Prueba de Kleihauer-Betke

La prueba de Kleihauer-Betke ("KB"), tinción de Kleihauer-Betke ("KB"), prueba de Kleihauer o prueba de elución ácida es un análisis de sangre que se utiliza para medir la cantidad de hemoglobina fetal transferida del feto al torrente sanguíneo de la madre. Por lo general, se realiza en madres Rh negativas para determinar la dosis requerida de inmunoglobulina Rho (D) (RhIg) para inhibir la formación de anticuerpos Rh en la madre y prevenir la enfermedad Rh en futuros niños Rh positivos. Lleva el nombre de Enno Kleihauer y Klaus Betke, quienes lo describieron en 1957.

Detalles de la prueba

La prueba KB es el método estándar para cuantificar la hemorragia materno-fetal (FMH). Aprovecha la resistencia diferencial de la hemoglobina fetal al ácido. Se prepara un frotis de sangre estándar a partir de la sangre de la madre y se expone a un baño ácido. Esto elimina la hemoglobina adulta, pero no la hemoglobina fetal, de los glóbulos rojos. La tinción posterior, utilizando el método de Shepard, hace que las células fetales (que contienen hemoglobina fetal) aparezcan de color rosa, mientras que los glóbulos rojos adultos sólo se ven como "fantasmas". Se cuentan 2.000 células bajo el microscopio y se calcula un porcentaje de células fetales y maternas.

En aquellas personas con pruebas positivas, se deben realizar pruebas de seguimiento en un control posparto para descartar la posibilidad de un falso positivo. Esto podría deberse a una hemoglobinopatía en la madre que provoca una elevación persistente de la hemoglobina fetal, p. el rasgo de células falciformes.

La comparación con otros métodos más caros o tecnológicamente avanzados, como la citometría de flujo, ha demostrado que la tinción KB, al igual que los métodos más avanzados, es sensible en la detección de FMH. Sin embargo, las publicaciones han demostrado que, en comparación con los métodos de citometría de flujo, la prueba KB sobreestima la FMH debido a resultados falsos positivos cuando hay células F presentes en la muestra de sangre materna. Los errores de conteo de fondo pueden dar lugar a estimaciones de hasta 5 ml de pérdida de sangre fetal cuando en realidad no hay tal pérdida de sangre, pero los métodos estándar disponibles en la mayoría de los laboratorios admiten una probabilidad extremadamente baja de que se produzca un falso positivo cuando se ha producido una FMH más grave. lugar.

Técnica original

Método

Se preparan frotis finos a partir de sangre capilar o venosa extraída de anticoagulantes como heparina, oxalato, citrato o EDTA. Los frotis se secan al aire entre 10 y 60 minutos, se fijan en etanol al 80 % en volumen durante 5 minutos a 20-22 °C, se enjuagan con agua del grifo y se secan al aire. Luego se sumergen las películas en tampón citrato-fosfato durante 5 minutos a 37 °C y se agitan suavemente durante aproximadamente 3 minutos. Los portaobjetos se enjuagan con agua del grifo, se secan y se tiñen con hematoxilina ácida de Ehrlich durante 3 minutos, se enjuagan con agua y se secan nuevamente. Se contratiñen con eritrosina durante 3 min. Después de un enjuague final, las películas se secan y se examinan bajo microscopía óptica.

Resultados del método original

Las células de hemoglobina F están teñidas densamente con eritrosina, las células de hemoglobina A aparecen como células fantasma, mientras que las células intermedias se tiñen más o menos de color rosa. Los reticulocitos que contienen hemoglobina A pueden aparecer como células intermedias y/o pueden mostrar granulación intracelular. Los cuerpos de inclusión (cuerpos de Heinz, cadenas α o cadenas β precipitadas) son visibles en las células eluidas como inclusiones compactas de diferentes tamaños. La hemoglobina A se eluye independientemente de si es oxihemoglobina, metahemoglobina, cianmetahemoglobina, hemoglobina reducida o carboxihemoglobina.

Cuantificación de células F de hemoglobina

Métodos desarrollados por Schneider y Ludwig y Bartsch' son recomendados. Para la determinación de la distribución intracelular de hemoglobina F, se utiliza el método semicuantitativo de Shepard, Weatherall y Conley' puede ser empleado.

Valores normales

Los valores normales de células de hemoglobina F en adultos publicados originalmente por Kleihauer fueron inferiores al 0,01 %; en los recién nacidos a término están por encima del 90%.

Usos

Estimación de la gravedad de la hemorragia feto-materna

Para determinar si una prueba positiva para FMH indica la causa probable de la muerte fetal, se debe calcular el porcentaje del volumen sanguíneo fetal total perdido, haciendo los ajustes apropiados según las siguientes relaciones conocidas:

• • el tamaño de un glóbulo rojo fetal es 1.22 veces el de un glóbulo rojo adulto;
  • se sabe que la mancha KB tiene una tasa de éxito media del 92% en la detección de glóbulos rojos fetales;
  • en una mujer a largo plazo o a corto plazo en su embarazo, el volumen medio de glóbulos rojos materno es de aproximadamente 1800 ml;
  • el hematocrito fetal medio es 50%; y
  • el volumen de sangre fetal medio es ${\displaystyle 150{\frac {ml}{kg}}$

Estas restricciones se pueden aplicar para obtener la fórmula

${\displaystyle PFB={\frac {(3200)}{(FW)}}}$

dónde

• • ${\displaystyle PFB}$ es el porcentaje de sangre fetal perdida;
  • ${\displaystyle ¡Función!$ es el número observado de glóbulos rojos fetales;
  • ${\displaystyle MC!$ es el número observado de glóbulos rojos maternales (N.B. tenemos que ${\displaystyle MC=TC-FC}$, donde ${\displaystyle TC}$ es el número total observado de glóbulos rojos, tanto materno como fetal;
  • ${\displaystyle FW!$ es el peso del feto en kilos.

Número de viales de RhD

Una estimación del número necesario de viales de inmunoglobulina Rho(D) puede asumir las siguientes ecuaciones:

• Volumen (mL) de sangre fetal = % células fetales x 50
• Número de viales de 300 mcg RhIG requerido = Volumen de sangre fetal/30mL

Combinar esas dos ecuaciones resulta en:

• Número de viales = % de células fetales x 50 / 30

Esto es aproximadamente igual a:

• Número de viales = % de células fetales x 1.7

Prácticamente, si el número a la derecha del punto decimal es ≥5, se redondea hacia arriba para agregar un vial.

Resolución de la muerte fetal

Supongamos que una mancha KB se realiza y ${\displaystyle TC=5000}$ Se observan glóbulos rojos totales, ${\displaystyle FC=200}$ de los cuales se encuentran como glóbulos rojos fetales. Supongamos además que el peso del feto que se está examinando es ${\displaystyle FW=2.0kg}$. Entonces concluiríamos que el porcentaje total de sangre fetal perdida es aproximadamente:

${\displaystyle PFB={\frac {(3200)}{(FW)}={\frac {\frac {(3200)}{(2.0)}={\frac {200}=}= {3}=66.667}} {\fnunció]$

a cinco dígitos importantes. Por lo tanto, concluiríamos que el feto examinado perdió 66,667% (dos tercios) de su sangre a través del FMH. Generalmente, el parto es muy probable para cualquier valor ${\displaystyle PFB\geq 20}$, en particular si el feto pierde abruptamente esta mucha sangre; en este ejemplo, es probable que se sospeche que el FMH es la causa del parto. Es importante señalar, sin embargo, que tal diagnóstico todavía no es completamente concluyente; los fetos que pierden grandes cantidades de sangre durante largos períodos de tiempo son capaces de compensar esta pérdida de sangre más lenta; ya que la mancha KB no nos dice nada con respecto al nivel de agudeza del FMH. Esto significa que no es posible correlacionar completamente una mancha KB positiva y alta ${\displaystyle PFB}$ con un parto, aunque en muchos casos, dada otra información, como complicaciones hereditarias conocidas del embarazo, coeficientes de correlación extremadamente positivos ${\displaystyle r\approx +1.000}$ se han observado entre el FMH y el parto.

Problemas de detección de glóbulos rojos fetales

Dado que las células sanguíneas fetales y maternas tienen la misma esperanza de vida en el torrente sanguíneo materno, es posible obtener resultados informativos de una tinción KB durante un período de tiempo considerable después de una muerte fetal. Sin embargo, si la madre y el feto son incompatibles ABO, es más crucial realizar rápidamente la tinción KB después de una muerte fetal, ya que los glóbulos rojos fetales se eliminarán rápidamente del torrente sanguíneo materno, lo que hará que la tinción KB subestime el grado de FMH. , Si alguna. En la literatura se ha expresado mucha preocupación sobre los falsos positivos cuando el muestreo se realiza después del parto. En general esto no es un problema. El parto da como resultado una mayor frecuencia de detección de microhemorragias, pero esto no debería confundir la interpretación de la FMH como una posible causa de muerte fetal. No es necesario extraer la muestra antes de la inducción, el inicio del trabajo de parto, el alumbramiento, la expulsión de la placenta, etc., a pesar de lo que afirma alguna literatura publicada. Sin embargo, si se va a utilizar la cesárea, no extraer la muestra antes dará como resultado una tasa de falsos positivos del 2%.

Finalmente, cualquier cosa que cause la persistencia de la hemoglobina fetal en las células sanguíneas maternas hará que la interpretación sea mucho más complicada. Ciertas hemoglobinopatías, la más común de las cuales es el rasgo falciforme, hacen esto. En general, entre el 1% y el 3% de las veces esto podría dar lugar a una interpretación falsa.

Todos los casos de trauma materno

Un artículo publicado en 2004 concluyó que una prueba de Kleihauer-Betke (KB) es necesaria en todos los casos de traumatismo materno, ya que la evaluación clínica no es lo suficientemente sensible para determinar el riesgo de parto prematuro. Predice con precisión el riesgo de parto prematuro después de un traumatismo materno, mientras que el artículo concluyó que la evaluación clínica no lo hace. Con una prueba KB negativa, la duración de la monitorización fetal electrónica postraumática puede limitarse de forma segura. Con una prueba KB positiva, el riesgo significativo de parto prematuro exige un seguimiento detallado. La prueba KB tiene ventajas importantes para todas las víctimas de traumatismos maternos, independientemente del estado de Rh.