Prueba de Kastle-Meyer

La prueba de Kastle-Meyer es un análisis de sangre presuntivo, descrito por primera vez en 1903, en el que se utiliza el indicador químico fenolftaleína para detectar la posible presencia de hemoglobina. Se basa en la actividad similar a la peroxidasa de la hemoglobina en la sangre para catalizar la oxidación de la fenolftalina (la forma reducida incolora de la fenolftaleína) en fenolftaleína, que es visible como un color rosa brillante. La prueba de Kastle-Meyer es una forma de análisis de sangre catalítico, una de las dos clases principales de pruebas forenses comúnmente empleadas por los laboratorios criminalísticos para la identificación química de la sangre. La otra clase de pruebas utilizadas para este propósito son las pruebas de microcristales, como la prueba de cristales de Teichmann y la prueba de cristales de Takayama.

La prueba lleva el nombre del químico agrícola estadounidense Joseph Hoeing Kastle (1864-1916), quien en 1901 inventó y probó el análisis de sangre crudo, y del médico y químico alemán Erich Meyer (1874-1927), quien modificó la prueba en 1903.

Historia

En 1901, Joseph Hoeing Kastle y Oliver March Shedd en los EE. UU. descubrieron que el material biológico podía causar la oxidación de la fenolftalina a fenolftaleína en soluciones ligeramente alcalinas. En 1903, Erich Meyer en Alemania descubrió que las células sanguíneas también podían desencadenar la reacción. En 1906, Kastle y Amoss descubrieron que la hemoglobina de los pollos en la sangre desencadenaba la reacción. En 1909, Kastle descubrió que la prueba era sensible a muestras de sangre muy diluidas. Sin embargo, en 1908, Pozzi-Escot (que para entonces vivía en Lima, Perú) descubrió que la prueba producía reacciones falsas positivas en respuesta a varias sustancias además de la sangre.

Método

Primero se recolecta una supuesta muestra de sangre con un hisopo. Se añade una gota de reactivo de fenolftaleína a la muestra y, después de unos segundos, se aplica una gota de peróxido de hidrógeno al hisopo. Si el hisopo se vuelve rosado rápidamente, se dice que la prueba es presuntamente positiva para sangre. Esperar períodos superiores a 30 segundos hará que la mayoría de los hisopos se vuelvan rosados de forma natural, ya que se oxidan por sí solos en el aire.

Opcionalmente, el hisopo se puede tratar primero con una gota de etanol para lisar las células presentes y ganar mayor sensibilidad y especificidad. Esta prueba no es destructiva para la muestra, que puede conservarse y utilizarse en pruebas posteriores en el laboratorio; sin embargo, pocos laboratorios utilizarían el hisopo utilizado para la prueba de Kastle-Meyer en otras pruebas, optando en su lugar por utilizar un hisopo nuevo de la tinción original.

Limitaciones

Si bien se ha informado que la prueba de Kastle-Meyer puede detectar diluciones de sangre de hasta 1:10⁷, la prueba tiene una serie de limitaciones importantes. Los oxidantes químicos, como las sales de cobre y níquel, harán que el reactivo de Kastle-Meyer se vuelva rosado antes de agregar el peróxido de hidrógeno, por lo que es de vital importancia agregar el reactivo primero, luego esperar unos segundos y luego agregar el peróxido de hidrógeno.

La prueba de Kastle-Meyer tiene la misma reacción con la sangre humana que con cualquier otra sangre basada en hemoglobina, por lo que se debe realizar una prueba de confirmación como la prueba de Ouchterlony para concluir definitivamente de qué especie se originó la sangre.

Las pruebas catalíticas de color son muy sensibles, pero no específicas. La prueba de color positiva por sí sola no debe interpretarse como prueba positiva de sangre. Un resultado negativo generalmente es prueba de la ausencia de cantidades detectables de hemo, sin embargo se puede generar un falso negativo en presencia de un agente reductor. La prueba no puede dar evidencia específica de lo que hay en la sangre.

Mecanismo

La fenolftaleína utilizada en esta prueba ha sido modificada de su forma convencional, ya que ha sido reducida por dos electrones y está predisuelta en una solución alcalina. Esto generalmente se logra hirviendo una solución alcalina de fenolftaleína con zinc en polvo, lo que reduce la fenolftaleína a fenolftalina. Tras la reducción, el color rosa muy intenso de la forma catiónica de fenolftaleína se desvanece hasta convertirse en un color amarillo pálido. Es esta forma de fenolftaleína la que está presente en los kits de prueba de Kastle-Meyer. Para generar el color rosa intenso que indica una prueba positiva, la fenolftaleína reducida debe oxidarse para volver a su forma coloreada normal.

En la reacción correspondiente, el peróxido de hidrógeno reacciona con la hemoglobina de la sangre. La fenolftaleína no participa directamente en este proceso; en cambio, actúa como una fuente externa de electrones. En su reacción con el peróxido de hidrógeno, el centro hemo de la hemoglobina se comporta como una peroxidasa, reduciendo el peróxido a agua. Esta actividad agota los electrones de la hemoglobina que, a su vez, son reabastecidos por la fenolftaleína. La donación de electrones a la hemoglobina convierte la fenolftalina nuevamente en fenolftaleína de color intenso. Mientras la enzima sobreviva, la reacción del hemo con el peróxido es catalítica, lo que hace que esta prueba sea muy sensible a pequeñas cantidades de sangre presentes en el hisopo de prueba. La reducción de peróxido catalizada por hemoglobina que se produce se muestra en la siguiente reacción. Los dos electrones son suministrados por la fenolftaleína:

HOOH + 2 e⁻ + 2 H⁺ → 2 H₂O

El consumo de protones durante el curso de la reacción tiene el efecto de elevar el pH de la solución, pero la cantidad de base producida es insignificante en comparación con la cantidad de base ya presente en la mezcla de reactivos.

Otras fuentes

• Culliford, Bryan J., El examen y la clasificación de manchas de sangre en el Laboratorio del Crimen, Washington, D.C.: U.S. Government Printing Office, 1971.
• Gaensslen, Robert E., Sourcebook in Forensic Serology, Immunology and Biochemistry, Washington, D.C.: U.S. Government Printing Office, 1983.
• Kirk, Paul L., Crime Investigation, John Wiley e Hijo, 1974.
• Metropolitan Police Forensic Science Laboratory, Biology Methods Manual, 1978.
• Ponce, Ana Castelló; Pascual, Fernando A. Verdú, "Revisión Crítica de Pruebas Presuntivas para Sangre", Forensic Science Communications, vol. 1, No. 2, julio de 1999, págs. 1 a 15.
• Saferstein, Richard, Forensic Science Handbook, Prentice Hall, Inc., 1982