Proteosoma

Los proteosomas o proteasomas son complejos proteicos que degradan proteínas innecesarias o dañadas mediante proteólisis, una reacción química que rompe los enlaces peptídicos. Las enzimas que ayudan a tales reacciones se llaman proteasas.

Los proteosomas son parte de un mecanismo importante por el cual las células regulan la concentración de proteínas particulares y degradan las proteínas mal plegadas. Las proteínas se etiquetan para su degradación con una pequeña proteína llamada ubiquitina. La reacción de marcado es catalizada por enzimas llamadas ligasas de ubiquitina. Una vez que una proteína se etiqueta con una sola molécula de ubiquitina, esta es una señal para que otras ligasas se adhieran a moléculas de ubiquitina adicionales. El resultado es una cadena de poliubiquitina que se une al proteasoma, lo que le permite degradar la proteína etiquetada. El proceso de degradación produce péptidos de aproximadamente siete a ocho aminoácidos de largo, que luego pueden degradarse aún más en secuencias de aminoácidos más cortas y usarse para sintetizar nuevas proteínas.

Los proteosomas se encuentran dentro de todos los eucariotas y arqueas, y en algunas bacterias. En eucariotas, los proteosomas se encuentran tanto en el núcleo como en el citoplasma.

En estructura, el proteasoma es un complejo cilíndrico que contiene un "núcleo" de cuatro anillos apilados que forman un poro central. Cada anillo está compuesto por siete proteínas individuales. Los dos anillos internos están formados por siete subunidades β que contienen de tres a siete sitios activos de proteasa. Estos sitios están ubicados en la superficie interior de los anillos, por lo que la proteína objetivo debe ingresar al poro central antes de que se degrade. Los dos anillos exteriores contienen cada uno siete subunidades α cuya función es mantener una "puerta" a través de la cual las proteínas ingresan al barril. Estas subunidades α se controlan al unirse a estructuras de "tapa" o partículas reguladoras.que reconocen etiquetas de poliubiquitina unidas a sustratos proteicos e inician el proceso de degradación. El sistema general de ubiquitinación y degradación proteosomal se conoce como sistema ubiquitina-proteasoma.

La vía de degradación proteasómica es esencial para muchos procesos celulares, incluido el ciclo celular, la regulación de la expresión génica y las respuestas al estrés oxidativo. La importancia de la degradación proteolítica dentro de las células y el papel de la ubiquitina en las vías proteolíticas se reconoció en la concesión del Premio Nobel de Química de 2004 a Aaron Ciechanover, Avram Hershko e Irwin Rose.

Descubrimiento

Antes del descubrimiento del sistema ubiquitina-proteasoma, se pensaba que la degradación de proteínas en las células dependía principalmente de los lisosomas, orgánulos unidos a la membrana con interiores ácidos y llenos de proteasa que pueden degradar y luego reciclar proteínas exógenas y orgánulos envejecidos o dañados. Sin embargo, el trabajo de Joseph Etlinger y Alfred L. Goldberg en 1977 sobre la degradación de proteínas dependiente de ATP en reticulocitos, que carecen de lisosomas, sugirió la presencia de un segundo mecanismo de degradación intracelular. En 1978 se demostró que estaba compuesto por varias cadenas proteicas distintas, una novedad entre las proteasas de la época.El trabajo posterior sobre la modificación de las histonas condujo a la identificación de una modificación covalente inesperada de la proteína histona mediante un enlace entre una cadena lateral de lisina de la histona y el residuo de glicina C-terminal de la ubiquitina, una proteína que no tenía ninguna función conocida. Luego se descubrió que una proteína previamente identificada asociada con la degradación proteolítica, conocida como factor de proteólisis dependiente de ATP 1 (APF-1), era la misma proteína que la ubiquitina. Las actividades proteolíticas de este sistema se aislaron como un complejo multiproteico llamado originalmente complejo de proteinasa multicatalítica por Sherwin Wilk y Marion Orlowski. Más tarde, se descubrió el complejo proteolítico dependiente de ATP que era responsable de la degradación de proteínas dependientes de ubiquitina y se denominó proteasoma 26S.

Gran parte del trabajo inicial que condujo al descubrimiento del sistema de proteasoma de ubiquitina ocurrió a fines de la década de 1970 y principios de la de 1980 en el Technion en el laboratorio de Avram Hershko, donde Aaron Ciechanover trabajó como estudiante de posgrado. El año sabático de Hershko en el laboratorio de Irwin Rose en el Fox Chase Cancer Center proporcionó conocimientos conceptuales clave, aunque Rose luego restó importancia a su papel en el descubrimiento. Los tres compartieron el Premio Nobel de Química 2004 por su trabajo en el descubrimiento de este sistema.

Aunque los datos de microscopía electrónica que revelaron la estructura de anillos apilados del proteasoma estuvieron disponibles a mediados de la década de 1980, la cristalografía de rayos X no resolvió la primera estructura de la partícula central del proteasoma hasta 1994. En 2018, las primeras estructuras atómicas del ser humano La holoenzima del proteasoma 26S en complejo con un sustrato proteico poliubiquitilado se resolvió mediante microscopía electrónica criogénica, lo que reveló los mecanismos por los cuales el proteosoma 26S humano reconoce, desubiquitila, desdobla y degrada el sustrato.

Estructura y organización

Los subcomponentes del proteasoma a menudo se denominan por su coeficiente de sedimentación de Svedberg (denotado S). El proteosoma que se usa más exclusivamente en mamíferos es el proteasoma citosólico 26S, que tiene una masa molecular de aproximadamente 2000 kilodaltons (kDa) y contiene una subunidad de proteína 20S y dos subunidades de tapa reguladora 19S. El núcleo es hueco y proporciona una cavidad cerrada en la que se degradan las proteínas; las aberturas en los dos extremos del núcleo permiten que entre la proteína objetivo. Cada extremo de la partícula central se asocia con una subunidad reguladora 19S que contiene múltiples sitios activos de ATPasa y sitios de unión a ubiquitina; es esta estructura la que reconoce las proteínas poliubiquitinadas y las transfiere al núcleo catalítico.Una forma alternativa de subunidad reguladora llamada partícula 11S puede asociarse con el núcleo esencialmente de la misma manera que la partícula 19S; el 11S puede desempeñar un papel en la degradación de péptidos extraños, como los que se producen después de la infección por un virus.

Partícula de núcleo 20S

El número y diversidad de subunidades contenidas en la partícula central 20S depende del organismo; el número de subunidades distintas y especializadas es mayor en los organismos multicelulares que en los unicelulares y mayor en los eucariotas que en los procariotas. Todas las partículas 20S constan de cuatro estructuras de anillos heptaméricos apilados que a su vez se componen de dos tipos diferentes de subunidades; Las subunidades α son de naturaleza estructural, mientras que las subunidades β son predominantemente catalíticas. Las subunidades α son pseudoenzimas homólogas a las subunidades β. Se ensamblan con sus extremos N adyacentes a los de las subunidades β.Los dos anillos exteriores de la pila constan de siete subunidades α cada uno, que sirven como dominios de acoplamiento para las partículas reguladoras y las subunidades alfa N-terminales (Pfam PF10584) forman una puerta que bloquea el acceso no regulado de los sustratos a la cavidad interior. Cada uno de los dos anillos internos consta de siete subunidades β y en sus extremos N contienen los sitios activos de proteasa que realizan las reacciones de proteólisis. Se identificaron tres actividades catalíticas distintas en el complejo purificado: hidrolización de péptido similar a quimotripsina, similar a tripsina y peptidilglutamil-péptido.El tamaño del proteosoma está relativamente conservado y es de unos 150 angstroms (Å) por 115 Å. La cámara interior tiene como máximo 53 Å de ancho, aunque la entrada puede ser tan estrecha como 13 Å, lo que sugiere que las proteínas del sustrato deben estar al menos parcialmente desplegadas para entrar.

En arqueas como Thermoplasma acidophilum, todas las subunidades α y β son idénticas, mientras que los proteasomas eucariotas como los de la levadura contienen siete tipos distintos de cada subunidad. En los mamíferos, las subunidades β1, β2 y β5 son catalíticas; aunque comparten un mecanismo común, tienen tres especificidades de sustrato distintas consideradas similares a la quimotripsina, similares a la tripsina e hidrolización del péptido peptidil-glutamil (PHGH). Las formas β alternativas denominadas β1i, β2i y β5i pueden expresarse en células hematopoyéticas en respuesta a la exposición a señales proinflamatorias como citoquinas, en particular, interferón gamma. El proteasoma ensamblado con estas subunidades alternativas se conoce como inmunoproteasoma., cuya especificidad de sustrato está alterada en relación con el proteasoma normal. Recientemente, se identificó un proteasoma alternativo en células humanas que carecen de la subunidad central α3. Estos proteosomas (conocidos como proteosomas α4-α4) forman partículas centrales 20S que contienen una subunidad α4 adicional en lugar de la subunidad α3 faltante. Estos proteasomas 'α4-α4' alternativos se sabía que existían previamente en la levadura. Aunque la función precisa de estas isoformas de proteasoma aún se desconoce en gran medida, las células que expresan estos proteasomas muestran una mayor resistencia a la toxicidad inducida por iones metálicos como el cadmio.

Partícula reguladora 19S

La partícula 19S en eucariotas consta de 19 proteínas individuales y es divisible en dos subconjuntos, una base de 9 subunidades que se une directamente al anillo α de la partícula central 20S y una tapa de 10 subunidades. Seis de las nueve proteínas base son subunidades de ATPasa de la familia AAA, y existe un homólogo evolutivo de estas ATPasas en las arqueas, llamado PAN (nucleotidasa activadora de proteasoma).La asociación de las partículas 19S y 20S requiere la unión de ATP a las subunidades 19S ATPasa, y se requiere la hidrólisis de ATP para que el complejo ensamblado degrade las proteínas plegadas y ubiquitinadas. Tenga en cuenta que solo el paso del despliegue del sustrato requiere energía de la hidrólisis de ATP, mientras que la unión de ATP por sí sola puede respaldar todos los demás pasos necesarios para la degradación de proteínas (p. ej., ensamblaje complejo, apertura de puertas, translocación y proteólisis). De hecho, la unión del ATP a las ATPasas por sí misma favorece la rápida degradación de las proteínas desplegadas. Sin embargo, mientras que la hidrólisis de ATP se requiere solo para el desdoblamiento, aún no está claro si esta energía puede usarse en el acoplamiento de algunos de estos pasos.

En 2012, dos esfuerzos independientes aclararon la arquitectura molecular del proteasoma 26S mediante microscopía electrónica de partículas individuales. En 2016, tres esfuerzos independientes determinaron la primera estructura de resolución casi atómica del proteasoma 26S humano en ausencia de sustratos mediante crio-EM. En 2018, un gran esfuerzo ha esclarecido los mecanismos detallados de la desubiquitilación, el inicio de la translocación y el despliegue progresivo de sustratos mediante la determinación simultánea de siete estructuras atómicas del proteasoma 26S acoplado al sustrato.En el corazón del 19S, directamente adyacente al 20S, se encuentran las ATPasas AAA (proteínas AAA) que se ensamblan en un anillo heterohexamérico del orden Rpt1/Rpt2/Rpt6/Rpt3/Rpt4/Rpt5. Este anillo es un trímero de dímeros: Rpt1/Rpt2, Rpt6/Rpt3 y Rpt4/Rpt5 se dimerizan a través de sus bobinas en espiral N-terminal. Estas bobinas enrolladas sobresalen del anillo hexamerico. Las partículas reguladoras más grandes que no son ATPasas, Rpn1 y Rpn2, se unen a las puntas de Rpt1/2 y Rpt6/3, respectivamente. El receptor de ubiquitina Rpn13 se une a Rpn2 y completa el complejo base cub. La tapa cubre la mitad del hexámero AAA-ATPasa (Rpt6/Rpt3/Rpt4) e, inesperadamente, contacta directamente con el 20S a través de Rpn6 y, en menor medida, Rpn5. Las subunidades Rpn9, Rpn5, Rpn6, Rpn7, Rpn3 y Rpn12, que están relacionados estructuralmente entre sí y con las subunidades del complejo COP9 y eIF3 (por lo tanto, denominadas subunidades PCI) se ensamblan en una estructura similar a una herradura que encierra el heterodímero Rpn8/Rpn11. Rpn11, la enzima desubiquitinante, se coloca en la boca del hexámero AAA-ATPasa, en una posición ideal para eliminar los restos de ubiquitina inmediatamente antes de la translocación de sustratos en el 20S. El segundo receptor de ubiquitina identificado hasta la fecha, Rpn10, se ubica en la periferia del párpado, cerca de las subunidades Rpn8 y Rpn9.

Cambios conformacionales de 19S

La partícula reguladora 19S dentro de la holoenzima del proteasoma 26S se ha observado en seis estados conformacionales muy diferentes en ausencia de sustratos hasta la fecha. Un sello distintivo de la configuración AAA-ATPasa en este estado predominante de baja energía es una disposición en forma de escalera o arandela de seguridad de los dominios AAA. En presencia de ATP pero ausencia de sustrato, se adoptan tres conformaciones alternativas menos abundantes del 19S que difieren principalmente en el posicionamiento de la tapa con respecto al módulo AAA-ATPasa. En presencia de ATP-γS o un sustrato, se han observado considerablemente más conformaciones que muestran cambios estructurales dramáticos del módulo AAA-ATPasa.Algunas de las conformaciones unidas al sustrato tienen una gran similitud con las que no tienen sustrato, pero no son completamente idénticas, particularmente en el módulo AAA-ATPasa. Antes del ensamblaje 26S, la partícula reguladora 19S en forma libre también se ha observado en siete estados conformacionales. En particular, todos estos confórmeros son algo diferentes y presentan características distintas. Por lo tanto, la partícula reguladora 19S puede muestrear al menos 20 estados conformacionales en diferentes condiciones fisiológicas.

Regulación del 20S por el 19S

La partícula reguladora 19S es responsable de estimular la 20S para degradar proteínas. Una función principal de las ATPasas reguladoras del 19S es abrir la puerta en el 20S que bloquea la entrada de sustratos a la cámara de degradación. El mecanismo por el cual la ATPasa proteasómica abre esta puerta ha sido aclarado recientemente.La apertura de la puerta 20S y, por lo tanto, la degradación del sustrato, requiere los extremos C de las ATPasas proteasómicas, que contienen un motivo específico (es decir, el motivo HbYX). Los extremos C de las ATPasas se unen a los bolsillos en la parte superior del 20S y unen el complejo ATPasa al complejo proteolítico 20S, uniendo así el equipo de despliegue del sustrato con la maquinaria de degradación del 20S. La unión de estos terminales C en estos bolsillos 20S por sí mismos estimula la apertura de la puerta en el 20S de la misma manera que una "llave en una cerradura" abre una puerta.El mecanismo preciso por el cual funciona este mecanismo de "llave en una cerradura" se ha dilucidado estructuralmente en el contexto del proteasoma 26S humano con una resolución casi atómica, lo que sugiere que la inserción de cinco extremos C de las subunidades ATPasa Rpt1/2/ Se requieren 3/5/6 en los bolsillos de superficie 20S para abrir completamente la puerta 20S.

Otras partículas reguladoras

Los proteasomas 20S también pueden asociarse con un segundo tipo de partícula reguladora, la partícula reguladora 11S, una estructura heptamérica que no contiene ATPasas y puede promover la degradación de péptidos cortos pero no de proteínas completas. Se supone que esto se debe a que el complejo no puede desplegar sustratos más grandes. Esta estructura también se conoce como PA28, REG o PA26. Los mecanismos por los cuales se une a la partícula central a través de las colas C-terminales de sus subunidades e induce cambios conformacionales del anillo α para abrir la puerta 20S sugieren un mecanismo similar para la partícula 19S. La expresión de la partícula 11S es inducida por el interferón gamma y es responsable, junto con las subunidades β del inmunoproteasoma, de la generación de péptidos que se unen al complejo mayor de histocompatibilidad.

Otro tipo más de partícula reguladora no ATPasa es la Blm10 (levadura) o PA200/PSME4 (humano). Abre solo una subunidad α en la puerta 20S y se pliega en una cúpula con un poro muy pequeño sobre ella.

Asamblea

El ensamblaje del proteasoma es un proceso complejo debido a la cantidad de subunidades que deben asociarse para formar un complejo activo. Las subunidades β se sintetizan con "propéptidos" N-terminales que se modifican después de la traducción durante el ensamblaje de la partícula 20S para exponer el sitio proteolítico activo. La partícula 20S se ensambla a partir de dos semiproteosomas, cada uno de los cuales consta de un anillo pro-β de siete miembros unido a un anillo α de siete miembros. La asociación de los anillos β de los dos semiproteasomas desencadena la autolisis de los propéptidos dependiente de treonina para exponer el sitio activo. Estas interacciones β están mediadas principalmente por puentes salinos e interacciones hidrofóbicas entre hélices alfa conservadas cuya interrupción por mutación daña la capacidad de ensamblaje del proteasoma.El ensamblaje de los semiproteosomas, a su vez, se inicia con el ensamblaje de las subunidades α en su anillo heptamérico, formando una plantilla para la asociación del anillo pro-β correspondiente. No se ha caracterizado el ensamblaje de las subunidades α.

Solo recientemente, el proceso de ensamblaje de la partícula reguladora 19S se ha dilucidado en gran medida. La partícula reguladora 19S se ensambla como dos subcomponentes distintos, la base y la tapa. El ensamblaje del complejo base es facilitado por cuatro chaperones de ensamblaje, Hsm3/S5b, Nas2/p27, Rpn14/PAAF1 y Nas6/gankyrin (nombres para levaduras/mamíferos).Estas chaperonas de ensamblaje se unen a las subunidades AAA-ATPasa y su función principal parece ser asegurar el ensamblaje adecuado del anillo heterohexamérico AAA-ATPasa. Hasta la fecha, todavía se debate si el complejo base se ensambla por separado, si el ensamblaje está moldeado por la partícula central 20S o si existen vías de ensamblaje alternativas. Además de las cuatro chaperonas de ensamblaje, la enzima desubiquitinadora Ubp6/Usp14 también promueve el ensamblaje de bases, pero no es esencial. La tapa se ensambla por separado en un orden específico y no requiere chaperones de ensamblaje.

Proceso de degradación de proteínas

Ubiquitinación y focalización

Las proteínas son el objetivo de la degradación por el proteosoma con la modificación covalente de un residuo de lisina que requiere las reacciones coordinadas de tres enzimas. En el primer paso, una enzima activadora de ubiquitina (conocida como E1) hidroliza el ATP y adenila una molécula de ubiquitina. Esto luego se transfiere al residuo de cisteína del sitio activo de E1 junto con la adenilación de una segunda ubiquitina.Esta ubiquitina adenilada se transfiere luego a una cisteína de una segunda enzima, la enzima conjugadora de ubiquitina (E2). En el último paso, un miembro de una clase muy diversa de enzimas conocidas como ligasas de ubiquitina (E3) reconoce la proteína específica que se va a ubiquitinar y cataliza la transferencia de ubiquitina de E2 a esta proteína objetivo. Una proteína diana debe marcarse con al menos cuatro monómeros de ubiquitina (en forma de cadena de poliubiquitina) antes de que la tapa del proteasoma la reconozca. Por lo tanto, es el E3 el que confiere especificidad de sustrato a este sistema. La cantidad de proteínas E1, E2 y E3 expresadas depende del organismo y el tipo de célula, pero hay muchas enzimas E3 diferentes presentes en los humanos, lo que indica que hay una gran cantidad de objetivos para el sistema de proteasoma de ubiquitina.

El mecanismo por el cual una proteína poliubiquitinada se dirige al proteasoma no se comprende completamente. Algunas instantáneas de alta resolución del proteasoma unido a una proteína poliubiquitinada sugieren que los receptores de ubiquitina podrían coordinarse con la deubiquitinasa Rpn11 para la orientación y el compromiso inicial del sustrato. Las proteínas receptoras de ubiquitina tienen un dominio N-terminal similar a la ubiquitina (UBL) y uno o más dominios asociados a la ubiquitina (UBA). Los dominios UBL son reconocidos por las tapas del proteasoma 19S y los dominios UBA se unen a la ubiquitina a través de haces de tres hélices. Estas proteínas receptoras pueden acompañar a las proteínas poliubiquitinadas al proteasoma, aunque los detalles de esta interacción y su regulación no están claros.

La proteína ubiquitina en sí tiene 76 aminoácidos de largo y recibió su nombre debido a su naturaleza ubicua, ya que tiene una secuencia altamente conservada y se encuentra en todos los organismos eucariotas conocidos. Los genes que codifican la ubiquitina en eucariotas están dispuestos en repeticiones en tándem, posiblemente debido a las fuertes demandas de transcripción de estos genes para producir suficiente ubiquitina para la célula. Se ha propuesto que la ubiquitina es la proteína de evolución más lenta identificada hasta la fecha. La ubiquitina contiene siete residuos de lisina a los que se puede ligar otra ubiquitina, lo que da como resultado diferentes tipos de cadenas de poliubiquitina. Las cadenas en las que cada ubiquitina adicional está unida a la lisina 48 de la ubiquitina anterior tienen un papel en la orientación del proteasoma, mientras que otros tipos de cadenas pueden estar involucradas en otros procesos.

Despliegue y translocación

Una vez que se ha ubiquitinado una proteína, la partícula reguladora 19S la reconoce en un paso de unión dependiente de ATP. La proteína sustrato debe entonces entrar en el interior de la partícula 20S para entrar en contacto con los sitios proteolíticos activos. Debido a que el canal central de la partícula 20S es estrecho y está cerrado por las colas N-terminales de las subunidades del anillo α, los sustratos deben desplegarse al menos parcialmente antes de que ingresen al núcleo. El paso del sustrato desplegado al núcleo se denomina translocación y necesariamente ocurre después de la desubiquitinación. Sin embargo, el orden en que se desubiquitinan y despliegan los sustratos aún no está claro.Cuál de estos procesos es el paso limitante de la velocidad en la reacción de proteólisis general depende del sustrato específico; para algunas proteínas, el proceso de despliegue limita la velocidad, mientras que la desubiquitinación es el paso más lento para otras proteínas. Se sugiere que la medida en que los sustratos deben desplegarse antes de la translocación es de alrededor de 20 residuos de aminoácidos por la estructura atómica del proteasoma 26S acoplado al sustrato en el estado compatible con la desubiquitilación, pero una estructura terciaria sustancial y, en particular, interacciones no locales como el disulfuro enlaces, son suficientes para inhibir la degradación. También se ha propuesto la presencia de segmentos de proteína intrínsecamente desordenados de tamaño suficiente, ya sea en el extremo de la proteína o internamente, para facilitar el inicio eficaz de la degradación.

La puerta formada por las subunidades α evita que los péptidos de más de cuatro residuos entren en el interior de la partícula 20S. Las moléculas de ATP unidas antes del paso de reconocimiento inicial se hidrolizan antes de la translocación. Si bien se necesita energía para el despliegue del sustrato, no se requiere para la translocación. El proteasoma 26S ensamblado puede degradar proteínas desplegadas en presencia de un análogo de ATP no hidrolizable, pero no puede degradar proteínas plegadas, lo que indica que la energía de la hidrólisis de ATP se utiliza para el desdoblamiento del sustrato. El paso del sustrato desplegado a través de la puerta abierta se produce mediante difusión facilitada si la tapa 19S está en el estado unido a ATP.

El mecanismo para el despliegue de las proteínas globulares es necesariamente general, pero algo dependiente de la secuencia de aminoácidos. Se ha demostrado que las secuencias largas de glicina y alanina alternantes inhiben el despliegue del sustrato, lo que reduce la eficiencia de la degradación proteasómica; esto da como resultado la liberación de subproductos parcialmente degradados, posiblemente debido al desacoplamiento de los pasos de hidrólisis y desarrollo del ATP. Tales repeticiones de glicina-alanina también se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, en la fibroína de seda; en particular, ciertos productos genéticos del virus de Epstein-Barr que tienen esta secuencia pueden detener el proteasoma, lo que ayuda a que el virus se propague al evitar la presentación de antígenos en el complejo principal de histocompatibilidad.

Proteólisis

El proteasoma funciona como una endoproteasa. El mecanismo de proteólisis por parte de las subunidades β de la partícula central 20S es a través de un ataque nucleofílico dependiente de treonina. Este mecanismo puede depender de una molécula de agua asociada para la desprotonación del hidroxilo de treonina reactivo. La degradación ocurre dentro de la cámara central formada por la asociación de los dos anillos β y normalmente no libera productos parcialmente degradados, sino que reduce el sustrato a polipéptidos cortos típicamente de 7 a 9 residuos de largo, aunque pueden variar de 4 a 25 residuos, dependiendo de el organismo y el sustrato. El mecanismo bioquímico que determina la longitud del producto no está completamente caracterizado.Aunque las tres subunidades β catalíticas tienen un mecanismo común, tienen especificidades de sustrato ligeramente diferentes, que se consideran similares a la quimotripsina, similares a la tripsina y similares a la hidrólisis del péptido peptidil-glutamil (PHGH). Estas variaciones en la especificidad son el resultado de contactos interatómicos con residuos locales cerca de los sitios activos de cada subunidad. Cada subunidad β catalítica también posee un residuo de lisina conservado necesario para la proteólisis.

Aunque el proteasoma normalmente produce fragmentos peptídicos muy cortos, en algunos casos estos productos son en sí mismos moléculas biológicamente activas y funcionales. Ciertos factores de transcripción que regulan la expresión de genes específicos, incluido un componente del complejo de mamíferos NF-κB, se sintetizan como precursores inactivos cuya ubiquitinación y posterior degradación proteasómica los convierte en una forma activa. Dicha actividad requiere que el proteasoma escinda internamente la proteína sustrato, en lugar de degradarla procesivamente desde un extremo. Se ha sugerido que los bucles largos en la superficie de estas proteínas sirven como sustratos proteasómicos y entran en la cavidad central, mientras que la mayoría de la proteína permanece fuera.Se han observado efectos similares en proteínas de levadura; este mecanismo de degradación selectiva se conoce como procesamiento dependiente de ubiquitina/proteasoma regulado (RUP).

Degradación independiente de ubiquitina

Aunque la mayoría de los sustratos proteasómicos deben ubiquitinarse antes de degradarse, existen algunas excepciones a esta regla general, especialmente cuando el proteasoma desempeña un papel normal en el procesamiento postraduccional de la proteína. La activación proteasómica de NF-κB mediante el procesamiento de p105 en p50 mediante proteólisis interna es un ejemplo importante. Algunas proteínas que se supone que son inestables debido a regiones intrínsecamente no estructuradas, se degradan de manera independiente a la ubiquitina. El ejemplo más conocido de sustrato de proteasoma independiente de ubiquitina es la enzima ornitina descarboxilasa. También se han informado mecanismos independientes de ubiquitina que se dirigen a reguladores clave del ciclo celular como p53, aunque p53 también está sujeto a degradación dependiente de ubiquitina.Finalmente, las proteínas estructuralmente anormales, mal plegadas o altamente oxidadas también están sujetas a degradación independiente de ubiquitina e independiente de 19S en condiciones de estrés celular.

Evolución

El proteasoma 20S es ubicuo y esencial en eucariotas y arqueas. El orden bacteriano Actinomycetales también comparte homólogos del proteasoma 20S, mientras que la mayoría de las bacterias poseen genes de choque térmico hslV y hslU, cuyos productos genéticos son una proteasa multimérica dispuesta en un anillo de dos capas y una ATPasa. Se ha planteado la hipótesis de que la proteína hslV se parece al probable antepasado del proteasoma 20S. En general, HslV no es esencial en las bacterias, y no todas las bacterias lo poseen, mientras que algunos protistas poseen los sistemas 20S y hslV. Muchas bacterias también poseen otros homólogos del proteasoma y una ATPasa asociada, sobre todo ClpP y ClpX. Esta redundancia explica por qué el sistema HslUV no es imprescindible.

El análisis de secuencia sugiere que las subunidades β catalíticas divergieron antes en la evolución que las subunidades α predominantemente estructurales. En las bacterias que expresan un proteasoma 20S, las subunidades β tienen una identidad de secuencia alta con las subunidades β de arqueas y eucariotas, mientras que la identidad de secuencia α es mucho menor. La presencia de proteosomas 20S en bacterias puede resultar de la transferencia lateral de genes, mientras que la diversificación de subunidades entre eucariotas se atribuye a múltiples eventos de duplicación de genes.

Control del ciclo celular

La progresión del ciclo celular está controlada por la acción ordenada de las quinasas dependientes de ciclina (CDK), activadas por ciclinas específicas que delimitan las fases del ciclo celular. Las ciclinas mitóticas, que persisten en la célula durante solo unos minutos, tienen una de las vidas más cortas de todas las proteínas intracelulares. Una vez que un complejo CDK-ciclina ha realizado su función, la ciclina asociada es poliubiquitinada y destruida por el proteasoma, que proporciona direccionalidad al ciclo celular. En particular, la salida de la mitosis requiere la disociación dependiente del proteasoma del componente regulador ciclina B del complejo del factor promotor de la mitosis. En las células de vertebrados, puede ocurrir un "deslizamiento" a través del punto de control mitótico que conduce a la salida prematura de la fase M a pesar del retraso de esta salida por el punto de control del huso.

Los puntos de control del ciclo celular anteriores, como el punto de control posterior a la restricción entre la fase G ₁ y la fase S, implican de manera similar la degradación proteasomal de la ciclina A, cuya ubiquitinación es promovida por el complejo promotor de la anafase (APC), una ubiquitina ligasa E3. El APC y el complejo proteico Skp1/Cul1/F-box (complejo SCF) son los dos reguladores clave de la degradación de las ciclinas y el control del punto de control; el propio SCF está regulado por el APC a través de la ubiquitinación de la proteína adaptadora, Skp2, que impide la actividad del SCF antes de la transición G1-S.

Los componentes individuales de la partícula 19S tienen sus propias funciones reguladoras. Gankyrin, una oncoproteína recientemente identificada, es uno de los subcomponentes 19S que también se une fuertemente a la quinasa dependiente de ciclina CDK4 y juega un papel clave en el reconocimiento de p53 ubiquitinado, a través de su afinidad por la ubiquitina ligasa MDM2. La ganquirina es antiapoptótica y se ha demostrado que se sobreexpresa en algunos tipos de células tumorales, como el carcinoma hepatocelular.

Al igual que los eucariotas, algunas arqueas también usan el proteasoma para controlar el ciclo celular, específicamente controlando la división celular mediada por ESCRT-III.

Regulación del crecimiento vegetal

En las plantas, la señalización de las auxinas, o fitohormonas que ordenan la dirección y el tropismo del crecimiento de la planta, induce la selección de una clase de represores de factores de transcripción conocidos como proteínas Aux/IAA para la degradación proteasómica. Estas proteínas son ubiquitinadas por SCFTIR1 o SCF en complejo con el receptor de auxina TIR1. La degradación de las proteínas Aux/IAA desreprime los factores de transcripción en la familia del factor de respuesta de auxina (ARF) e induce la expresión génica dirigida por ARF. Las consecuencias celulares de la activación de ARF dependen del tipo de planta y la etapa de desarrollo, pero están involucradas en la dirección del crecimiento en las raíces y las nervaduras de las hojas. Se cree que la respuesta específica a la desrepresión de ARF está mediada por la especificidad en el emparejamiento de proteínas ARF y Aux/IAA individuales.

Apoptosis

Tanto las señales internas como las externas pueden conducir a la inducción de apoptosis o muerte celular programada. La deconstrucción resultante de los componentes celulares se lleva a cabo principalmente por proteasas especializadas conocidas como caspasas, pero el proteasoma también desempeña funciones importantes y diversas en el proceso apoptótico. La participación del proteasoma en este proceso está indicada tanto por el aumento en la ubiquitinación de proteínas como por las enzimas E1, E2 y E3 que se observa mucho antes de la apoptosis. Durante la apoptosis, también se ha observado que los proteasomas localizados en el núcleo se trasladan a ampollas en la membrana externa características de la apoptosis.

La inhibición del proteasoma tiene diferentes efectos sobre la inducción de la apoptosis en diferentes tipos de células. En general, el proteasoma no es necesario para la apoptosis, aunque su inhibición es proapoptótica en la mayoría de los tipos de células que se han estudiado. La apoptosis está mediada por la interrupción de la degradación regulada de las proteínas del ciclo celular favorables al crecimiento. Sin embargo, algunas líneas celulares, en particular, cultivos primarios de células inactivas y diferenciadas, como timocitos y neuronas, no pueden sufrir apoptosis al exponerse a los inhibidores del proteasoma. El mecanismo de este efecto no está claro, pero se supone que es específico de las células en estado de reposo o que resulta de la actividad diferencial de la quinasa proapoptótica JNK.La capacidad de los inhibidores del proteosoma para inducir la apoptosis en células que se dividen rápidamente se ha aprovechado en varios agentes quimioterapéuticos desarrollados recientemente, como bortezomib y salinosporamida A.

Respuesta al estrés celular

En respuesta al estrés celular, como infección, choque térmico o daño oxidativo, se expresan proteínas de choque térmico que identifican proteínas mal plegadas o desplegadas y las dirigen para la degradación proteosomal. Tanto la proteína chaperona Hsp27 como la Hsp90 se han implicado en el aumento de la actividad del sistema ubiquitina-proteasoma, aunque no son participantes directos en el proceso. Hsp70, por otro lado, se une a parches hidrofóbicos expuestos en la superficie de proteínas mal plegadas y recluta ligasas de ubiquitina E3 como CHIP para etiquetar las proteínas para la degradación proteasomal. La proteína CHIP (terminal carboxilo de la proteína que interactúa con Hsp70) se regula mediante la inhibición de las interacciones entre la enzima E3 CHIP y su pareja de unión E2.

Existen mecanismos similares para promover la degradación de proteínas dañadas oxidativamente a través del sistema de proteosomas. En particular, los proteasomas localizados en el núcleo están regulados por PARP y degradan activamente las histonas oxidadas de manera inapropiada. Las proteínas oxidadas, que a menudo forman grandes agregados amorfos en la célula, pueden ser degradadas directamente por la partícula central 20S sin la tapa reguladora 19S y no requieren hidrólisis de ATP ni marcado con ubiquitina. Sin embargo, los altos niveles de daño oxidativo aumentan el grado de entrecruzamiento entre los fragmentos de proteínas, lo que hace que los agregados sean resistentes a la proteólisis. Los números y tamaños más grandes de tales agregados altamente oxidados están asociados con el envejecimiento.

La desregulación del sistema de proteasoma de ubiquitina puede contribuir a varias enfermedades neurales. Puede conducir a tumores cerebrales como los astrocitomas. En algunas de las enfermedades neurodegenerativas de inicio tardío que comparten la agregación de proteínas mal plegadas como una característica común, como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, se pueden formar grandes agregados insolubles de proteínas mal plegadas y luego provocar neurotoxicidad, a través de mecanismos que aún no se conocen bien.. Se ha sugerido que la disminución de la actividad del proteasoma es la causa de la agregación y la formación de cuerpos de Lewy en el Parkinson. Esta hipótesis está respaldada por la observación de que los modelos de levadura de la enfermedad de Parkinson son más susceptibles a la toxicidad de la α-sinucleína, el principal componente proteico de los cuerpos de Lewy, en condiciones de baja actividad del proteosoma.La actividad proteasómica deteriorada puede ser la base de trastornos cognitivos como los trastornos del espectro autista y enfermedades musculares y nerviosas como la miopatía por cuerpos de inclusión.

Papel en el sistema inmunológico

El proteasoma desempeña un papel sencillo pero fundamental en la función del sistema inmunitario adaptativo. Los antígenos peptídicos son mostrados por las proteínas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC) en la superficie de las células presentadoras de antígenos. Estos péptidos son productos de la degradación proteasómica de proteínas originadas por el patógeno invasor. Aunque los proteasomas expresados ​​constitutivamente pueden participar en este proceso, un complejo especializado compuesto por proteínas, cuya expresión es inducida por el interferón gamma, son los principales productores de péptidos que son óptimos en tamaño y composición para la unión al MHC. Estas proteínas cuya expresión aumenta durante la respuesta inmune incluyen la partícula reguladora 11S, cuyo principal papel biológico conocido es regular la producción de ligandos MHC, y subunidades β especializadas llamadas β1i, β2i, y β5i con especificidad de sustrato alterada. El complejo formado con las subunidades β especializadas se conoce comoinmunoproteasoma. Otra subunidad variante β5i, β5t, se expresa en el timo, lo que da lugar a un "timoproteasoma" específico del timo cuya función aún no está clara.

La fuerza de la unión del ligando del MHC de clase I depende de la composición del extremo C del ligando, ya que los péptidos se unen mediante puentes de hidrógeno y mediante contactos estrechos con una región denominada "bolsillo B" en la superficie del MHC. Muchos alelos del MHC de clase I prefieren residuos C-terminales hidrofóbicos, y es más probable que el complejo de inmunoproteasoma genere C-terminales hidrofóbicos.

Debido a su papel en la generación de la forma activada de NF-κB, un regulador antiapoptótico y proinflamatorio de la expresión de citoquinas, la actividad proteasómica se ha relacionado con enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Los niveles elevados de actividad del proteosoma se correlacionan con la actividad de la enfermedad y se han implicado en enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide.

El proteasoma también participa en la proteolisis mediada por anticuerpos intracelulares de viriones unidos a anticuerpos. En esta vía de neutralización, TRIM21 (una proteína de la familia de motivos tripartitos) se une a la inmunoglobulina G para dirigir el virión al proteasoma donde se degrada.

Inhibidores del proteasoma

Los inhibidores del proteasoma tienen una actividad antitumoral eficaz en el cultivo celular, induciendo la apoptosis al interrumpir la degradación regulada de las proteínas del ciclo celular que favorecen el crecimiento. Este enfoque de inducir selectivamente la apoptosis en células tumorales ha demostrado su eficacia en modelos animales y ensayos en humanos.

La lactacistina, un producto natural sintetizado por la bacteria Streptomyces, fue el primer inhibidor del proteasoma no peptídico descubierto y se usa ampliamente como herramienta de investigación en bioquímica y biología celular. La lactacistina se autorizó a Myogenics/Proscript, que fue adquirida por Millennium Pharmaceuticals, ahora parte de Takeda Pharmaceuticals. La lactacistina modifica covalentemente la treonina amino-terminal de las subunidades β catalíticas del proteasoma, particularmente la subunidad β5 responsable de la actividad similar a la quimotripsina del proteasoma. Este descubrimiento ayudó a establecer el proteasoma como una nueva clase mecánica de proteasa: una treonina proteasa amino-terminal.

Bortezomib (Boronated MG132), una molécula desarrollada por Millennium Pharmaceuticals y comercializada como Velcade, es el primer inhibidor del proteasoma que alcanza el uso clínico como agente de quimioterapia. Bortezomib se usa en el tratamiento del mieloma múltiple. En particular, se ha observado que el mieloma múltiple da como resultado un aumento de los niveles de péptidos derivados del proteasoma en el suero sanguíneo que disminuyen a niveles normales en respuesta a una quimioterapia exitosa. Los estudios en animales han indicado que bortezomib también puede tener efectos clínicamente significativos en el cáncer de páncreas. Se han iniciado estudios preclínicos y clínicos preliminares para examinar la eficacia de bortezomib en el tratamiento de otros cánceres relacionados con las células B, en particular algunos tipos de linfoma no Hodgkin.Los resultados clínicos también parecen justificar el uso del inhibidor del proteasoma combinado con quimioterapia, para la leucemia linfoblástica aguda de células B. Los inhibidores del proteasoma pueden matar algunos tipos de células leucémicas cultivadas que son resistentes a los glucocorticoides.

La molécula ritonavir, comercializada como Norvir, se desarrolló como un inhibidor de la proteasa y se usó para atacar la infección por VIH. Sin embargo, se ha demostrado que inhibe los proteasomas así como las proteasas libres; para ser específicos, la actividad similar a la quimotripsina del proteasoma es inhibida por ritonavir, mientras que la actividad similar a la tripsina aumenta un poco. Los estudios en modelos animales sugieren que el ritonavir puede tener efectos inhibitorios sobre el crecimiento de las células de glioma.

Los inhibidores del proteasoma también se han mostrado prometedores en el tratamiento de enfermedades autoinmunes en modelos animales. Por ejemplo, los estudios en ratones con injertos de piel humana encontraron una reducción en el tamaño de las lesiones de la psoriasis después del tratamiento con un inhibidor del proteasoma. Los inhibidores también muestran efectos positivos en modelos de asma en roedores.

El etiquetado y la inhibición del proteasoma también son de interés en entornos de laboratorio para el estudio tanto in vitro como in vivo de la actividad proteasomal en las células. Los inhibidores de laboratorio más utilizados son la lactacistina y el péptido aldehído MG132 desarrollado inicialmente por el laboratorio Goldberg. También se han desarrollado inhibidores fluorescentes para marcar específicamente los sitios activos del proteasoma ensamblado.

Significación clínica

El proteasoma y sus subunidades tienen importancia clínica por al menos dos razones: (1) un ensamblaje complejo comprometido o un proteasoma disfuncional pueden estar asociados con la fisiopatología subyacente de enfermedades específicas, y (2) pueden explotarse como dianas farmacológicas para fines terapéuticos. intervenciones. Más recientemente, se han realizado más esfuerzos para considerar el proteasoma para el desarrollo de nuevas estrategias y marcadores de diagnóstico. Una comprensión mejorada y completa de la fisiopatología del proteasoma debería dar lugar a aplicaciones clínicas en el futuro.

Los proteasomas forman un componente fundamental para el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) y el control de calidad de proteínas (PQC) celular correspondiente. La ubiquitinación de proteínas y la subsiguiente proteólisis y degradación por parte del proteasoma son mecanismos importantes en la regulación del ciclo celular, el crecimiento y la diferenciación celular, la transcripción de genes, la transducción de señales y la apoptosis. Posteriormente, un ensamblaje y función del complejo de proteasoma comprometidos conducen a actividades proteolíticas reducidas y la acumulación de especies de proteínas dañadas o mal plegadas. Tal acumulación de proteínas puede contribuir a la patogénesis y características fenotípicas en enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, respuestas inflamatorias y enfermedades autoinmunes. y respuestas sistémicas al daño del ADN que conducen a tumores malignos.

Varios estudios clínicos y experimentales han indicado que las aberraciones y desregulaciones del UPS contribuyen a la patogenia de varios trastornos neurodegenerativos y miodegenerativos, que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Pick, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, y enfermedades de las neuronas motoras, enfermedades poliglutamina (PolyQ), distrofias musculares y varias formas raras de enfermedades neurodegenerativas asociadas con la demencia. Como parte del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), el proteasoma mantiene la homeostasis de las proteínas cardíacas y, por lo tanto, desempeña un papel importante en la lesión isquémica cardíaca, la hipertrofia ventricular y la insuficiencia cardíaca.Además, se está acumulando evidencia de que el UPS juega un papel esencial en la transformación maligna. La proteólisis de UPS juega un papel importante en las respuestas de las células cancerosas a las señales estimulantes que son fundamentales para el desarrollo del cáncer. En consecuencia, la expresión génica por degradación de factores de transcripción, como p53, c-jun, c-Fos, NF-κB, c-Myc, HIF-1α, MATα2, STAT3, proteínas de unión a elementos reguladas por esteroles y receptores de andrógenos son todos controlados por la UPS y, por lo tanto, involucrados en el desarrollo de diversas neoplasias malignas.Además, el UPS regula la degradación de los productos de genes supresores de tumores, como la poliposis coli adenomatosa (APC) en el cáncer colorrectal, el retinoblastoma (Rb). y el supresor de tumores de von Hippel-Lindau (VHL), así como una serie de protooncogenes (Raf, Myc, Myb, Rel, Src, Mos, ABL). El UPS también está involucrado en la regulación de las respuestas inflamatorias. Esta actividad suele atribuirse al papel de los proteasomas en la activación de NF-κB que regula aún más la expresión de citoquinas proinflamatorias como TNF-α, IL-β, IL-8, moléculas de adhesión (ICAM-1, VCAM-1, P-selectina) y prostaglandinas y óxido nítrico (NO). Además, el UPS también juega un papel en las respuestas inflamatorias como reguladores de la proliferación de leucocitos, principalmente a través de la proteólisis de ciclinas y la degradación de los inhibidores de CDK.Por último, los pacientes con enfermedades autoinmunes con LES, síndrome de Sjögren y artritis reumatoide (AR) exhiben predominantemente proteosomas circulantes que pueden aplicarse como biomarcadores clínicos.