Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

prueba de sensibilidad a los antibióticos o prueba de susceptibilidad a los antibióticos es la medida de la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos. Se utiliza porque las bacterias pueden tener resistencia a algunos antibióticos. Los resultados de las pruebas de sensibilidad pueden permitir al médico cambiar la elección de antibióticos de la terapia empírica, que es cuando se selecciona un antibiótico basándose en la sospecha clínica sobre el sitio de una infección y las bacterias causantes comunes, a la terapia dirigida, en la que la elección del antibiótico es independiente. basado en el conocimiento del organismo y sus sensibilidades.

Las pruebas de sensibilidad generalmente se realizan en un laboratorio médico y utilizan métodos de cultivo que exponen las bacterias a antibióticos, o métodos genéticos que prueban si las bacterias tienen genes que confieren resistencia. Los métodos de cultivo a menudo implican medir el diámetro de áreas sin crecimiento bacteriano, llamadas zonas de inhibición, alrededor de discos de papel que contienen antibióticos en placas de cultivo de agar que han sido inoculadas uniformemente con bacterias. La concentración mínima inhibidora, que es la concentración más baja del antibiótico que detiene el crecimiento de bacterias, se puede estimar a partir del tamaño de la zona de inhibición.

Las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos han sido necesarias desde el descubrimiento de la penicilina, un antibiótico betalactámico. Los métodos iniciales fueron fenotípicos e implicaron cultivo o dilución. El Etest, una tira impregnada de antibióticos, está disponible desde la década de 1980, y métodos genéticos como las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) están disponibles desde principios de la década de 2000. Se están realizando investigaciones para mejorar los métodos actuales haciéndolos más rápidos o precisos, así como para desarrollar nuevos métodos de prueba, como los microfluidos.

Usos

En la medicina clínica, los antibióticos se prescriben con mayor frecuencia en función de los síntomas y las pautas médicas de la persona. Este método de selección de antibióticos se llama terapia empírica y se basa en el conocimiento sobre qué bacterias causan una infección y a qué antibióticos las bacterias pueden ser sensibles o resistentes. Por ejemplo, una simple infección del tracto urinario podría tratarse con trimetoprima/sulfametoxazol. Esto se debe a que Escherichia coli es la bacteria causante más probable y puede ser sensible a esa combinación de antibióticos. Sin embargo, las bacterias pueden ser resistentes a varias clases de antibióticos. Esta resistencia podría deberse a que un tipo de bacteria tiene resistencia intrínseca a algunos antibióticos, a una resistencia posterior a una exposición anterior a los antibióticos o a que la resistencia puede transmitirse desde otras fuentes, como los plásmidos. Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos proporcionan información sobre qué antibióticos tienen más probabilidades de tener éxito y, por lo tanto, deben usarse para tratar la infección.

En algunos países también se realizan pruebas de sensibilidad a los antibióticos a nivel poblacional como forma de detección. Esto tiene como objetivo evaluar las tasas de fondo de resistencia a los antibióticos (por ejemplo, con Staphylococcus aureus resistente a la meticilina) y puede influir en las directrices y medidas de salud pública.

Métodos

Una vez que se ha identificado una bacteria tras un cultivo microbiológico, se seleccionan los antibióticos para realizar pruebas de susceptibilidad. Los métodos de prueba de susceptibilidad se basan en exponer bacterias a antibióticos y observar el efecto sobre el crecimiento de las bacterias (pruebas fenotípicas) o identificar marcadores genéticos específicos (pruebas genéticas). Los métodos utilizados pueden ser cualitativos, lo que significa que un resultado indica que hay resistencia o no; o cuantitativo, utilizando una concentración mínima inhibidora (CMI) para describir la concentración de antibiótico a la que una bacteria es sensible.

Hay muchos factores que pueden afectar los resultados de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos, incluida la falla del instrumento, la temperatura, la humedad y la potencia del agente antimicrobiano. Las pruebas de control de calidad (QC) ayudan a garantizar la precisión de los resultados de las pruebas. Organizaciones como la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo y la Colección Nacional de Cultivos Tipo proporcionan cepas de bacterias con fenotipos de resistencia conocidos que pueden usarse para el control de calidad.

Métodos fenotípicos

Las pruebas basadas en la exposición de bacterias a antibióticos utilizan placas de agar o dilución en agar o caldo. La selección de antibióticos dependerá del organismo cultivado y de los antibióticos disponibles localmente. Para garantizar que los resultados sean precisos, se debe estandarizar la concentración de bacterias que se agrega al agar o caldo (el inóculo). Esto se logra comparando la turbidez de las bacterias suspendidas en solución salina o caldo con los estándares de McFarland (soluciones cuya turbidez es equivalente a la de una suspensión que contiene una concentración determinada de bacterias). Una vez que se ha alcanzado una concentración adecuada (normalmente un estándar de 0,5 McFarland), que puede determinarse mediante inspección visual o fotometría, se añade el inóculo al medio de crecimiento.

Manual

El método de difusión en disco implica seleccionar una cepa de bacterias, colocarla en una placa de agar y observar el crecimiento bacteriano cerca de discos impregnados con antibióticos. También se denomina método de Kirby-Bauer, aunque también se utilizan métodos modificados. En algunos casos, las muestras de orina o las muestras positivas de hemocultivo se aplican directamente al medio de prueba, sin pasar por el paso preliminar de aislar el organismo. Si el antibiótico inhibe el crecimiento microbiano, se ve un anillo transparente o zona de inhibición alrededor del disco. Las bacterias se clasifican como sensibles, intermedias o resistentes a un antibiótico comparando el diámetro de la zona de inhibición con umbrales definidos que se correlacionan con las CMI.

El agar Mueller-Hinton se utiliza con frecuencia en la prueba de difusión en disco. El Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) y el Comité Europeo sobre Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) proporcionan estándares para el tipo y la profundidad del agar, la temperatura de incubación y el método de análisis de los resultados. La difusión en disco se considera el método más barato y sencillo utilizado para evaluar la susceptibilidad y se adapta fácilmente a las pruebas de antibióticos o formulaciones recientemente disponibles. Algunas bacterias exigentes y de crecimiento lento no pueden analizarse con precisión con este método, mientras que otras, como las especies Streptococcus y Haemophilus influenzae, pueden analizarse pero requieren medios de crecimiento e incubación especializados. condiciones.

Los métodos de gradiente, como Etest, utilizan una tira de plástico colocada sobre agar. Se coloca una tira de plástico impregnada con diferentes concentraciones de antibióticos sobre un medio de crecimiento y el medio de crecimiento se observa después de un período de incubación. La concentración inhibidora mínima se puede identificar basándose en la intersección de la zona de inhibición en forma de lágrima con la marca en la tira. Se pueden usar varias tiras para diferentes antibióticos. Este tipo de prueba se considera una prueba de difusión.

En los métodos de dilución en agar y caldo, las bacterias se colocan en múltiples tubos pequeños con diferentes concentraciones de antibióticos. Si una bacteria es sensible o no se determina mediante inspección visual o métodos ópticos automáticos, después de un período de incubación. La dilución en caldo se considera el estándar de oro para las pruebas fenotípicas. La concentración más baja de antibióticos que inhibe el crecimiento se considera la CIM.

Automatizado

Existen sistemas automatizados que replican procesos manuales, por ejemplo, mediante el uso de imágenes y análisis de software para informar la zona de inhibición en las pruebas de difusión, o la dispensación de muestras y la determinación de los resultados en las pruebas de dilución. Los instrumentos automatizados, como los sistemas VITEK 2, BD Phoenix y Microscan, son la metodología más común para AST. Las especificaciones de cada instrumento varían, pero el principio básico implica la introducción de una suspensión bacteriana en paneles de antibióticos preformulados. Los paneles se incuban y la inhibición del crecimiento bacteriano por el antibiótico se mide automáticamente mediante metodologías como turbidimetría, espectrofotometría o detección de fluorescencia. Un sistema experto correlaciona las CIM con los resultados de susceptibilidad y los resultados se transmiten automáticamente al sistema de información del laboratorio para su validación y presentación de informes. Si bien estas pruebas automatizadas requieren menos mano de obra y están más estandarizadas que las pruebas manuales, su precisión puede ser comparativamente pobre para ciertos organismos y antibióticos, por lo que la prueba de difusión en disco sigue siendo útil como método de respaldo.

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  Panel microbiano multitarget para pruebas de sensibilidad automática. En cada pozo se coloca una pequeña cantidad de bacterias a probar, cada una de las cuales tiene los ingredientes para una prueba separada.
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  Paneles microbiales cargados en un instrumento utilizado para pruebas automatizadas de sensibilidad antibiótica de cada pozo.
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  Un trabajador de laboratorio revisa los resultados de sensibilidad mostrados en la pantalla del analizador automatizado.

Métodos genéticos

Las pruebas genéticas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los microarrays de ADN y la amplificación isotérmica mediada por bucle, se pueden utilizar para detectar si las bacterias poseen genes que confieren resistencia a los antibióticos. Un ejemplo es el uso de la PCR para detectar el gen mecA del Staphylococcus aureus resistente a betalactámicos. Otros ejemplos incluyen ensayos para probar los genes de resistencia a la vancomicina vanA y vanB en especies de Enteroccocus y la resistencia a los antibióticos en Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae y . Escherichia coli. Estas pruebas tienen la ventaja de ser directas y rápidas, en comparación con los métodos observables, y tienen una alta probabilidad de detectar un hallazgo cuando hay uno que detectar. Sin embargo, la detección de genes de resistencia no siempre coincide con el perfil de resistencia observado con el método fenotípico. Las pruebas también son caras y requieren personal específicamente capacitado.

La reacción en cadena de la polimerasa es un método para identificar genes relacionados con la susceptibilidad a los antibióticos. En el proceso de PCR, el ADN de una bacteria se desnaturaliza y las dos hebras de la doble hélice se separan. Se añaden cebadores específicos de un gen buscado a una solución que contiene el ADN y se añade una ADN polimerasa junto con una mezcla que contiene las moléculas que serán necesarias (por ejemplo, nucleótidos e iones). Si el gen relevante está presente, cada vez que se ejecute este proceso, la cantidad del gen objetivo se duplicará. Después de este proceso, la presencia de los genes se demuestra mediante una variedad de métodos que incluyen electroforesis, transferencia Southern y otros métodos de análisis de secuenciación de ADN.

Los microarrays y chips de ADN utilizan la unión de ADN complementario a un gen objetivo o una secuencia de ácido nucleico. El beneficio de esto es que se pueden evaluar múltiples genes simultáneamente.

MALDI-TOF

La espectrometría de masas por tiempo de vuelo, ionización y desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) es otro método de prueba de susceptibilidad. Se trata de una forma de espectrometría de masas de tiempo de vuelo, en la que las moléculas de una bacteria se someten a una desorción láser asistida por una matriz. Luego, las partículas ionizadas se aceleran y se registran picos espectrales, lo que produce un perfil de expresión que es capaz de diferenciar cepas bacterianas específicas después de compararlas con perfiles conocidos. Esto incluye, en el contexto de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos, cepas como la E. coli productora de beta-lactamasa. MALDI-TOF es rápido y automatizado. Sin embargo, existen limitaciones para realizar pruebas en este formato; Es posible que los resultados no coincidan con los resultados de las pruebas fenotípicas, y la adquisición y el mantenimiento son costosos.

Informes

Las bacterias se marcan como sensibles, resistentes o con resistencia intermedia a un antibiótico según la concentración mínima inhibidora (CIM), que es la concentración más baja del antibiótico que detiene el crecimiento de las bacterias. La CIM se compara con valores umbral estándar (llamados "puntos de corte") para una bacteria y un antibiótico determinados. Los puntos de corte para el mismo organismo y antibiótico pueden diferir según el sitio de la infección: por ejemplo, el CLSI generalmente define Streptococcus pneumoniae como sensible a la penicilina intravenosa si las CIM son ≤0,06 μg/ml, intermedio si las CIM son 0,12 a 1 μg/ml, y resistente si las CIM son ≥2 μg/ml, pero para los casos de meningitis, los puntos de corte son considerablemente más bajos. A veces, la marca de un antibiótico como resistente también se basa en las características bacterianas asociadas con métodos conocidos de resistencia, como el potencial de producción de beta-lactamasa. Se pueden observar patrones específicos de resistencia a los medicamentos o resistencia a múltiples medicamentos, como la presencia de una betalactamasa de espectro extendido. Esta información puede ser útil para el médico, quien puede cambiar el tratamiento empírico por un tratamiento personalizado que esté dirigido únicamente a la bacteria causante. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos realizadas durante un período de tiempo determinado se pueden compilar, generalmente en forma de tabla, para formar un antibiograma. Los antibiogramas ayudan al médico a seleccionar la mejor terapia antimicrobiana empírica en función de los patrones de resistencia locales hasta que estén disponibles los resultados de las pruebas de laboratorio.

Práctica clínica

La terapia antibiótica ideal se basa en la determinación del agente causal y su sensibilidad a los antibióticos. El tratamiento empírico suele iniciarse antes de que estén disponibles los informes microbiológicos de laboratorio. Esto podría ser para infecciones comunes o relativamente menores según las pautas clínicas (como la neumonía adquirida en la comunidad), o para infecciones graves, como la sepsis o la meningitis bacteriana, en las que retrasar el tratamiento conlleva riesgos sustanciales. La eficacia de los antibióticos individuales varía según el sitio anatómico de la infección, la capacidad del antibiótico para llegar al sitio de la infección y la capacidad de las bacterias para resistir o inactivar el antibiótico.

Lo ideal es que las muestras para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos se recojan antes de iniciar el tratamiento. Se puede tomar una muestra del sitio donde se sospecha una infección; como una muestra de hemocultivo cuando se sospecha la presencia de bacterias en el torrente sanguíneo (bacteriemia), una muestra de esputo en el caso de una neumonía o una muestra de orina en el caso de una infección del tracto urinario. A veces se pueden tomar varias muestras si la fuente de la infección no está clara. Estas muestras se transfieren al laboratorio de microbiología donde se añaden a los medios de cultivo, en los que crecen las bacterias hasta que estén presentes en cantidades suficientes para realizar las pruebas de identificación y sensibilidad.

Cuando se complete la prueba de sensibilidad a los antibióticos, informará los organismos presentes en la muestra y a qué antibióticos son susceptibles. Aunque las pruebas de sensibilidad a los antibióticos se realizan en un laboratorio (in vitro), la información proporcionada al respecto suele ser clínicamente relevante para los antibióticos en una persona (in vivo). A veces, para algunas bacterias se debe decidir si son la causa de una infección o simplemente bacterias comensales o contaminantes, como Staphylococcus epidermidis y otras infecciones oportunistas. Otras consideraciones pueden influir en la elección de los antibióticos, incluida la necesidad de penetrar hasta un sitio infectado (como un absceso) o la sospecha de que una o más causas de una infección no se detectaron en una muestra.

Historia

Desde el descubrimiento del antibiótico betalactámico penicilina, las tasas de resistencia a los antimicrobianos han aumentado. Con el tiempo, los métodos para probar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos se han desarrollado y cambiado.

Alexander Fleming desarrolló en la década de 1920 el primer método de prueba de susceptibilidad. El "método del canal" que desarrolló fue un método de difusión, que implicaba un antibiótico que se difundía a través de un canal hecho de agar. En la década de 1940, varios investigadores, incluidos Pope, Foster y Woodruff, Vincent y Vincent, utilizaron discos de papel en su lugar. Todos estos métodos implican probar únicamente la susceptibilidad a la penicilina. Los resultados fueron difíciles de interpretar y no confiables debido a resultados inexactos que no estaban estandarizados entre laboratorios.

La dilución se ha utilizado como método para cultivar e identificar bacterias desde la década de 1870, y como método para probar la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos desde 1929, también por Alexander Fleming. La forma de determinar la susceptibilidad cambió desde lo turbia de la solución, hasta el pH (en 1942), pasando por los instrumentos ópticos. El uso de tubos más grandes de "macrodilución" Las pruebas han sido reemplazadas por pruebas de "microdilución" kits.

En 1966, la Organización Mundial de la Salud confirmó el método Kirby-Bauer como el método estándar para las pruebas de susceptibilidad; Es simple, rentable y puede probar múltiples antibióticos.

El Etest fue desarrollado en 1980 por Bolmstruddlem y Eriksson, y MALDI-TOF desarrollado en la década de 2000. Desde la década de 1980 y después de ella se ha desarrollado una serie de sistemas automatizados. La PCR fue la primera prueba genética disponible y se publicó por primera vez como método para detectar la susceptibilidad a los antibióticos en 2001.

Más investigaciones

Se están desarrollando pruebas en el lugar de atención para acelerar el tiempo de realización de las pruebas y ayudar a los profesionales a evitar prescribir antibióticos innecesarios al estilo de la medicina de precisión. Las técnicas tradicionales suelen tardar entre 12 y 48 horas, aunque pueden tardar hasta cinco días. Por el contrario, las pruebas rápidas mediante diagnóstico molecular se definen como “factibles en un turno de trabajo de 8 horas”. El progreso ha sido lento debido a una variedad de razones, incluidos los costos y la regulación.

La investigación adicional se centra en las deficiencias de los métodos de prueba actuales. Además de la duración que lleva informar sobre los métodos fenotípicos, son laboriosos, tienen una portabilidad difícil y son difíciles de usar en entornos con recursos limitados, y tienen posibilidades de contaminación cruzada.

A partir de 2017, los diagnósticos de resistencia en el lugar de atención estaban disponibles para Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), Mycobacterium tuberculosis (TB) resistente a la rifampicina y enterococos resistentes a la vancomicina (VRE) a través de GeneXpert de la empresa de diagnóstico molecular Cepheid. .

Se está explorando la PCR cuantitativa, con el fin de determinar el porcentaje de una bacteria detectada que posee un gen de resistencia. También se está explorando la secuenciación del genoma completo de bacterias aisladas, y es probable que esté más disponible a medida que los costos disminuyan y la velocidad aumente con el tiempo.

Los métodos adicionales explorados incluyen microfluidos, que utilizan una pequeña cantidad de líquido y una variedad de métodos de prueba, como ópticos, electroquímicos y magnéticos. Estos ensayos no requieren mucho líquido para ser analizados, son rápidos y portátiles.

Se ha explorado el uso de tintes fluorescentes. Se trata de proteínas marcadas dirigidas a biomarcadores, secuencias de ácido nucleico presentes dentro de las células que se encuentran cuando la bacteria es resistente a un antibiótico. Se fija un aislado de bacterias en su posición y luego se disuelve. Luego, el aislado se expone a un tinte fluorescente, que será luminiscente al observarlo.

También se están explorando mejoras en las plataformas existentes, incluidas mejoras en los sistemas de imágenes que pueden identificar más rápidamente la CMI en muestras fenotípicas; o el uso de enzimas bioluminiscentes que revelan el crecimiento bacteriano para hacer que los cambios sean más fácilmente visibles.