Producción de proteínas

El dogma central que describe la transcripción del código de ADN al código de ARN a las proteínas en el segundo paso que cubre la producción de proteínas.

La producción de proteínas es el proceso biotecnológico de generar una proteína específica. Por lo general, se logra mediante la manipulación de la expresión génica en un organismo de modo que exprese grandes cantidades de un gen recombinante. Esto incluye la transcripción del ADN recombinante a ARN mensajero (ARNm), la traducción del ARNm en cadenas polipeptídicas, que finalmente se pliegan en proteínas funcionales y pueden dirigirse a ubicaciones subcelulares o extracelulares específicas.

Los sistemas de producción de proteínas (también conocidos como sistemas de expresión) se utilizan en las ciencias biológicas, la biotecnología y la medicina. La investigación en biología molecular utiliza numerosas proteínas y enzimas, muchas de las cuales provienen de sistemas de expresión; en particular, ADN polimerasa para PCR, transcriptasa inversa para análisis de ARN, endonucleasas de restricción para clonación y para producir proteínas que se analizan en el descubrimiento de fármacos como dianas biológicas o como fármacos potenciales. También existen aplicaciones significativas para los sistemas de expresión en la fermentación industrial, en particular la producción de productos biofarmacéuticos como la insulina humana para tratar la diabetes y para fabricar enzimas.

Sistemas de producción de proteínas

Los sistemas de producción de proteínas comúnmente utilizados incluyen los derivados de bacterias, levaduras, baculovirus/insectos, células de mamíferos y, más recientemente, hongos filamentosos como Myceliophthora thermophila. Cuando los productos biofarmacéuticos se producen con uno de estos sistemas, las impurezas relacionadas con el proceso denominadas proteínas de la célula huésped también llegan al producto final en cantidades mínimas.

Sistemas basados en células

Los sistemas de expresión más antiguos y más utilizados están basados en células y pueden definirse como la combinación de un vector de expresión, su ADN clonado y el huésped del vector que proporciona un contexto para permitir función de genes extraños en una célula huésped, es decir, producir proteínas a un alto nivel". La sobreexpresión es un nivel anormal y excesivamente alto de expresión génica que produce un fenotipo pronunciado relacionado con los genes.

Hay muchas formas de introducir ADN extraño en una célula para su expresión, y se pueden usar muchas células huésped diferentes para la expresión; cada sistema de expresión tiene distintas ventajas y desventajas. Normalmente se hace referencia a los sistemas de expresión por el huésped y la fuente de ADN o el mecanismo de entrega del material genético. Por ejemplo, los huéspedes comunes son bacterias (como E.coli, B. subtilis), levaduras (como S.cerevisiae) o eucariotas. líneas celulares. Las fuentes comunes de ADN y los mecanismos de entrega son virus (como baculovirus, retrovirus, adenovirus), plásmidos, cromosomas artificiales y bacteriófagos (como lambda). El mejor sistema de expresión depende del gen involucrado, por ejemplo, la Saccharomyces cerevisiae suele preferirse para las proteínas que requieren una modificación postraduccional significativa. Las líneas celulares de insectos o mamíferos se utilizan cuando se requiere un empalme de ARNm similar al humano. No obstante, la expresión bacteriana tiene la ventaja de producir fácilmente grandes cantidades de proteína, que se requiere para la cristalografía de rayos X o los experimentos de resonancia magnética nuclear para la determinación de la estructura.

Debido a que las bacterias son procariotas, no están equipadas con la maquinaria enzimática completa para lograr las modificaciones postraduccionales o el plegamiento molecular necesarios. Por lo tanto, las proteínas eucariotas multidominio expresadas en bacterias a menudo no son funcionales. Además, muchas proteínas se vuelven insolubles como cuerpos de inclusión que son difíciles de recuperar sin desnaturalizantes agresivos y el engorroso replegamiento de proteínas subsiguiente.

Para abordar estas preocupaciones, se desarrollaron sistemas de expresión que utilizan múltiples células eucariotas para aplicaciones que requieren que las proteínas se conformen o se acerquen más a los organismos eucariotas: se transfectan células de plantas (es decir, tabaco), de insectos o mamíferos (es decir, bovinos). con genes y cultivados en suspensión e incluso como tejidos u organismos completos, para producir proteínas completamente plegadas. Sin embargo, los sistemas de expresión in vivo de mamíferos tienen un bajo rendimiento y otras limitaciones (demora de tiempo, toxicidad para las células huésped,...). Para combinar el alto rendimiento/productividad y las características proteicas escalables de bacterias y levaduras, y características epigenéticas avanzadas de sistemas de plantas, insectos y mamíferos, se desarrollan otros sistemas de producción de proteínas utilizando eucariotas unicelulares (es decir, 'Leishmania no patógena). ' células).

Sistemas bacterianos

Escherichia coli

E. coli, uno de los anfitriones más populares para la expresión del gen artificial.

E. coli es uno de los huéspedes de expresión más utilizados, y el ADN normalmente se introduce en un vector de expresión de plásmido. Las técnicas de sobreexpresión en E. coli están bien desarrollados y funcionan aumentando el número de copias del gen o aumentando la fuerza de unión de la región promotora, lo que ayuda a la transcripción.

Por ejemplo, una secuencia de ADN para una proteína de interés podría clonarse o subclonarse en un plásmido de alto número de copias que contiene el promotor lac (a menudo LacUV5), que luego se transforma en la bacteria E. coli. La adición de IPTG (un análogo de lactosa) activa el promotor lac y hace que las bacterias expresen la proteína de interés.

E. coli cepa BL21 y BL21(DE3) son dos cepas comúnmente utilizadas para la producción de proteínas. Como miembros del linaje B, carecen de las proteasas lon y OmpT, protegiendo a las proteínas producidas de la degradación. El profago DE3 que se encuentra en BL21 (DE3) proporciona la polimerasa de ARN T7 (impulsada por el promotor LacUV5), lo que permite utilizar vectores con el promotor T7 en su lugar.

Corinebacteria

Las especies no patógenas de la Corynebacterium grampositiva se utilizan para la producción comercial de varios aminoácidos. El C. glutamicum se utiliza ampliamente para producir glutamato y lisina, componentes de alimentos para humanos, alimentos para animales y productos farmacéuticos.

La expresión del factor de crecimiento epidérmico humano funcionalmente activo se ha realizado en C. glutamicum, demostrando así un potencial para la producción a escala industrial de proteínas humanas. Las proteínas expresadas pueden ser el objetivo de la secreción a través de la ruta secretora general (Sec) o la ruta de translocación de arginina gemela (Tat).

A diferencia de las bacterias gramnegativas, las Corynebacterium grampositivas carecen de lipopolisacáridos que funcionan como endotoxinas antigénicas en humanos.

Pseudomonas fluorescens

La bacteria no patógena y gramnegativa, Pseudomonas fluorescens, se utiliza para la producción de alto nivel de proteínas recombinantes; comúnmente para el desarrollo de bioterapéuticos y vacunas. P. fluorescens es un organismo metabólicamente versátil, lo que permite una detección de alto rendimiento y un rápido desarrollo de proteínas complejas. P. fluorescens es más conocido por su capacidad para producir de manera rápida y exitosa altos títulos de proteína soluble activa.

Sistemas eucariotas

Levadura

Sistemas de expresión que utilizan S. cerevisiae o Pichia pastoris permiten la producción estable y duradera de proteínas que se procesan de manera similar a las células de mamíferos, con un alto rendimiento, en medios de proteínas químicamente definidos.

Hongos filamentosos

Los hongos filamentosos, especialmente Aspergillus y Trichoderma, pero también más recientemente Myceliophthora thermophila C1 se han desarrollado en plataformas de expresión para la detección y producción de diversas enzimas industriales. El sistema de expresión C1 muestra una morfología de baja viscosidad en cultivo sumergido, lo que permite el uso de medios de cultivo y producción complejos.

Células infectadas con baculovirus

Las células de insecto infectadas con baculovirus (cepas Sf9, Sf21, High Five) o células de mamífero (HeLa, HEK 293) permiten la producción de proteínas glicosiladas o de membrana que no se pueden producir mediante sistemas fúngicos o bacterianos. Es útil para la producción de proteínas en gran cantidad. Los genes no se expresan continuamente porque las células huésped infectadas eventualmente se lisan y mueren durante cada ciclo de infección.

Expresión de células de insecto no lítica

La expresión de células de insectos no líticas es una alternativa al sistema de expresión de baculovirus líticos. En la expresión no lítica, los vectores se transfectan de forma transitoria o estable en el ADN cromosómico de células de insectos para la expresión génica posterior. A esto le sigue la selección y cribado de clones recombinantes. El sistema no lítico se ha utilizado para proporcionar un mayor rendimiento de proteínas y una expresión más rápida de genes recombinantes en comparación con la expresión de células infectadas con baculovirus. Las líneas celulares utilizadas para este sistema incluyen: Sf9, Sf21 de células Spodoptera frugiperda, Hi-5 de células Trichoplusia ni y células Schneider 2 y Schneider 3 de Células de Drosophila melanogaster. Con este sistema, las células no se lisan y se pueden utilizar varios modos de cultivo. Además, las corridas de producción de proteínas son reproducibles. Este sistema da un producto homogéneo. Un inconveniente de este sistema es el requisito de un paso de cribado adicional para seleccionar clones viables.

Excavata

Leishmania tarentolae (no puede infectar a los mamíferos) permiten la producción estable y duradera de proteínas con un alto rendimiento, en medios químicamente definidos. Las proteínas producidas exhiben modificaciones postraduccionales totalmente eucarióticas, incluida la glicosilación y la formación de enlaces disulfuro.

Sistemas de mamíferos

Los sistemas de expresión de mamíferos más comunes son las células de ovario de hámster chino (CHO) y de riñón embrionario humano (HEK).

• Celda de ovario hamster chino
• Linfooblstoide de mieloma de ratón (por ejemplo, célula NS0)
• Fully Human
  • Células renales embrionarias humanas (HEK-293)
  • Células embrionarias humanas (Crucell Per.C6)
  • Células de amniocitis humana (Glycotope y CEVEC)

Sistemas sin células

La producción de proteínas sin células se realiza in vitro utilizando ARN polimerasa purificada, ribosomas, ARNt y ribonucleótidos. Estos reactivos pueden producirse por extracción de células o de un sistema de expresión basado en células. Debido a los bajos niveles de expresión y al alto costo de los sistemas sin células, los sistemas basados en células se usan más ampliamente.