PH intracelular

pH intracelular (pH_i) es la medida de la acidez o basicidad (es decir, pH) del líquido intracelular. El pH_i juega un papel crítico en el transporte de membrana y otros procesos intracelulares. En un ambiente con un pH_i inadecuado, las células biológicas pueden tener su función comprometida. Por lo tanto, el pH_i está estrechamente regulado para garantizar una función celular adecuada, un crecimiento celular controlado y procesos celulares normales. Los mecanismos que regulan el pH_i generalmente se consideran transportadores de la membrana plasmática, de los cuales existen dos tipos principales: los que son dependientes y los que son independientes de la concentración de bicarbonato (HCO ⁻
>₃). El pH intracelular fisiológicamente normal suele estar entre 7,0 y 7,4, aunque existe variabilidad entre los tejidos (p. ej., el músculo esquelético de los mamíferos tiende a tener un pH_i de 6,8 a 7,1). También hay una variación del pH entre diferentes orgánulos, que puede oscilar entre 4,5 y 8,0. El pH_i se puede medir de varias maneras diferentes.

Homeostasis

El pH intracelular suele ser más bajo que el pH extracelular debido a concentraciones más bajas de HCO₃^-. Un aumento de la presión parcial extracelular (p. ej., suero) de dióxido de carbono (pCO2) por encima de 45 mmHg conduce a la formación de ácido carbónico, lo que provoca una disminución del pH_i a medida que se disocia:

H₂O + CO₂ ⇌ H₂CO₃ ⇌ H⁺ + HCO₃^–

Dado que las células biológicas contienen líquido que puede actuar como tampón, el pH_i se puede mantener bastante bien dentro de un cierto rango. Las células ajustan su pH_i en consecuencia al aumentar la acidez o basicidad, generalmente con la ayuda de CO₂ o HCO₃^–sensores presentes en la membrana de la célula. Estos sensores pueden permitir que el H+ pase a través de la membrana celular en consecuencia, permitiendo que el pH_i se interrelacione con el pH extracelular a este respecto.

Los principales sistemas de amortiguación intracelulares incluyen aquellos que involucran proteínas o fosfatos. Dado que las proteínas tienen regiones ácidas y básicas, pueden servir como donantes o aceptores de protones para mantener un pH intracelular relativamente estable. En el caso de un tampón fosfato, cantidades sustanciales de ácido débil y base débil conjugada (H₂PO₄^– y HPO₄ ^2–) puede aceptar o donar protones en consecuencia para conservar el pH intracelular:

Oh.^– + H₂PO₄^– ⇌ H₂O + HPO₄^2-

H⁺ + HPO₄^2- ⇌ H₂PO₄^–

En organelles

El pH dentro de un orgánulo particular se adapta a su función específica.

Por ejemplo, los lisosomas tienen un pH relativamente bajo de 4,5. Además, las técnicas de microscopía de fluorescencia han indicado que los fagocitos también tienen un pH interno relativamente bajo. Dado que ambos son orgánulos degradativos que engullen y descomponen otras sustancias, requieren una alta acidez interna para poder realizar con éxito su función prevista.

En contraste con el pH relativamente bajo dentro de lysosomes y fagocitos, la matriz mitocondrial tiene un pH interno de alrededor de 8.0, que es aproximadamente 0,9 unidades de pH superior a la del espacio interior intermembrana. Puesto que la fosforilación oxidativa debe ocurrir dentro de la mitocondria, esta discrepancia de pH es necesaria para crear un gradiente a través de la membrana. Este potencial de membrana es en última instancia lo que permite que la mitocondria genere grandes cantidades de ATP.

Medición

Existen varias formas comunes de medir el pH intracelular (pH_i), incluso con un microelectrodo, un tinte sensible al pH o con técnicas de resonancia magnética nuclear. Para medir el pH dentro de los orgánulos, se puede utilizar una técnica que utiliza proteínas fluorescentes verdes (GFP) sensibles al pH.

En general, los tres métodos tienen sus propias ventajas y desventajas. Usar tintes es quizás el método más fácil y bastante preciso, mientras que la RMN presenta el desafío de ser relativamente menos precisa. Además, el uso de un microelectrodo puede resultar complicado en situaciones en las que las células son demasiado pequeñas o en las que la integridad de la membrana celular no debe alterarse. Las GFP son únicas porque proporcionan una forma no invasiva de determinar el pH dentro de diferentes orgánulos, pero este método no es la forma más cuantitativamente precisa de determinar el pH.

Microelectrodo

El método del microelectrodo para medir el pH_i consiste en colocar un electrodo muy pequeño en el citosol de la célula realizando un agujero muy pequeño en la membrana plasmática de la célula. Dado que el microelectrodo tiene un fluido con una alta concentración de H+ en su interior, en relación con el exterior del electrodo, se crea un potencial debido a la discrepancia de pH entre el interior y el exterior del electrodo. A partir de esta diferencia de voltaje y de un pH predeterminado para el fluido dentro del electrodo, se puede determinar el pH intracelular (pH_i) de la celda de interés.

Espectroscopia de fluorescencia

Otra forma de medir el pH intracelular (pH_i) es con tintes que son sensibles al pH y tienen una fluorescencia diferente en distintos valores de pH. Esta técnica, que utiliza espectroscopia de fluorescencia, consiste en añadir este colorante especial al citosol de una célula. Al excitar el tinte en la célula con energía de la luz y medir la longitud de onda de la luz liberada por el fotón cuando regresa a su estado de energía nativo, se puede determinar el tipo de tinte presente y relacionarlo con el pH intracelular de la célula dada. celúla.

Resonancia magnética nuclear

Además de utilizar tintes y electrodos sensibles al pH para medir el pH_i, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) también se puede utilizar para cuantificar el pH_i. La RMN, normalmente hablando, revela información sobre el interior de una célula al colocarla en un entorno con un potente campo magnético. Según la relación entre las concentraciones de formas protonadas y desprotonadas de compuestos de fosfato en una célula determinada, se puede determinar el pH interno de la célula. Además, la RMN también se puede utilizar para revelar la presencia de sodio intracelular, que también puede proporcionar información sobre el pH_i.

Utilizando espectroscopía de RMN se ha determinado que los linfocitos mantienen un pH interno constante de 7,17± 0,06, aunque, como todas las células, el pH intracelular cambia en la misma dirección que el pH extracelular.

GFP sensibles al PH

Para determinar el pH dentro de los orgánulos, a menudo se utilizan GFP sensibles al pH como parte de una técnica eficaz y no invasiva. Al utilizar ADNc como plantilla junto con los cebadores apropiados, el gen GFP puede expresarse en el citosol y las proteínas producidas pueden dirigirse a regiones específicas dentro de la célula, como las mitocondrias, el aparato de Golgi, el citoplasma y el retículo endoplásmico. Si en estos experimentos se utilizan ciertos mutantes de GFP que son altamente sensibles al pH en ambientes intracelulares, la cantidad relativa de fluorescencia resultante puede revelar el pH circundante aproximado.