Plásmido

Un plásmido es una pequeña molécula de ADN extracromosómico dentro de una célula que está físicamente separada del ADN cromosómico y puede replicarse de forma independiente. Se encuentran más comúnmente como pequeñas moléculas circulares de ADN de doble cadena en bacterias; sin embargo, los plásmidos a veces están presentes en arqueas y organismos eucariotas.En la naturaleza, los plásmidos a menudo portan genes que benefician la supervivencia del organismo y confieren una ventaja selectiva, como la resistencia a los antibióticos. Mientras que los cromosomas son grandes y contienen toda la información genética esencial para vivir en condiciones normales, los plásmidos suelen ser muy pequeños y contienen solo genes adicionales que pueden ser útiles en determinadas situaciones o condiciones. Los plásmidos artificiales se utilizan ampliamente como vectores en la clonación molecular y sirven para impulsar la replicación de secuencias de ADN recombinante dentro de los organismos huéspedes. En el laboratorio, los plásmidos pueden introducirse en una célula mediante transformación. Los plásmidos sintéticos están disponibles para su adquisición a través de Internet.

Los plásmidos se consideran replicones, unidades de ADN capaces de replicarse de forma autónoma dentro de un huésped adecuado. Sin embargo, los plásmidos, como los virus, generalmente no se clasifican como vida. Los plásmidos se transmiten de una bacteria a otra (incluso de otra especie) principalmente a través de la conjugación.Esta transferencia de material genético de huésped a huésped es un mecanismo de transferencia horizontal de genes, y los plásmidos se consideran parte del mobiloma. A diferencia de los virus, que encierran su material genético en una capa proteica protectora llamada cápside, los plásmidos son ADN "desnudo" y no codifican los genes necesarios para encapsular el material genético para transferirlo a un nuevo huésped; sin embargo, algunas clases de plásmidos codifican el pilus "sexo" conjugativo necesario para su propia transferencia. El tamaño del plásmido varía de 1 a más de 200 kbp, y el número de plásmidos idénticos en una sola célula puede oscilar entre uno y miles en algunas circunstancias.

Historia

El término plásmido fue introducido en 1952 por el biólogo molecular estadounidense Joshua Lederberg para referirse a "cualquier determinante hereditario extracromosómico". El uso temprano del término incluía cualquier material genético bacteriano que existiera extracromosómicamente durante al menos parte de su ciclo de replicación, pero debido a que esa descripción incluye virus bacterianos, la noción de plásmido se perfeccionó con el tiempo para comprender elementos genéticos que se reproducen de forma autónoma. Más tarde, en 1968, se decidió adoptar el término plásmido como elemento genético extracromosómico y, para distinguirlo de los virus, la definición se redujo a los elementos genéticos que existen exclusiva o predominantemente fuera del cromosoma y pueden replicarse de forma autónoma.

Propiedades y características

Para que los plásmidos se repliquen de forma independiente dentro de una célula, deben poseer un tramo de ADN que pueda actuar como origen de replicación. La unidad de autorreplicación, en este caso, el plásmido, se denomina replicón. Un replicón bacteriano típico puede constar de una serie de elementos, como el gen de la proteína de iniciación de la replicación (Rep) específica del plásmido, unidades repetidas llamadas iterones, cajas DnaA y una región rica en AT adyacente. Los plásmidos más pequeños utilizan las enzimas replicativas del huésped para hacer copias de sí mismos, mientras que los plásmidos más grandes pueden portar genes específicos para la replicación de esos plásmidos. Algunos tipos de plásmidos también pueden insertarse en el cromosoma huésped, y estos plásmidos integradores a veces se denominan episomas en procariotas.

Los plásmidos casi siempre portan al menos un gen. Muchos de los genes transportados por un plásmido son beneficiosos para las células huésped, por ejemplo: permiten que la célula huésped sobreviva en un entorno que de otro modo sería letal o restrictivo para el crecimiento. Algunos de estos genes codifican rasgos para la resistencia a los antibióticos o a los metales pesados, mientras que otros pueden producir factores de virulencia que permiten que una bacteria colonice a un huésped y supere sus defensas o tienen funciones metabólicas específicas que permiten que la bacteria utilice un nutriente en particular, incluido el capacidad para degradar compuestos orgánicos recalcitrantes o tóxicos.Los plásmidos también pueden proporcionar a las bacterias la capacidad de fijar nitrógeno. Algunos plásmidos, sin embargo, no tienen un efecto observable sobre el fenotipo de la célula huésped o no se puede determinar su beneficio para las células huésped, y estos plásmidos se denominan plásmidos crípticos.

Los plásmidos naturales varían mucho en sus propiedades físicas. Su tamaño puede variar desde miniplásmidos muy pequeños de menos de 1 kilopares de bases (kbp) hasta megaplásmidos muy grandes de varios megapares de bases (Mbp). En el extremo superior, hay poca diferencia entre un megaplásmido y un minicromosoma. Los plásmidos son generalmente circulares, pero también se conocen ejemplos de plásmidos lineales. Estos plásmidos lineales requieren mecanismos especializados para replicar sus extremos.

Los plásmidos pueden estar presentes en una célula individual en número variable, desde uno hasta varios cientos. El número normal de copias del plásmido que se puede encontrar en una sola célula se denomina número de copias del plásmido y está determinado por cómo se regula el inicio de la replicación y el tamaño de la molécula. Los plásmidos más grandes tienden a tener un número de copias más bajo. Los plásmidos con bajo número de copias que existen sólo como una o unas pocas copias en cada bacteria están, tras la división celular, en peligro de perderse en una de las bacterias segregantes. Dichos plásmidos de una sola copia tienen sistemas que intentan distribuir activamente una copia a ambas células hijas. Estos sistemas, que incluyen el sistema parABS y el sistema parMRC, a menudo se denominan sistema de partición o función de partición de un plásmido.

Clasificaciones y tipos

Los plásmidos se pueden clasificar de varias formas. Los plásmidos se pueden clasificar ampliamente en plásmidos conjugativos y plásmidos no conjugativos. Los plásmidos conjugativos contienen un conjunto de genes de transferencia que promueven la conjugación sexual entre diferentes células. En el complejo proceso de conjugación, los plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra a través de pili sexuales codificados por algunos de los genes de transferencia (ver figura). Los plásmidos no conjugativos son incapaces de iniciar la conjugación, por lo que solo pueden transferirse con la ayuda de plásmidos conjugativos. Una clase intermedia de plásmidos son movilizables y portan solo un subconjunto de los genes necesarios para la transferencia. Pueden parasitar un plásmido conjugativo, transfiriéndose a alta frecuencia solo en su presencia.

Los plásmidos también se pueden clasificar en grupos de incompatibilidad. Un microbio puede albergar diferentes tipos de plásmidos, pero solo pueden existir diferentes plásmidos en una sola célula bacteriana si son compatibles. Si dos plásmidos no son compatibles, uno u otro se perderán rápidamente de la célula. Por lo tanto, se pueden asignar diferentes plásmidos a diferentes grupos de incompatibilidad dependiendo de si pueden coexistir juntos. Los plásmidos incompatibles (que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad) normalmente comparten los mismos mecanismos de replicación o partición y, por lo tanto, no pueden mantenerse juntos en una sola célula.

Otra forma de clasificar los plásmidos es por función. Hay cinco clases principales:

• Plásmidos F de fertilidad, que contienen genes tra. Son capaces de conjugarse y dar como resultado la expresión de sexo pili.
• Plásmidos de resistencia (R), que contienen genes que proporcionan resistencia contra antibióticos o venenos. Históricamente conocidos como factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plásmidos.
• Col plásmidos, que contienen genes que codifican bacteriocinas, proteínas que pueden matar otras bacterias.
• Plásmidos degradativos, que permiten la digestión de sustancias inusuales, por ejemplo, tolueno y ácido salicílico.
• Plásmidos de virulencia, que convierten a la bacteria en un patógeno. por ejemplo, plásmido Ti en Agrobacterium tumefaciens

Los plásmidos pueden pertenecer a más de uno de estos grupos funcionales.

Plásmidos de ARN

Aunque la mayoría de los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena, algunos consisten en ADN de cadena sencilla o predominantemente en ARN de doble cadena. Los plásmidos de ARN son replicones de ARN lineales extracromosómicos no infecciosos, tanto encapsidados como no encapsidados, que se han encontrado en hongos y diversas plantas, desde algas hasta plantas terrestres. En muchos casos, sin embargo, puede ser difícil o imposible distinguir claramente los plásmidos de ARN de los virus de ARN y otros ARN infecciosos.

Vectores

Los plásmidos construidos artificialmente pueden usarse como vectores en ingeniería genética. Estos plásmidos sirven como herramientas importantes en los laboratorios de genética y biotecnología, donde se usan comúnmente para clonar y amplificar (hacer muchas copias) o expresar genes particulares. Una amplia variedad de plásmidos están comercialmente disponibles para tales usos. El gen a replicar normalmente se inserta en un plásmido que normalmente contiene una serie de características para su uso. Estos incluyen un gen que confiere resistencia a antibióticos particulares (la ampicilina se usa con más frecuencia para las cepas bacterianas), un origen de replicación para permitir que las células bacterianas repliquen el ADN del plásmido y un sitio adecuado para la clonación (denominado sitio de clonación múltiple).).

La inestabilidad estructural del ADN se puede definir como una serie de eventos espontáneos que culminan en un reordenamiento, pérdida o ganancia imprevistos de material genético. Dichos eventos se desencadenan con frecuencia por la transposición de elementos móviles o por la presencia de elementos inestables, como estructuras no canónicas (no B). Las regiones accesorias pertenecientes a la columna vertebral bacteriana pueden participar en una amplia gama de fenómenos de inestabilidad estructural. Los catalizadores bien conocidos de inestabilidad genética incluyen repeticiones directas, invertidas y en tándem, que se sabe que son evidentes en un gran número de vectores de clonación y expresión disponibles en el mercado. Las secuencias de inserción también pueden afectar gravemente la función y el rendimiento del plásmido, al provocar deleciones y reordenamientos, activación, regulación negativa o inactivación de la expresión de genes vecinos.Por lo tanto, la reducción o eliminación completa de secuencias de columna vertebral no codificantes extrañas reduciría significativamente la propensión a que tuvieran lugar tales eventos y, en consecuencia, el potencial recombinogénico global del plásmido.

Clonación

Los plásmidos son los vectores de clonación bacteriana más utilizados.Estos vectores de clonación contienen un sitio que permite que se inserten fragmentos de ADN, por ejemplo, un sitio de clonación múltiple o polienlazador que tiene varios sitios de restricción de uso común a los que se pueden ligar fragmentos de ADN. Después de insertar el gen de interés, los plásmidos se introducen en bacterias mediante un proceso llamado transformación. Estos plásmidos contienen un marcador seleccionable, generalmente un gen de resistencia a los antibióticos, que confiere a las bacterias la capacidad de sobrevivir y proliferar en un medio de crecimiento selectivo que contiene los antibióticos particulares. Las células después de la transformación se exponen a los medios selectivos y solo las células que contienen el plásmido pueden sobrevivir. De esta forma, los antibióticos actúan como un filtro para seleccionar únicamente las bacterias que contienen el ADN plasmídico. El vector también puede contener otros genes marcadores o genes informadores para facilitar la selección de plásmidos con insertos clonados. A continuación, las bacterias que contienen el plásmido pueden cultivarse en grandes cantidades, cosecharse y, a continuación, el plásmido de interés puede aislarse utilizando diversos métodos de preparación de plásmidos.

Normalmente, se utiliza un vector de clonación de plásmido para clonar fragmentos de ADN de hasta 15 kpb. Para clonar longitudes más largas de ADN, se utilizan fagos lambda con genes de lisogenia eliminados, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos o cromosomas artificiales de levadura.

Producción de proteínas

Otro uso importante de los plásmidos es producir grandes cantidades de proteínas. En este caso, los investigadores cultivan bacterias que contienen un plásmido que alberga el gen de interés. Así como la bacteria produce proteínas para conferir su resistencia a los antibióticos, también puede ser inducida a producir grandes cantidades de proteínas a partir del gen insertado. Esta es una forma barata y fácil de producir en masa la proteína que codifica el gen, por ejemplo, la insulina.

Terapia de genes

Los plásmidos también se pueden usar para la transferencia de genes como un tratamiento potencial en la terapia génica para que pueda expresar la proteína que falta en las células. Algunas formas de terapia génica requieren la inserción de genes terapéuticos en sitios diana cromosómicos preseleccionados dentro del genoma humano. Los vectores de plásmidos son uno de los muchos enfoques que podrían usarse para este propósito. Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN, por sus siglas en inglés) ofrecen una forma de provocar una ruptura de doble cadena específica del sitio en el genoma del ADN y provocar una recombinación homóloga. Los plásmidos que codifican ZFN podrían ayudar a administrar un gen terapéutico a un sitio específico para evitar el daño celular, las mutaciones que causan cáncer o una respuesta inmune.

Modelos de enfermedades

Históricamente, los plásmidos se utilizaron para modificar genéticamente las células madre embrionarias de ratas para crear modelos de enfermedades genéticas de ratas. La eficiencia limitada de las técnicas basadas en plásmidos impidió su uso en la creación de modelos de células humanas más precisos. Sin embargo, los avances en las técnicas de recombinación de virus adenoasociados y las nucleasas con dedos de zinc han permitido la creación de una nueva generación de modelos de enfermedades humanas isogénicas.

Episomas

El término episoma fue introducido por François Jacob y Élie Wollman en 1958 para referirse al material genético extracromosómico que puede replicarse de forma autónoma o integrarse en el cromosoma. Sin embargo, desde que se introdujo el término, su uso ha cambiado, ya que plásmido se ha convertido en el término preferido para la replicación autónoma del ADN extracromosómico. En un simposio de 1968 en Londres, algunos participantes sugirieron que se abandonara el término episoma, aunque otros continuaron usándolo con un cambio de significado.

Hoy en día, algunos autores utilizan episoma en el contexto de procariotas para referirse a un plásmido que es capaz de integrarse en el cromosoma. Los plásmidos integradores pueden replicarse y mantenerse estables en una célula a través de múltiples generaciones, pero en algún momento existirán como una molécula de plásmido independiente. En el contexto de los eucariotas, el término episoma se utiliza para referirse a una molécula de ADN circular cerrada extracromosómica no integrada que puede replicarse en el núcleo. Los virus son los ejemplos más comunes de esto, como los herpesvirus, los adenovirus y los poliomavirus, pero algunos son plásmidos. Otros ejemplos incluyen fragmentos cromosómicos aberrantes, como cromosomas de dos minutos, que pueden surgir durante amplificaciones genéticas artificiales o en procesos patológicos (p. ej., transformación de células cancerosas). Los episomas en eucariotas se comportan de manera similar a los plásmidos en procariotas en que el ADN se mantiene estable y se replica con la célula huésped. También pueden ocurrir episomas virales citoplásmicos (como en las infecciones por poxvirus). Algunos episomas, como los herpesvirus, se replican en un mecanismo de círculo rodante, similar a los bacteriófagos (virus de fagos bacterianos). Otros se replican a través de un mecanismo de replicación bidireccional (tipo Thetaplásmidos). En cualquier caso, los episomas permanecen físicamente separados de los cromosomas de la célula huésped. Varios virus del cáncer, incluidos el virus de Epstein-Barr y el herpesvirus asociado con el sarcoma de Kaposi, se mantienen como episomas cromosómicamente distintos latentes en las células cancerosas, donde los virus expresan oncogenes que promueven la proliferación de células cancerosas. En los cánceres, estos episomas se replican pasivamente junto con los cromosomas del huésped cuando la célula se divide. Cuando estos episomas virales inician la replicación lítica para generar múltiples partículas virales, generalmente activan los mecanismos de defensa de la inmunidad innata celular que matan a la célula huésped.

Mantenimiento de plásmidos

Algunos plásmidos u hospedadores microbianos incluyen un sistema de adicción o un sistema de destrucción posterior a la segregación (PSK), como el sistema hok/sok (asesinato del huésped/supresor de la destrucción) del plásmido R1 en Escherichia coli. Esta variante produce un veneno de larga duración y un antídoto de corta duración. Varios tipos de sistemas de adicción de plásmidos (toxina/antitoxina, basados ​​en el metabolismo, sistemas ORT) se describieron en la literatura y se usaron en aplicaciones biotécnicas (fermentación) o biomédicas (terapia con vacunas). Las células hijas que retienen una copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija que no hereda el plásmido muere o sufre una tasa de crecimiento reducida debido al veneno persistente de la célula madre. Finalmente, la productividad general podría mejorarse.

Por el contrario, los plásmidos utilizados en biotecnología, como pUC18, pBR322 y vectores derivados, casi nunca contienen sistemas de adicción toxina-antitoxina y, por lo tanto, deben mantenerse bajo presión antibiótica para evitar la pérdida de plásmidos.

Plásmidos de levadura

Las levaduras albergan naturalmente varios plásmidos. Entre ellos se destacan los plásmidos de 2 μm (pequeños plásmidos circulares que se usan a menudo para la ingeniería genética de la levadura) y los plásmidos pGKL lineales de Kluyveromyces lactis, que son responsables de los fenotipos asesinos.

Otros tipos de plásmidos a menudo están relacionados con vectores de clonación de levadura que incluyen:

• Plásmido integrativo de levadura (YIp), vectores de levadura que se basan en la integración en el cromosoma huésped para la supervivencia y la replicación, y generalmente se usan cuando se estudia la funcionalidad de un gen solo o cuando el gen es tóxico. También conectado con el gen URA3, que codifica una enzima relacionada con la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina (T, C);
• Plásmido Replicativo de Levadura (YRp), que transporta una secuencia de ADN cromosómico que incluye un origen de replicación. Estos plásmidos son menos estables, ya que pueden perderse durante la brotación.

Extracción de ADN plasmídico

Los plásmidos se utilizan a menudo para purificar una secuencia específica, ya que se pueden purificar fácilmente del resto del genoma. Para su uso como vectores y para la clonación molecular, los plásmidos a menudo necesitan aislarse.

Existen varios métodos para aislar ADN plasmídico de bacterias, que van desde miniprep hasta maxiprep o bulkprep. El primero se puede utilizar para averiguar rápidamente si el plásmido es correcto en cualquiera de varios clones bacterianos. El rendimiento es una pequeña cantidad de ADN de plásmido impuro, que es suficiente para el análisis por digestión de restricción y para algunas técnicas de clonación.

En este último, se cultivan volúmenes mucho mayores de suspensión bacteriana a partir de los cuales se puede realizar una preparación máxima. En esencia, se trata de una minipreparación ampliada seguida de una purificación adicional. Esto da como resultado cantidades relativamente grandes (varios cientos de microgramos) de ADN plasmídico muy puro.

Se han creado muchos kits comerciales para realizar la extracción de plásmidos en varias escalas, pureza y niveles de automatización.

Conformaciones

El ADN plásmido puede aparecer en una de cinco conformaciones, que (para un tamaño determinado) se ejecutan a diferentes velocidades en un gel durante la electroforesis. Las conformaciones se enumeran a continuación en orden de movilidad electroforética (velocidad para un voltaje aplicado dado) de la más lenta a la más rápida:

• El ADN circular abierto mellado tiene un corte de hebra.
• El ADN circular relajado está completamente intacto con ambas hebras sin cortar, pero se ha relajado enzimáticamente (se han eliminado las superespiras). Esto se puede modelar dejando que un cable de extensión torcido se desenrolle y se relaje y luego enchúfelo en sí mismo.
• El ADN lineal tiene extremos libres, ya sea porque se cortaron ambas cadenas o porque el ADN era lineal in vivo. Esto se puede modelar con un cable de extensión eléctrico que no está enchufado en sí mismo.
• El ADN superenrollado (o circular covalentemente cerrado) está completamente intacto con ambas hebras sin cortar y con una torsión integral, lo que da como resultado una forma compacta. Esto se puede modelar girando un cable de extensión y luego enchufándolo.
• El ADN desnaturalizado superenrollado es como el ADN superenrollado, pero tiene regiones desapareadas que lo hacen un poco menos compacto; esto puede deberse a una alcalinidad excesiva durante la preparación del plásmido.

La tasa de migración de pequeños fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado a voltajes bajos. A voltajes más altos, los fragmentos más grandes migran a velocidades que aumentan continuamente pero que son diferentes. Por lo tanto, la resolución de un gel disminuye al aumentar el voltaje.

A un voltaje bajo especificado, la tasa de migración de pequeños fragmentos de ADN lineal es una función de su longitud. Los fragmentos lineales grandes (más de 20 kb aproximadamente) migran a una determinada velocidad fija, independientemente de su longitud. Esto se debe a que las moléculas 'respiran', con la mayor parte de la molécula siguiendo el extremo principal a través de la matriz de gel. Las digestiones de restricción se utilizan con frecuencia para analizar plásmidos purificados. Estas enzimas rompen específicamente el ADN en ciertas secuencias cortas. Los fragmentos lineales resultantes forman "bandas" después de la electroforesis en gel. Es posible purificar ciertos fragmentos cortando las bandas del gel y disolviendo el gel para liberar los fragmentos de ADN.

Debido a su conformación compacta, el ADN superenrollado migra más rápido a través de un gel que el ADN lineal o circular abierto.

Software para bioinformática y diseño

El uso de plásmidos como técnica en biología molecular está respaldado por software de bioinformática. Estos programas registran la secuencia de ADN de los vectores de plásmidos, ayudan a predecir los sitios de corte de las enzimas de restricción y a planificar las manipulaciones. Ejemplos de paquetes de software que manejan mapas de plásmidos son ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI y WebDSV. Estas piezas de software ayudan a realizar experimentos completos in silico antes de realizar experimentos húmedos.

Colecciones de plásmidos

Se han creado muchos plásmidos a lo largo de los años y los investigadores han entregado plásmidos a bases de datos de plásmidos como las organizaciones sin fines de lucro Addgene y BCCM/LMBP. Uno puede encontrar y solicitar plásmidos de esas bases de datos para investigación. Los investigadores también suelen cargar secuencias de plásmidos en la base de datos del NCBI, desde la cual se pueden recuperar secuencias de plásmidos específicos.