Pirrolisina

Pirrolisina (símbolo Pyl o O; codificado por el codón de terminación 'ámbar' UAG) es un α-aminoácido que se utiliza en la biosíntesis de proteínas en algunas arqueas y bacterias metanogénicas; no está presente en los humanos. Contiene un grupo α-amino (que está en el protonado –NH⁺
₃ bajo condiciones biológicas), un ácido carboxílico (que se encuentra en la forma desprotonada –COO⁻ en condiciones biológicas). Su cadena lateral de pirrolina es similar a la de la lisina por ser básica y cargada positivamente a pH neutro.

Genética

Casi todos los genes se traducen usando solo 20 bloques de construcción de aminoácidos estándar. Dos aminoácidos inusuales codificados genéticamente son la selenocisteína y la pirrolisina. La pirrolisina se descubrió en 2002 en el sitio activo de la enzima metiltransferasa de un arqueón productor de metano, Methanosarcina barkeri. Este aminoácido está codificado por UAG (normalmente un codón de parada), y su síntesis e incorporación a la proteína está mediada por la maquinaria biológica codificada por el grupo de genes pylTSBCD.

Composición

Según lo determinado por cristalografía de rayos X y espectrometría de masas MALDI, la pirrolisina se compone de 4-metilpirrolina-5-carboxilato en enlace amida con el ^εN de lisina.

Síntesis

La pirrolisina se sintetiza in vivo al unir dos moléculas de L-lisina. Una molécula de lisina se convierte primero en (3R)-3-metil-D-ornitina, que luego se liga a una segunda lisina. Se elimina un grupo NH₂, seguido de un paso de ciclación y deshidratación para producir L-pirrolisina.

Función catalítica

El anillo de pirrolina adicional se incorpora al sitio activo de varias metiltransferasas, donde se cree que gira con relativa libertad. Se cree que el anillo está implicado en el posicionamiento y la visualización del grupo metilo de la metilamina para el ataque de un cofactor corrinoide. El modelo propuesto es que un residuo que contiene un ácido carboxílico cercano, el glutamato, se protona, y el protón puede luego transferirse al nitrógeno del anillo de imina, exponiendo el carbono del anillo adyacente a la adición nucleófila de la metilamina. El nitrógeno con carga positiva creado por esta interacción puede entonces interactuar con el glutamato desprotonado, provocando un cambio en la orientación del anillo y exponiendo el grupo metilo derivado de la metilamina a la hendidura de unión donde puede interactuar con el corrinoide. De esta forma, una red CH⁺
₃ se transfiere al átomo de cobalto del cofactor con un cambio de estado de oxidación de I a III. Luego se libera el amoníaco derivado de la metilamina, restaurando la imina original.

Codificación genética

A diferencia de las modificaciones postraduccionales de la lisina, como la hidroxilisina, la metillisina y la hipusina, la pirrolisina se incorpora durante la traducción (síntesis de proteínas) siguiendo las instrucciones del código genético, al igual que los aminoácidos estándar. Está codificado en el ARNm por el codón UAG, que en la mayoría de los organismos es el codón 'ámbar' codón de parada. Esto requiere solo la presencia del gen pylT, que codifica un ARN de transferencia inusual (ARNt) con un anticodón CUA, y el gen pylS, que codifica un aminoacil- ARNt sintetasa que carga el ARNt derivado de pylT con pirrolisina.

Este nuevo par tRNA-aaRS ("par ortogonal") es independiente de otras sintetasas y tRNA en Escherichia coli, y además posee cierta flexibilidad en el rango de aminoácidos procesados, lo que lo convierte en una herramienta atractiva para permitir la colocación de una gama posiblemente amplia de grupos químicos funcionales en ubicaciones especificadas arbitrariamente en proteínas modificadas. Por ejemplo, el sistema proporcionó uno de los dos fluoróforos incorporados en un sitio específico dentro de la calmodulina para permitir el examen en tiempo real de los cambios dentro de la proteína mediante espectroscopia FRET, y la introducción específica del sitio de un derivado de lisina fotoenjaulada. (Ver código genético ampliado)

Evolución

Los genes pylT y pylS forman parte de un operón de Methanosarcina barkeri, con homólogos en otros miembros secuenciados de Methanosarcinaceae familia: M. acetivorans, M. mazei y M. thermophila. Se sabe que los genes que contienen pirrolisina incluyen monometilamina metiltransferasa (mtmB), dimetilamina metiltransferasa (mtbB) y trimetilamina metiltransferasa (mttB). También se han encontrado homólogos de pylS y pylT en una arquea antártica, Methanosarcina barkeri y una bacteria Gram-positiva, Desulfitobacterium hafniense.

La ocurrencia en Desulfitobacterium es de especial interés, porque las bacterias y las arqueas son dominios separados en el sistema de tres dominios por el cual se clasifican los seres vivos. Cuando el uso del aminoácido pareció limitarse a Methanosarcinaceae, el sistema se describió como una "invención arqueológica tardía" por el cual se agregó un aminoácido 21 al código genético. Posteriormente se concluyó que "PylRS ya estuvo presente en los últimos ancestro común universal" hace unos 3 mil millones de años, pero solo persistió en organismos que usaban metilaminas como fuentes de energía. Otra posibilidad es que la evolución del sistema implicara una transferencia horizontal de genes entre microorganismos no relacionados. Los otros genes del operón Pyl median en la biosíntesis de pirrolisina, lo que conduce a la descripción del operón como un "cassette de expansión del código genético natural".

Existen algunas diferencias entre los sistemas bacterianos y arqueales estudiados. La homología con pylS se divide en dos proteínas separadas en D. hafniense. En particular, el codón UAG parece actuar como un codón de parada en muchas de las proteínas de ese organismo, con un solo uso establecido para codificar pirrolisina en ese organismo. Por el contrario, en las arqueas metanogénicas no fue posible identificar ninguna señal de parada UAG inequívoca. Porque solo había un sitio conocido donde se agrega pirrolisina en D. hafniense no fue posible determinar si alguna característica de secuencia adicional, análoga al elemento SECIS para la incorporación de selenocisteína, podría controlar cuando se agrega pirrolisina. Anteriormente se propuso que una secuencia descendente específica 'PYLIS', que formaba un bucle de tallo en el ARNm, forzaba la incorporación de pirrolisina en lugar de terminar la traducción en arqueas metanogénicas. Sin embargo, el modelo PYLIS ha perdido popularidad debido a la falta de homología estructural entre los elementos PYLIS y la falta de paradas UAG en esas especies.

Posibilidad de una traducción alternativa

El tRNA(CUA) puede cargarse de lisina in vitro mediante la acción concertada de la M. barkeri Clase I y Clase II Lisil-tRNA sintetasas, que no reconocen la pirrolisina. Originalmente, se planteó la hipótesis de que cargar un tRNA (CUA) con lisina sería el primer paso para traducir los codones ámbar UAG como pirrolisina, un mecanismo análogo al utilizado para la selenocisteína. Los datos más recientes favorecen la carga directa de pirrolisina en el tRNA (CUA) por el producto proteico del gen pylS, lo que sugiere que el complejo LysRS1:LysRS2 puede participar en una vía paralela diseñada para garantizar que las proteínas que contienen el codón UAG pueden traducirse completamente utilizando lisina como aminoácido sustituto en caso de deficiencia de pirrolisina. Un estudio adicional encontró que los genes que codifican LysRS1 y LysRS2 no son necesarios para el crecimiento normal en metanol y metilaminas con niveles normales de metiltransferasa, y no pueden reemplazar a pylS en un sistema recombinante para la supresión del codón de parada ámbar UAG.