Prueba de biuret

En química, la prueba de Biuret (IPA:), también conocida como prueba de Piotrowski, es una prueba química que se utiliza para detectar la presencia de al menos Dos enlaces peptídicos en una molécula. En presencia de péptidos, un ion cobre(II) forma complejos de coordinación de color malva en una solución alcalina. La reacción se observó por primera vez en 1833; En Polonia, la prueba de Biuret también se conoce como prueba de Piotrowski en honor al fisiólogo polaco Gustaw Piotrowski [ pl] quien lo redescubrió de forma independiente en 1857. Se han desarrollado varias variantes de la prueba, como la prueba BCA y la prueba de Lowry modificada.

La reacción de biuret se puede utilizar para evaluar la concentración de proteínas porque los enlaces peptídicos se producen con la misma frecuencia por aminoácido en el péptido. La intensidad del color y, por tanto, la absorción a 540 nm, es directamente proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Beer-Lambert.

A pesar de su nombre, el reactivo no contiene biuret [(H₂N−CO−)< sub class="template-chem2-sub">2NH]. La prueba se llama así porque también da una reacción positiva a los enlaces peptídicos en la molécula de biuret.

En este ensayo, el cobre (II) se une a los átomos de nitrógeno presentes en los péptidos de las proteínas. En una reacción secundaria, el cobre (II) se reduce a cobre (I). Los tampones, como Tris y amoníaco, interfieren con este ensayo, por lo que lo hacen inadecuado para muestras de proteínas purificadas a partir de precipitación con sulfato de amonio. Debido a su insensibilidad y poca interferencia de los aminoácidos libres, este ensayo es más útil para muestras de tejido completo y otras fuentes con alta concentración de proteínas.

Una muestra acuosa se trata con un volumen igual de una base fuerte al 1 % (hidróxido de sodio o potasio) seguido de unas gotas de sulfato de cobre (II) acuoso. Si la solución se vuelve violeta, contiene proteínas. Se pueden determinar entre 5 y 160 mg/ml. Se necesitan péptidos con la longitud correcta de al menos 3 aminoácidos para lograr un cambio de color significativo y mensurable con estos reactivos.

El reactivo de Biuret está compuesto por hidróxido de sodio (NaOH) y sulfato de cobre (II) hidratado, junto con tartrato de potasio y sodio, este último se añade para quelar y así estabilizar los iones cúpricos. La reacción de los iones cúpricos con los átomos de nitrógeno implicados en los enlaces peptídicos conduce al desplazamiento de los átomos de hidrógeno peptídico en condiciones alcalinas. Una quelación tridentada o tetradentada con el nitrógeno peptídico produce el color característico. Esto se encuentra con los dipéptidos.

El reactivo se usa comúnmente en el ensayo de proteína biuret, una prueba colorimétrica utilizada para determinar la concentración de proteína mediante espectroscopía UV/VIS a una longitud de onda de 540 nm.

Dos modificaciones importantes de la prueba de biuret se aplican comúnmente en el análisis colorimétrico moderno de péptidos: el ensayo del ácido bicinconínico (BCA) y el ensayo de Lowry. En estas pruebas, el Cu⁺ formado durante la reacción de biuret reacciona aún más con otros reactivos, dando lugar a un color más intenso.

En la prueba BCA, Cu⁺ forma un complejo de color púrpura intenso con el ácido bicinconínico (BCA), que se absorbe alrededor de 562 nm, produciendo el color malva característico. El complejo BCA/cobre soluble en agua se absorbe mucho más fuertemente que el complejo péptido/cobre, aumentando la sensibilidad de la prueba de biuret en un factor de alrededor de 100: el ensayo BCA permite detectar proteínas en el rango de 0,0005 a 2 mg/ml ). Además, el ensayo de proteínas BCA brinda el importante beneficio de la compatibilidad con sustancias como hasta un 5 % de tensioactivos en muestras de proteínas.

En el ensayo de proteínas de Lowry, el Cu⁺ se oxida nuevamente a Cu²⁺ mediante el Mo^VI en el reactivo de Folin-Ciocalteu, que forma azul de molibdeno (Mo^IV). En estas circunstancias, los restos de tirosina de la proteína también forman azul de molibdeno. De esta forma se pueden detectar proteínas en concentraciones entre 0,005 y 2 mg/mL. El azul de molibdeno, a su vez, puede unirse a ciertos colorantes orgánicos como el verde de malaquita y la auramina O, lo que da como resultado una mayor amplificación de la señal.

• Oro. 1990. Compuestos orgánicos en sistemas biológicos, 2a edición. John Wiley & Sons, Inc.
• Reagentes químicos