Proceso de Cohn

El proceso Cohn, desarrollado por Edwin J. Cohn, es una serie de pasos de purificación cuyo objetivo es extraer albúmina del plasma sanguíneo. El proceso se basa en la solubilidad diferencial de la albúmina y otras proteínas plasmáticas en función del pH, la concentración de etanol, la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de proteínas. La albúmina tiene la mayor solubilidad y el punto isoeléctrico más bajo de todas las principales proteínas plasmáticas. Esto la convierte en el producto final que se precipita o se separa de su solución en forma sólida. La albúmina fue un excelente sustituto del plasma humano en la Segunda Guerra Mundial. Cuando se administraba a soldados heridos u otros pacientes con pérdida de sangre, ayudaba a expandir el volumen de sangre y conducía a una recuperación más rápida. El método de Cohn era lo suficientemente suave como para que la proteína de albúmina aislada conservara su actividad biológica.

Durante las operaciones, la concentración de etanol cambia de cero inicialmente a 40%. El pH disminuye de neutro a 7 a más ácido a 4,8 durante el fraccionamiento. La temperatura comienza a temperatura ambiente y disminuye a -5 grados Celsius. Inicialmente, la sangre se congela. Hay cinco fracciones principales. Cada fracción termina con un precipitado específico. Estos precipitados son las fracciones separadas.

Las fracciones I, II y III se precipitan en etapas anteriores. Las condiciones de las etapas anteriores son 8% de etanol, pH 7,2, -3 °C y 5,1% de proteína para la fracción I; 25% de etanol, pH 6,9, -5 °C y 3% de proteína. La albúmina permanece en la fracción sobrenadante durante la separación sólido/líquido en estas condiciones. La fracción IV tiene varias proteínas no deseadas que deben eliminarse. Para ello, se varían las condiciones para precipitar las proteínas. Las condiciones para precipitar estas proteínas son aumentar la concentración de etanol del 18 al 40% y aumentar el pH de 5,2 a 5,8. Finalmente, la albúmina se encuentra en la fracción V. La precipitación de la albúmina se realiza reduciendo el pH a 4,8, que está cerca del pI de la proteína, y manteniendo la concentración de etanol en un 40%, con una concentración de proteína del 1%. De esta forma, en la quinta fracción sólo queda el 1% del plasma original.

Sin embargo, la albúmina se pierde en cada etapa del proceso, y aproximadamente el 20% de la misma se pierde en las etapas de precipitación antes de la fracción V. Para purificar la albúmina, se realiza una extracción con agua y un ajuste a etanol al 10%, pH de 4,5 a -3 °C. Cualquier precipitado que se forme aquí se realiza mediante filtración y es una impureza. Estos precipitados se descartan. La reprecipitación, o repetición del paso de precipitación para mejorar la pureza, se realiza aumentando la concentración de etanol al 40% desde la etapa de extracción. El pH es 5,2 y se realiza a -5 °C. Se crearon varias variaciones de la fracción de Cohn para tener en cuenta el menor costo y el mayor rendimiento. Generalmente, si el rendimiento es alto, la pureza se reduce a aproximadamente el 85-90%.

Cohn pudo poner en marcha el Laboratorio de Fraccionamiento de Plasma después de que las agencias gubernamentales y las compañías farmacéuticas privadas le dieran una financiación masiva. Esto condujo al fraccionamiento de plasma humano. El plasma humano demostró tener varios componentes útiles además de la albúmina. El fraccionamiento de plasma sanguíneo humano produjo albúmina sérica humana, gammaglobulina sérica, fibrinógeno, trombina y globulinas de grupo sanguíneo. Las fracciones de fibrinógeno y trombina se combinaron aún más durante la guerra en productos adicionales, incluido el sellador de fibrina líquida, la espuma de fibrina sólida y una película de fibrina. Las gammaglobulinas se encuentran en las Fracciones II y III y demostraron ser esenciales en el tratamiento del sarampión para los soldados. La gammaglobulina también fue útil en el tratamiento de la polio, pero no tuvo mucho efecto en el tratamiento de las paperas o la escarlatina. Lo más importante es que las gammaglobulinas fueron útiles para modificar y prevenir la hepatitis infecciosa durante la Segunda Guerra Mundial. Con el tiempo se convirtieron en un tratamiento para los niños expuestos a este tipo de hepatitis.

El sellador de fibrina líquida se utilizó para tratar a las víctimas de quemaduras, incluidas algunas del ataque a Pearl Harbor, para fijar injertos de piel con una mayor tasa de éxito. También resultó útil para reconectar o anastomosar nervios cortados. La espuma de fibrina y la trombina se utilizaron para controlar la supuración de los vasos sanguíneos, especialmente en lesiones hepáticas y cerca de tumores. También minimizaba el sangrado de las venas grandes y trataba las malformaciones de los vasos sanguíneos dentro del cerebro. La película de fibrina se utilizó para detener el sangrado en varias aplicaciones quirúrgicas, incluida la neurocirugía. Sin embargo, no fue útil para controlar el sangrado arterial. El primer producto a base de fibrinógeno/fibrina capaz de detener la hemorragia arterial fue el "vendaje sellador de fibrina" o "apósito hemostático" inventado por Martin MacPhee en la Cruz Roja Americana a principios de los años 1990 y probado en colaboración con el Ejército de los EE. UU.

El método Gerlough, desarrollado en 1955, mejoró la economía del proceso al reducir el consumo de etanol. En lugar de un 40 % en ciertos pasos, Gerlough utilizó un 20 % de etanol para la precipitación. Esto se utiliza especialmente para las fracciones II y III. Además, Gerlough combinó las dos fracciones con la IV en un solo paso para reducir la cantidad de fraccionamientos necesarios. Si bien este método resultó menos costoso, no fue adoptado por la industria debido a esta combinación de fracciones II, III y IV, por temor a la mezcla y a las altas impurezas.

El método Hink se desarrolló en 1957. Este método proporcionó mayores rendimientos mediante la recuperación de algunas de las proteínas plasmáticas descartadas en las fracciones de IV. Sin embargo, los mejores rendimientos se compensaron con las menores purezas obtenidas, dentro del rango del 85%.

El método Mulford, similar al de Hink, utilizaba el sobrenadante de las fracciones II y III como último paso antes del acabado y el tratamiento térmico. El método combinaba las fracciones IV y V, pero en este caso la albúmina no sería tan pura, aunque los rendimientos podrían ser mayores.

Kistler y Nitschmann desarrollaron otra variación para proporcionar una forma más pura de albúmina, aunque compensada por rendimientos más bajos. De manera similar a Gerlough, el Precipitado A, que es equivalente a las Fracciones II y III de Cohn, se realizó a una concentración de etanol más baja del 19%, pero el pH, en este caso, también fue menor a 5,85. También similar a Gerlough y Mulford, la fracción IV se combinó y precipitó en condiciones de 40% de etanol, pH de 5,85 y temperatura de -8 grados C. La albúmina, que se recupera en la fracción V, se recupera en el Precipitado C con un ajuste de pH de 4,8. De manera similar al Proceso Cohn, la albúmina se purifica mediante extracción en agua seguida de precipitación de las impurezas al 10% de etanol, pH 4,6 y -3 grados C. De manera similar al Proceso Cohn, el precipitado formado aquí se filtra y se descarta. Luego, el Precipitado C (fracción V) se vuelve a precipitar a un pH de 5,2 y se almacena como una pasta a -40 grados C. Este proceso ha sido más aceptado porque separa las fracciones y hace que cada etapa sea independiente de las demás.

Otra variante implicaba un fraccionamiento de etanol por calor. Originalmente se desarrolló para inactivar el virus de la hepatitis. En este proceso, la recuperación de albúmina de alto rendimiento y alta pureza es el objetivo más importante, mientras que las otras proteínas plasmáticas se descuidan. Para asegurarse de que la albúmina no se desnaturalice con el calor, existen estabilizadores como el octanoato de sodio, que permiten que la albúmina tolere temperaturas más altas durante períodos prolongados. En el etanol por calor, el plasma se trata térmicamente a 68 grados C con octanoato de sodio con etanol al 9% a un pH de 6,5. Esto da como resultado una recuperación de albúmina mejorada con rendimientos del 90% y purezas del 100%. No es tan caro como los procedimientos de etanol frío como el Proceso Cohn. Un inconveniente es la presencia de nuevos antígenos debido a la posible desnaturalización térmica de la albúmina. Además, las otras proteínas plasmáticas tienen usos prácticos y no valdría la pena descuidarlas. Finalmente, los costosos recipientes de tratamiento térmico compensan el menor costo en comparación con el formato de etanol frío que no lo necesita. Por estos motivos, varias empresas no han adoptado este método a pesar de que ofrece resultados impresionantes. Sin embargo, una organización destacada que lo utiliza es la Cruz Roja Alemana.

La última variación fue desarrollada por Hao en 1979. Este método es significativamente más simple en comparación con el proceso Cohn. Su objetivo es crear altos rendimientos de albúmina siempre que la albúmina sea el único producto. A través de un proceso de dos etapas, las impurezas se precipitan directamente de las fracciones II y III del sobrenadante con 42% de etanol, pH 5,8, temperatura de -5 grados C, 1,2% de proteína y fuerza iónica de 0,09. La fracción V se precipita a pH 4,8. Las fracciones I, II, III y IV se coprecipitan con 40% de etanol, con pH de 5,4 a 7,0 y temperatura de -3 a -7 grados C. Luego, la fracción V se precipita a pH 4,8 y -10 grados C. Los altos rendimientos se deben a una combinación de un proceso simplificado, con menores pérdidas debido a la coprecipitación y el uso de filtración. También se lograron purezas más altas, del 98 %, debido a los niveles más altos de etanol, pero los rendimientos se redujeron con la alta pureza.

Los métodos más recientes implican el uso de la cromatografía.

El proceso de Cohn fue un desarrollo importante en el campo del fraccionamiento de sangre. Tiene varios usos prácticos en el tratamiento de enfermedades como la hepatitis y la poliomielitis. Fue más útil durante la Segunda Guerra Mundial donde los soldados se recuperaron a un ritmo más rápido debido a las transfusiones con la albúmina. El proceso de Cohn se ha modificado a lo largo de los años como se ve anteriormente. Además, ha influido en otros procesos con la industria del fraccionamiento de sangre. Esto ha llevado a nuevas formas de fraccionamiento, como el fraccionamiento de plasma cromatográfico en el intercambio de iones y los procesos de acabado de albúmina. En general, el proceso de Cohn y sus variaciones han dado un gran impulso y sirven como base para la industria del fraccionamiento hasta el día de hoy.

Sin embargo, el proceso no se ha estudiado bien porque es arcaico. Lo más importante, nunca ha sido modernizado por empresas manufactureras. El formato de etanol frío puede ser demasiado gentil para matar ciertos virus que requieren inactivación de calor. Dado que este proceso permanece sin cambios durante tanto tiempo, varias ineficiencias e inconsistencias incorporadas afectan la economía del proceso para empresas farmacéuticas y manufactureras. Una excepción a esto fue la aplicación en Escocia del procesamiento de flujo continuo en lugar del procesamiento por lotes. Este proceso se diseñó en el Centro de Fraccionamiento de Proteínas (PFC), la instalación de fraccionamiento en plasma del Servicio Nacional de Transfusión de Sangre de Escocia (SNBT). Este proceso implicó el monitoreo y el control en línea del pH y la temperatura, con el control de flujo de las corrientes de plasma y etanol utilizando bombas de engranajes de precisión, todo bajo control de retroalimentación computarizado. Como resultado, las fracciones de Cohn I+II+III, IV y V se produjeron en unas pocas horas, en lugar de en muchos días. La preparación de flujo continuo de crioprecipitado se integró posteriormente en el proceso aguas arriba del fraccionamiento de Cohn.

Sin embargo, este proceso aún sirve como una base importante para el industria sanguínea en general y su influencia puede verse como se le hace referencia en el desarrollo de métodos más nuevos. Aunque tiene sus inconvenientes dependiendo de la variación, la principal ventaja del proceso de Cohn son sus usos prácticos y su utilidad dentro de las industrias farmacológicas y médicas.