Pistola genética

En ingeniería genética, una pistola o sistema de distribución de partículas biolísticas es un dispositivo utilizado para entregar ADN exógeno (transgenes), ARN o proteína a las células. Al recubrir partículas de un metal pesado con un gen de interés y disparar estos microproyectoiles en células usando fuerza mecánica, se puede introducir una integración de la información genética deseada en las células deseadas. La técnica involucrada en la entrega de ADN de microproyectos suele denominarse biolisticas, corto para "balística biológica".

Este dispositivo es capaz de transformar casi cualquier tipo de célula y no se limita a la transformación del núcleo; también puede transformar orgánulos, incluidos plastidios y mitocondrias.

Diseño de pistola genética

La pistola genética era originalmente una pistola de aire comprimido Crosman modificada para disparar partículas densas de tungsteno. Fue inventado por John C Sanford, Ed Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell junto con Ted Klein de DuPont entre 1983 y 1986. El objetivo original eran las cebollas (elegidas por su gran tamaño de celda), y el dispositivo se usaba para liberar partículas. recubierto con un gen marcador que transmitiría una señal si se produjera una inserción adecuada de la transcripción de ADN. La transformación genética se demostró al observar la expresión del gen marcador dentro de las células de la cebolla.

Las primeras armas genéticas fabricadas a medida (fabricadas por Nelson Allen) utilizaban un cartucho de pistola de clavos de calibre 22 para impulsar un cilindro de polietileno (bala) por un cañón Douglas de calibre 22. Se colocó una gota de polvo de tungsteno recubierta con material genético sobre la bala y se disparó a una placa de Petri situada debajo. La bala se soldó al disco debajo de la placa de Petri y el material genético explotó en la muestra con un efecto de rosquilla que implicaba devastación en el medio de la muestra con un anillo de buena transformación alrededor de la periferia. La pistola estaba conectada a una bomba de vacío y se colocó bajo vacío mientras disparaba. El diseño inicial fue puesto en producción limitada por Rumsey-Loomis (un taller de maquinaria local entonces en Mecklenburg Road en Ithaca, Nueva York, EE. UU.).

Biolistics, Inc vendió a Dupont los derechos para fabricar y distribuir un dispositivo actualizado con mejoras que incluyen el uso de helio como propulsor no explosivo y un mecanismo de entrega por colisión de múltiples discos para minimizar el daño a los tejidos de la muestra. Otros metales pesados, como el oro y la plata, también se utilizan para transportar material genético, siendo el oro el preferido debido a su menor citotoxicidad en comparación con los portadores de proyectiles de tungsteno.

Diseño de constructo biolístico

La transformación biolística implica la integración de un fragmento funcional de ADN, conocido como construcción de ADN, en las células diana. Una construcción genética es un casete de ADN que contiene todos los elementos reguladores necesarios para la expresión adecuada dentro del organismo objetivo. Si bien las construcciones genéticas pueden variar en su diseño dependiendo del resultado deseado del procedimiento de transformación, todas las construcciones típicamente contienen una combinación de una secuencia promotora, una secuencia terminadora, el gen de interés y un gen informador.

Promoter

Los promotores controlan la ubicación y magnitud de la expresión y función del gen como “el volante y el pedal de gas” de un gen. Los promotores preceden al gen de interés en la construcción de ADN y pueden cambiarse a través del diseño de laboratorio a la expresión transgénita fina. El promotor de 35S del virus del mosaico de coliflor es un ejemplo de un promotor comúnmente utilizado que resulta en una robusta expresión génica constitutiva dentro de las plantas.

Terminator

Las secuencias de Terminator son necesarias para la expresión adecuada del gen y se colocan después de la región de codificación del gen de interés dentro de la construcción del ADN. Un rescindor común para la transformación biolística es el resplandor NOS derivado de Agrobacterium tumefaciens. Debido a la alta frecuencia de uso de este terminator en plantas genéticamente diseñadas, se han desarrollado estrategias para detectar su presencia dentro del suministro de alimentos para monitorear cultivos GE no autorizados.

Reporter gene

Un gen codificando un marcador seleccionable es un elemento común dentro de las construcciones de ADN y se utiliza para seleccionar las células adecuadamente transformadas. El marcador seleccionable elegido dependerá de la especie que se transforma, pero normalmente será un gen otorgando a las células una capacidad de desintoxicación para ciertos herbicidas o antibióticos como la kanamicina, la higromicina B o el glifosato.

Otros elementos

Los componentes opcionales de una construcción de ADN incluyen elementos tales como secuencias de cre-lox que permiten la eliminación controlada de la construcción del genoma objetivo. Tales elementos son elegidos por el constructor para realizar funciones especializadas junto con el principal gen de interés.

Aplicación

Las pistolas genéticas se utilizan principalmente con células vegetales. Sin embargo, existe un gran uso potencial en humanos y también en otros animales.

Plantas

El objetivo de una pistola genética es a menudo un callo de células vegetales indiferenciadas o un grupo de embriones inmaduros que crecen en un medio de gel en una placa de Petri. Una vez que las partículas de oro recubiertas de ADN han llegado a las células, el ADN se utiliza como plantilla para la transcripción (expresión transitoria) y, a veces, se integra en un cromosoma vegetal (transformación 'estable').

Si la construcción de ADN administrada contiene un marcador seleccionable, entonces las células transformadas de manera estable se pueden seleccionar y cultivar utilizando métodos de cultivo de tejidos. Por ejemplo, si la construcción de ADN administrada contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico o herbicida, entonces se pueden seleccionar células transformadas de manera estable incluyendo ese antibiótico o herbicida en el medio de cultivo de tejidos.

Las células transformadas pueden tratarse con una serie de hormonas vegetales, como auxinas y giberelinas, y cada una puede dividirse y diferenciarse en células tisulares organizadas y especializadas de una planta entera. Esta capacidad de regeneración total se llama totipotencia. La nueva planta que se originó a partir de una célula transformada con éxito puede tener nuevos rasgos hereditarios. El uso de la pistola genética puede contrastarse con el uso de Agrobacterium tumefaciens y su plásmido Ti para insertar ADN en células vegetales. Consulte transformación para conocer diferentes métodos de transformación en diferentes especies.

Humanos y otros animales

Las armas genéticas también se han utilizado para ofrecer vacunas contra el ADN.

La administración de plásmidos a neuronas de rata mediante el uso de una pistola genética, específicamente neuronas DRG, también se utiliza como precursor farmacológico en el estudio de los efectos de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer.

La pistola genética se ha convertido en una herramienta común para marcar subconjuntos de células en tejidos cultivados. Además de poder transfectar células con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes, la pistola genética se puede adaptar para administrar una amplia variedad de tintes vitales a las células.

El bombardeo con armas genéticas también se ha utilizado para transformar Caenorhabditis elegans, como alternativa a la microinyección.

Ventajas

La biolística ha demostrado ser un método versátil de modificación genética y generalmente se prefiere para diseñar cultivos resistentes a la transformación, como los cereales. En particular, el maíz Bt es un producto de la biolística. La transformación de plastidios también ha tenido un gran éxito con el bombardeo de partículas en comparación con otras técnicas actuales, como la transformación mediada por Agrobacterium, que tiene dificultades para dirigir el vector al cloroplasto y expresarlo de manera estable en él. Además, no hay informes de que un cloroplasto silencie un transgén insertado con una pistola genética. Además, con sólo disparar una pistola genética, un técnico cualificado puede generar dos organismos transformados en determinadas especies. Esta tecnología ha permitido incluso la modificación de tejidos específicos in situ, aunque es probable que esto dañe un gran número de células y transforme sólo algunas, en lugar de todas, las células del tejido.

Limitaciones

La biolística introduce ADN de forma aleatoria en las células diana. Por tanto, el ADN puede transformarse en cualquier genoma presente en la célula, ya sea nuclear, mitocondrial, plásmido o cualquier otro, en cualquier combinación, aunque un diseño de construcción adecuado puede mitigar esto. La entrega e integración de múltiples plantillas de la construcción de ADN es una posibilidad distinta, lo que da como resultado posibles niveles de expresión variables y números de copias del gen insertado. Esto se debe a la capacidad de las construcciones de dar y recibir material genético de otras construcciones, lo que hace que algunas no porten ningún transgén y otras porten múltiples copias; el número de copias insertadas depende tanto de cuántas copias del transgén tiene una construcción insertada como de cuántas se insertaron. Además, debido a que las construcciones eucariotas dependen de la recombinación ilegítima (un proceso mediante el cual el transgén se integra en el genoma sin secuencias genéticas similares) y no de la recombinación homóloga, no pueden dirigirse a ubicaciones específicas dentro del genoma, a menos que el transgén se entregue conjuntamente con Reactivos de edición del genoma.