Prueba de oxidasa

La prueba de oxidasa se utiliza para determinar si un organismo posee la enzima citocromo c oxidasa. La prueba se utiliza como ayuda para la diferenciación de las especies Neisseria, Moraxella, Campylobacter y Pasteurella (oxidasa positiva). ). También se utiliza para diferenciar pseudomonas de especies relacionadas.

Clasificación

Las cepas pueden ser oxidasa positivas (OX+) o oxidasa negativas (OX-).

BUEY+

OX+ normalmente significa que la bacteria contiene citocromo c oxidasa (también conocida como Complejo IV) y, por lo tanto, puede utilizar oxígeno para producir energía al convertir O₂ en H₂O₂ o H₂O con una cadena de transferencia de electrones.

Las Pseudomonadaceae son típicamente OX+.

Los diplococos Gram negativos Neisseria y Moraxella son oxidasa positivos.

Muchos bacilos gramnegativos curvados en espiral también son oxidasa positivos, lo que incluye Helicobacter pylori, Vibrio cholerae y Campylobacter jejuni.

Variable oxidasa

Legionella pneumophila puede ser oxidasa positiva.

BUEY-

OX- normalmente significa que la bacteria no contiene citocromo c oxidasa y, por lo tanto, no puede usar oxígeno para la producción de energía con una cadena de transferencia de electrones o emplea un citocromo diferente para transferir electrones al oxígeno.

Las enterobacterias suelen ser OX-.

Mecanismo

La prueba utiliza discos impregnados con un reactivo como N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiamina, TMPD (o N,N-dimetil-p-fenilendiamina, DMPD, que también es un indicador redox ). El reactivo es de color azul oscuro a granate cuando se oxida e incoloro cuando se reduce. Las bacterias oxidasa positivas poseen citocromo oxidasa o indofenol oxidasa (una hemoproteína que contiene hierro). Ambos catalizan el transporte de electrones desde compuestos donantes (NADH) a aceptores de electrones (normalmente oxígeno). El reactivo de prueba TMPD actúa como donador artificial de electrones para la enzima oxidasa. El reactivo oxidado forma el compuesto coloreado azul de indofenol. El sistema citocromo suele estar presente sólo en organismos aeróbicos que son capaces de utilizar oxígeno como aceptor terminal de electrones. El producto final de este metabolismo es agua o peróxido de hidrógeno (descompuesto por la catalasa).

Procedimientos

1. Mojado cada disco con unos cuatro bucles inoculados de agua deionizada.
2. Utilice un bucle para transferir de forma aséptica una gran masa de bacterias puras al disco.
3. Observa el disco hasta tres minutos. Si el área de la inoculación se convierte en azul oscuro para maroon a casi negro, entonces el resultado es positivo. Si un cambio de color no ocurre dentro de tres minutos, el resultado es negativo.

De manera alternativa, las bacterias vivas cultivadas en placas de agar tripticasa de soja se pueden preparar utilizando una técnica estéril con una inoculación en línea única. Las placas inoculadas se incuban a 37 °C durante 24 a 48 horas para establecer colonias. Se deben utilizar preparaciones bacterianas frescas. Después de que las colonias hayan crecido en el medio, se añaden 2-3 gotas del reactivo DMPD a la superficie de cada organismo que se va a analizar.

• Una prueba positiva (OX+) resultará en un violeta de cambio de color a púrpura, dentro de 10–30 segundos.
• Una prueba negativa (OX-) resultará en una horquilla ligera o ausencia de coloración.