1-3 se unen al ADN y transcriben la ciclina A y Cdc 6.

El inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina 1B (CDKN1B), también conocido como p27, se une a la ciclina E:Cdk2 y evita su activación por inhibición. Sin embargo, a medida que la ciclina A se acumula y se une a la Cdk2, forman un complejo e inhiben a p27. La cinasa dependiente de ciclina de fase G1 trabaja junto con la cinasa dependiente de ciclina de fase S que ataca a p27 para su degradación. A su vez, esto permite la activación completa de la ciclina A:Cdk2, un complejo que fosforila E2F 1-3 iniciando su disociación de los sitios promotores del ADN. Esto permite que E2F 6-8 se una al ADN e inhiba la transcripción. El ciclo de retroalimentación negativa utilizado para inhibir con éxito el inhibidor, p27, es otro proceso esencial utilizado por las células para garantizar un movimiento unidireccional y que no haya retrocesos a lo largo del ciclo celular.

Cuando se produce un daño en el ADN, o cuando la célula detecta algún defecto que la obligue a retrasar o detener el ciclo celular en G1, se produce un arresto a través de varios mecanismos. La respuesta rápida implica eventos de fosforilación que se inician con la quinasa ATM (Ataxia telangiectasia mutada) o ATR (Ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), que actúan como sensores, dependiendo del tipo de daño. Estas quinasas fosforilan y activan las quinasas efectoras Chk2 y Chk1, respectivamente, que a su vez fosforilan la fosfatasa Cdc25A, marcándola así para la ubiquitinación y degradación. Como Cdc25A activa el complejo ciclina E-CDK2 mencionado anteriormente al eliminar los fosfatos inhibidores de CDK2, en ausencia de Cdc25A, la ciclina E-CDK2 permanece inactiva y la célula permanece en G1.

Para mantener la detención, se inicia otra respuesta, por la cual Chk2 o Chk1 fosforilan p53, un supresor tumoral, y esto estabiliza p53 al evitar que se una a Mdm2, una ligasa de ubiquitina que inhibe p53 al dirigirlo hacia su degradación. El p53 estable actúa entonces como activador transcripcional de varios genes diana, incluyendo p21, un inhibidor del complejo promotor de G1 a S ciclina E-CDK2. Además, otro mecanismo por el cual p21 se activa es a través de la acumulación de p16 en respuesta al daño del ADN. p16 altera los complejos ciclina D-CDK4, causando así la liberación de p21 de los complejos, lo que conduce a la desfosforilación y activación de Rb, que permite que Rb se una e inhiba a E2F 1–3, evitando así que la célula pase a la fase S. Recientemente, algunos aspectos de este modelo han sido cuestionados.

Punto de control G2

Después de la replicación del ADN en la fase S, la célula atraviesa una fase de crecimiento conocida como G2. Durante este tiempo, se producen las proteínas mitóticas necesarias y la célula se somete una vez más a mecanismos reguladores para garantizar el estado adecuado para la entrada en la fase mitótica proliferativa (M). En esta transición de G2 a M intervienen múltiples puntos de control mecanísticos, con un factor común de unión: la actividad de ciclina-Cdk.

Aunque existen variaciones en los complejos ciclina-Cdk necesarios en los distintos organismos, la necesidad de la actividad de la quinasa se conserva y, por lo general, se concentra en un único emparejamiento. En la levadura de fisión existen tres formas diferentes de ciclina mitótica y seis en la levadura en ciernes, pero la ciclina principal utilizada es la ciclina B. La ciclina B servirá como referencia para la discusión de la transición del punto de control G2/M.

De manera similar a la fase S, la G2 experimenta un punto de control de daño del ADN. Se examina nuevamente la célula en busca de sitios de daño del ADN o replicación incompleta, y se reclutan las quinasas ATR y ATM para dañar los sitios. También se produce la activación de Chk1 y Chk2, así como la activación de p53, para inducir la detención del ciclo celular y detener la progresión hacia la mitosis. Un componente adicional de la fase S, el complejo prerreplicativo, debe inactivarse mediante la fosforilación de ciclina B-Cdk1.

A medida que se evalúan estos puntos de control previos, la acumulación de proteína G2 sirve para activar la actividad de ciclina B-Cdk1 a través de múltiples mecanismos. La ciclina A-Cdk2 activa Cdc25, un activador de ciclina B-Cdk1, que luego desactiva el inhibidor de ciclina B-Cdk1, Wee1. Esto da como resultado un ciclo de retroalimentación positiva, que aumenta significativamente la expresión de ciclina B y la activación de Cdk1. A medida que la célula progresa a través de G2 y alcanza la transición G2/M, la quinasa Plk1 fosforila Wee1, que selecciona Wee1 para su degradación a través del complejo de ubiquitina ligasa SCF. Una función adicional de Plk1 es activar Cdc25 a través de la fosforilación. El efecto compuesto de la degradación de Wee1 y la activación de Cdc25 es la eliminación neta de la fosforilación inhibidora de cdc2, que activa cdc2. Plk1 se activa en la transición G2/M por la Aurora A y Bora, que se acumulan durante G2 y forman un complejo de activación. El complejo Plk1-Cdc2-cdc25 inicia entonces un ciclo de retroalimentación positiva que sirve para activar aún más Cdc2, y junto con un aumento en los niveles de ciclina B durante G2, los complejos cdc2-ciclina B resultantes activan entonces dianas posteriores que promueven la entrada en mitosis. La actividad Cdk1 resultante también activa la expresión de Mem1-Fkh, un gen de transición G2/M. El aumento rápido en la actividad ciclina B-Cdk1 es necesario, ya que el inicio de la fase M es un evento de todo o nada que genera histéresis. La histéresis de la actividad Cdk1 a través de la ciclina B impulsa la entrada en la fase M al establecer un umbral mínimo de concentración de ciclina B. Este existe a un nivel más alto que el mínimo necesario para la continuación de la fase M después de la entrada, actuando para salvaguardar el evento de todo o nada. Esta concentración de entrada aumenta aún más en el caso de una replicación incompleta del ADN, lo que añade otro mecanismo regulador en el punto de transición G2/M. La presencia de histéresis permite que la entrada a la fase M esté altamente regulada en función de la actividad de la ciclina B-Cdk1.

Los mecanismos por los que se impide la entrada mitótica en respuesta a un daño en el ADN son similares a los del punto de control G1/S. El daño en el ADN desencadena la activación de la vía ATM/ATR antes mencionada, en la que ATM/ATR fosforilan y activan las quinasas del punto de control Chk1/Chk2. Chk1/2 fosforilan cdc25 que, además de inhibirse, también es secuestrado en el citoplasma por las proteínas 14-3-3. 14-3-3 son reguladas positivamente por p53, que, como se mencionó anteriormente, es activada por Chk1 y ATM/ATR. p53 también transactiva p21, y tanto p21 como 14-3-3 a su vez inhiben los complejos ciclina B-cdc2 a través de la fosforilación y secuestro citoplasmático de cdc2. Además, la inactivación de cdc25 da como resultado su incapacidad para desfosforilar y activar cdc2. Finalmente, otro mecanismo de respuesta al daño es a través de la regulación negativa de Plk1 por ATM/ATR, que a su vez resulta en la estabilización de Wee1 y Myt1, que luego pueden fosforilar e inhibir a cdc2, manteniendo así la célula detenida en G2 hasta que se solucione el daño.

Al final de G2, la célula pasa a la mitosis, donde el núcleo se divide. La transición de G2 a M es espectacular; hay un efecto de todo o nada y la transición es irreversible. Esto es ventajoso para la célula porque entrar en la mitosis es un paso crítico en el ciclo de vida de una célula. Si no se compromete completamente, la célula se enfrentaría a muchos problemas con la división parcial, lo que en última instancia probablemente conduciría a la muerte de la célula.

En los ovocitos de rana, la cascada de señales se induce cuando la progesterona se une a un receptor de membrana. Luego, se activa Mos. Luego, Mos fosforila MEK1, que fosforila MAPK. MAPK cumple dos funciones: activa el complejo Ciclina B-Cdk1 para iniciar la entrada a la mitosis y activa Mos. La activación de Mos conduce a un ciclo de retroalimentación positiva y, por lo tanto, actúa como un "interruptor de palanca" para crear la entrada de todo o nada a la mitosis.

Este circuito de retroalimentación se descubrió por primera vez al demostrar que las concentraciones de MAPK-P (MAPK fosforilada) aumentaban en respuesta al aumento de los niveles de progesterona. A nivel de células individuales, cada célula tenía MAPK completamente fosforilada o no tenía MAPK fosforilada, lo que confirma que actúa como un mecanismo de tipo interruptor en cada célula. Además, se demostró que el bloqueo de la síntesis de proteína Mos hace que las respuestas de MAPK-P sean más graduales, lo que demuestra que la síntesis de proteína Mos es necesaria para el carácter de todo o nada de la activación de MAPK.

Bieabilidad

Este proceso se puede entender mediante la inestabilidad. Utilizando el gráfico que se muestra a la derecha, la tasa de síntesis de Mos cambia a medida que se agrega más progesterona. Con cada curva, hay puntos fijos estables y puntos fijos inestables. En los puntos fijos inestables, el sistema empujará hacia uno de los puntos fijos estables. Por lo tanto, el sistema puede estar en el estado "encendido" o en el estado "apagado", no en el medio. Cuando el nivel de progesterona es lo suficientemente alto, la curva de Mos se desplaza hacia arriba y, en última instancia, intersecta la línea de degradación en un solo punto, por lo que solo hay un estado "encendido" estable, lo que indica la entrada en la mitosis.

La irreversibilidad que vemos en el punto de transición de la mitosis se debe a que hay niveles suficientemente altos de progesterona en la célula. Con niveles suficientemente altos de progesterona, el sistema es monoestable como resultado del ciclo de retroalimentación positiva entre Mapk y Mos. El punto en el que el sistema cambia de biestable a monoestable se denomina bifurcación del nódulo en silla de montar.

Por lo tanto, podemos entender la respuesta irreversible de todo o nada de la transición mitótica con un modelo matemático de los reguladores moleculares como un sistema biestable que depende de la existencia de retroalimentación positiva. El “estado de inactividad” es aniquilado por un nivel suficientemente alto de progesterona y una vez que la célula es empujada más allá del estado de inactividad, se queda atrapada en el estado de activación.

Histéresis y el modelo de Novak-Tyson

A partir de este modelo biestable, podemos entender que la transición mitótica depende de la histéresis para impulsarla. La histéresis se define como la dependencia del estado de un sistema de su historia. El modelo de Novak-Tyson es un modelo matemático de la progresión del ciclo celular que predice que las transiciones irreversibles al entrar y salir de la mitosis están impulsadas por la histéresis. El modelo tiene tres predicciones básicas que deberían ser ciertas en extractos de ovocitos en ciclo cuya progresión del ciclo celular depende de la histéresis:

1. La concentración de ciclina B necesaria para entrar en la mitosis es mayor que la concentración necesaria para mantener un extracto mitótico en la mitosis.
2. El ADN no replicado eleva el nivel de ciclina necesario para la activación Cdc2 y por lo tanto la entrada en mitosis.
3. Hay una disminución en la tasa de activación de Cdc2 a concentraciones de ciclina B justo por encima del umbral de activación.

Sha et al. realizaron experimentos en extractos de huevos de Xenopus laevis en 2003 para demostrar esta naturaleza histéresis. Utilizando extractos cíclicos, observaron que el umbral de activación de la Δciclina B está entre 32 y 42 nM, mientras que el umbral de inactivación está entre 16 y 24 nM de Δciclina B. Por lo tanto, estos experimentos confirmaron la biestabilidad de este sistema y la importancia de la histéresis en esta transición del ciclo celular. En las concentraciones intermedias de ciclina B, es posible tanto el estado de interfase como el estado mitótico de la célula.

Respuesta al estrés de replicación

Dado que entrar en la mitosis es un compromiso importante y costoso para la célula, es lógico que existan sistemas para evitar la entrada prematura en este paso. Se ha demostrado que los errores en pasos anteriores, como tener secciones de ADN no replicadas, bloquean la progresión en el ciclo celular. El modelo de Novak-Tyson predice que esto ocurre mediante el aumento del nivel de ciclina B necesaria para entrar en la mitosis.

Sha et al. investigaron si esto era cierto en extractos de huevos de Xenopus. Utilizaron afidicolina (APH) para inhibir la ADN polimerasa y evitar la replicación del ADN. Cuando se trató con ciclina B en interfase, el umbral de activación aumentó entre 80 y 100 nM, como predijo el modelo de Novak-Tyson. Por lo tanto, estos experimentos confirman que el estrés del ADN no replicado en la célula afecta el ciclo de histéresis y da como resultado un umbral de ciclina B mucho más alto para entrar en mitosis.

Punto de control de la metafase

El punto de control del huso mitótico se produce en el punto de la metafase en el que todos los cromosomas deberían/deberían haberse alineado en la placa mitótica y estar bajo tensión bipolar. La tensión creada por esta unión bipolar es lo que se detecta, lo que inicia la entrada en anafase. Para ello, el mecanismo de detección garantiza que el complejo promotor de anafase (APC/C) ya no esté inhibido, que ahora está libre para degradar la ciclina B, que alberga una caja D (caja de destrucción), y para descomponer la securina. Esta última es una proteína cuya función es inhibir la separasa, que a su vez corta las cohesinas, el compuesto proteico responsable de la cohesión de las cromátidas hermanas. Una vez que esta proteína inhibidora se degrada mediante ubiquitinación y posterior proteólisis, la separasa provoca la separación de las cromátidas hermanas. Después de que la célula se ha dividido en sus dos células hijas, la célula entra en G₁.

Los procesos de reparación del ADN y los puntos de control del ciclo celular se han vinculado íntimamente con el cáncer debido a sus funciones de regulación de la estabilidad del genoma y la progresión celular, respectivamente. En la mayoría de los casos, no se comprenden bien los mecanismos moleculares precisos que conectan las disfunciones en estas vías con la aparición de determinados cánceres. Se ha demostrado que la pérdida de ATM precede al desarrollo del linfoma, probablemente debido a una recombinación homóloga excesiva, lo que conduce a una alta inestabilidad genómica. La alteración de Chk1 en ratones provocó una importante desregulación de los puntos de control del ciclo celular, una acumulación de daño en el ADN y una mayor incidencia de tumorigénesis. La herencia de un solo mutante de BRCA1 o BRCA2 predispone a las mujeres a padecer cáncer de mama y de ovario. Se sabe que BRCA1 es necesario para las transiciones S y G2/M, y está involucrado en la respuesta celular al daño del ADN. Se cree que BRCA2 está involucrado en la recombinación homóloga y en la regulación del punto de control de la fase S, y las mutaciones de deficiencias en BRCA2 están fuertemente vinculadas a la tumorigénesis.