Polimerasa taq

En PCR

En PCR

En la PCR

A principios de la década de 1980, Kary Mullis trabajaba en Cetus Corporation en la aplicación de ADN sintético a la biotecnología. Estaba familiarizado con el uso de oligonucleótidos de ADN como sondas para unirse a cadenas de ADN diana, así como con su uso como cebadores para la secuenciación de ADN y la síntesis de ADNc. En 1983, comenzó a utilizar dos cebadores, uno para hibridar con cada hebra de un ADN objetivo, y añadió ADN polimerasa a la reacción. Esto condujo a una replicación exponencial del ADN, amplificando en gran medida segmentos discretos de ADN entre los cebadores.

Sin embargo, después de cada ronda de replicación, la mezcla debe calentarse a más de 90 °C para desnaturalizar el ADN recién formado, permitiendo que las cadenas se separen y actúen como plantillas en la siguiente ronda de amplificación. Este paso de calentamiento también inactiva la ADN polimerasa que estaba en uso antes del descubrimiento de la polimerasa Taq, el fragmento Klenow (procedente de E. coli). La polimerasa Taq es muy adecuada para esta aplicación porque es capaz de soportar la temperatura de 95 °C necesaria para la separación de las cadenas de ADN sin desnaturalizarse.

El uso del Taq termoestable permite ejecutar la PCR a alta temperatura (~60 °C y más), lo que facilita una alta especificidad de los cebadores y reduce la producción de productos no específicos, como el dímero de cebador. . Además, el uso de una polimerasa termoestable elimina la necesidad de agregar una nueva enzima a cada ronda de termociclado. Se puede utilizar un único tubo cerrado en una máquina relativamente sencilla para llevar a cabo todo el proceso. Así, el uso de la polimerasa Taq fue la idea clave que hizo que la PCR fuera aplicable a una gran variedad de problemas de biología molecular relacionados con el análisis de ADN.

Problemas de patentes

Hoffmann-La Roche finalmente compró las patentes PCR y Taq de Cetus por 330 millones de dólares, de los cuales pudo haber recibido hasta 2 mil millones de dólares en regalías. En 1989, la revista Science nombró a la polimerasa Taq su primera "molécula del año". Kary Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993, el único otorgado por una investigación realizada en una empresa de biotecnología. A principios de la década de 1990, la técnica de PCR con polimerasa Taq se utilizaba en muchas áreas, incluida la investigación de biología molecular básica, pruebas clínicas y ciencia forense. También empezó a encontrar una aplicación urgente en la detección directa del VIH en el SIDA.

En diciembre de 1999, el juez de distrito estadounidense Vaughn Walker dictaminó que la patente de 1990 sobre la Taq polimerasa se emitió, en parte, sobre la base de información engañosa y afirmaciones falsas de científicos de Cetus Corporation. El fallo apoyó una impugnación de Promega Corporation contra Hoffman-La Roche, que compró las patentes Taq en 1991. El juez Walker citó descubrimientos anteriores de otros laboratorios, incluido el laboratorio del profesor John Trela en la Universidad de Cincinnati. Departamento de Ciencias Biológicas, como fundamento del fallo.

Estructura del dominio

Taq Pol A tiene una estructura general similar a la de E. coli PolA. El medio 3'–5' El dominio de exonucleasa responsable de la corrección ha cambiado drásticamente y no es funcional. Tiene un funcional 5'-3' dominio exonucleasa en el amino terminal, que se describe a continuación. Los dos dominios restantes actúan en coordinación, mediante movimiento de dominio acoplado.

Dominio exonucleasa

Taq polimerasa exonucleasa es un dominio que se encuentra en el extremo amino de la Taq ADN polimerasa I (termoestable). Asume un motivo similar a la ribonucleasa H. El dominio confiere 5'-3' actividad exonucleasa a la polimerasa.

A diferencia del mismo dominio en E. coli, que degradaría los cebadores y debe eliminarse mediante digestión para su uso en PCR, no se dice que este dominio degrade el cebador. Esta actividad se utiliza en la sonda TaqMan: a medida que se forman las hebras hijas, las sondas complementarias a la plantilla entran en contacto con la polimerasa y se escinden en trozos fluorescentes.

Unión con el ADN

Taq está unida en su hendidura del sitio activo de la polimerasa con el extremo romo del ADN dúplex. Como la polimerasa Taq está en contacto con el ADN unido, sus cadenas laterales forman enlaces de hidrógeno con las purinas y pirimidinas del ADN. La misma región de la polimerasa Taq que se ha unido al ADN también se une a la exonucleasa. Estas estructuras unidas a la polimerasa Taq tienen diferentes interacciones.

Mutantes

Un experimento de mutagénesis dirigida al sitio que mejora la estructura vestigial 3'-5' Se ha informado de la actividad de la exonucleasa en un factor de 2, pero nunca se informó si hacerlo disminuye la tasa de error. Siguiendo una línea de pensamiento similar, se han producido proteínas quimera seleccionando dominios de E. coli, Taq y T. neapolitana polimerasa I. Intercambio del dominio vestigial por uno funcional de E. coli creó una proteína con capacidad de corrección de pruebas pero con una temperatura óptima más baja y una termoestabilidad baja.

Versiones de la polimerasa sin el componente 5'-3' Se ha producido un dominio exonucleasa, entre los cuales son más conocidos Klentaq o el fragmento Stoffel. La falta total de actividad exonucleasa hace que estas variantes sean adecuadas para cebadores que exhiben una estructura secundaria, así como para copiar moléculas circulares. Otras variaciones incluyen el uso de Klentaq con una polimerasa de alta fidelidad, una Termosequenasa que reconoce sustratos como lo hace la ADN polimerasa T7, mutantes con mayor tolerancia a los inhibidores o "dominio -etiquetado" versiones que tienen un motivo extra de hélice-horquilla-hélice alrededor del sitio catalítico para sujetar el ADN con más fuerza a pesar de las condiciones adversas.

Importancia en la detección de enfermedades

Debido a las mejoras que la polimerasa Taq proporcionó en la replicación del ADN por PCR: mayor especificidad, menos productos no específicos y procesos y equipos más simples, ha sido fundamental en los esfuerzos realizados para detectar enfermedades. "El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnóstico de enfermedades infecciosas ha dado como resultado la capacidad de diagnosticar tempranamente y tratar adecuadamente enfermedades debidas a patógenos exigentes, determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de organismos de crecimiento lento y determinar la magnitud de la infección". La implementación de la polimerasa Taq ha salvado innumerables vidas. Ha desempeñado un papel esencial en la detección de muchas de las peores enfermedades del mundo, entre ellas: tuberculosis, faringitis estreptocócica, neumonía atípica, SIDA, sarampión, hepatitis e infecciones urogenitales ulcerosas. La PCR, el método utilizado para recrear copias de muestras de ADN específicas, hace posible la detección de enfermedades al apuntar a una secuencia de ADN específica de un patógeno objetivo de la muestra de un paciente y amplificar trazas de las secuencias indicativas copiándolas hasta miles de millones de veces. Aunque este es el método más preciso de detección de enfermedades, especialmente para el VIH, no se realiza con tanta frecuencia como pruebas alternativas e inferiores debido al costo, la mano de obra y el tiempo relativamente altos que requieren.

La dependencia de la polimerasa Taq como catalizador para el proceso de replicación de la PCR se destacó durante la pandemia de COVID-19 de 2020. La escasez de la enzima necesaria ha afectado la capacidad de los países de todo el mundo para producir pruebas. kits para el virus. Sin la Taq polimerasa, el proceso de detección de enfermedades es mucho más lento y tedioso.

A pesar de las ventajas de utilizar la polimerasa Taq en la detección de enfermedades mediante PCR, la enzima no está exenta de desventajas. Las enfermedades retrovirales (VIH, HTLV-1 y HTLV-II) suelen incluir mutaciones de guanina a adenina en su genoma. Mutaciones como estas son las que permiten que las pruebas de PCR detecten enfermedades, pero la tasa de fidelidad relativamente baja de la polimerasa Taq hace que se produzca la misma mutación G a A y posiblemente produzca un resultado de prueba falso positivo.