Optogenética

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La optogenética es una técnica biológica que controla la actividad de neuronas u otros tipos de células mediante la luz. Esto se logra mediante la expresión de canales iónicos, bombas o enzimas fotosensibles específicamente en las células diana. A nivel celular, las enzimas y los factores de transcripción activados por la luz permiten un control preciso de las vías de señalización bioquímica. En neurociencia de sistemas, la capacidad de controlar la actividad de un conjunto de neuronas genéticamente definido se ha utilizado para comprender su contribución a la toma de decisiones, el aprendizaje, la memoria del miedo, el apareamiento, la adicción, la alimentación y la locomoción. En una primera aplicación médica de la tecnología optogenética, se recuperó parcialmente la visión en un paciente ciego con retinosis pigmentaria.También se han introducido técnicas optogenéticas para mapear la conectividad funcional del cerebro. Al alterar la actividad de neuronas genéticamente marcadas con luz y utilizar técnicas de imagen y electrofisiología para registrar la actividad de otras células, los investigadores pueden identificar las dependencias estadísticas entre las células y las regiones cerebrales.En un sentido más amplio, el campo de la optogenética también incluye métodos para registrar la actividad celular con indicadores codificados genéticamente.En 2010, la optogenética fue elegida como el «Método del Año» en todos los campos de la ciencia y la ingeniería por la revista de investigación interdisciplinaria «Nature Methods». Ese mismo año, un artículo sobre «Avances de la Década» en la revista de investigación académica Science destacó la optogenética.

Historia

En 1979, Francis Crick sugirió que controlar todas las células de un tipo en el cerebro, dejando las demás prácticamente inalteradas, representa un verdadero desafío para la neurociencia. Crick especuló que una tecnología que utiliza la luz podría ser útil para controlar la actividad neuronal con precisión temporal y espacial, pero en aquel momento no existía ninguna técnica para lograr que las neuronas respondieran a la luz.A principios de la década de 1990, LC Katz y E Callaway demostraron que la luz podía liberar el glutamato. En 1994, Heberle y Büldt ya habían demostrado la expresión heteróloga funcional de una bacteriorodopsina para el flujo iónico activado por la luz en levaduras.En 1995, Georg Nagel et al. y Ernst Bamberg probaron la expresión heteróloga de rodopsinas microbianas (también bacteriorrodopsina y también en un sistema no neuronal, ovocitos de Xenopus) (Georg Nagel et al., 1995, FEBS Lett.) y demostraron una corriente inducida por la luz.El primer método genéticamente dirigido que utilizaba luz para controlar neuronas sensibilizadas con rodopsina fue reportado en enero de 2002 por Boris Zemelman y Gero Miesenböck, quienes emplearon neuronas de mamíferos cultivadas con rodopsina de Drosophila. En 2003, Zemelman y Miesenböck desarrollaron un segundo método para la activación neuronal dependiente de la luz, en el cual los canales ionotrópicos individuales TRPV1, TRPM8 y P2X2 fueron regulados por ligandos fotoenjaulados en respuesta a la luz. A partir de 2004, los grupos de Kramer e Isacoff desarrollaron fotointerruptores orgánicos o compuestos "enjaulados reversiblemente" en colaboración con el grupo de Trauner que podían interactuar con canales iónicos introducidos genéticamente. La metodología TRPV1, aunque sin el activador de la iluminación, fue posteriormente utilizada por varios laboratorios para alterar la alimentación, la locomoción y la resiliencia conductual en animales de laboratorio. Sin embargo, los métodos basados en la luz para alterar la actividad neuronal no se aplicaron fuera de los laboratorios originales, probablemente porque la canalrodopsina, más fácil de emplear, se clonó poco después.Peter Hegemann, al estudiar la respuesta lumínica de las algas verdes en la Universidad de Ratisbona, descubrió fotocorrientes demasiado rápidas para ser explicadas por las clásicas rodopsinas animales acopladas a la proteína G. En colaboración con el electrofisiólogo Georg Nagel, del Instituto Max Planck de Fráncfort, pudieron demostrar que un solo gen del alga Chlamydomonas producía grandes fotocorrientes al expresarse en el ovocito de una rana. Para identificar las células que expresaban la fotocorriente, reemplazaron la cola citoplasmática de la proteína del alga con una proteína fluorescente YFP, generando la primera herramienta optogenética de aplicación general. En un artículo de 2003, afirmaron que «la expresión de ChR2 en ovocitos o células de mamíferos puede utilizarse como una herramienta poderosa para aumentar la concentración citoplasmática de Ca2+ o para despolarizar la membrana celular, simplemente mediante iluminación».Karl Deisseroth, del Departamento de Bioingeniería de Stanford, publicó las páginas de su cuaderno de notas de principios de julio de 2004 sobre su experimento inicial, que mostraba la activación lumínica de neuronas que expresaban una canalrodopsina. En agosto de 2005, su equipo de laboratorio, incluyendo a los estudiantes de posgrado Ed Boyden y Feng Zhang, en colaboración con Georg Nagel, publicó la primera demostración de un sistema optogenético de un solo componente en neuronas, utilizando el mutante canalrodopsina-2(H134R)-eYFP de Georg Nagel, el primer mutante de la canalrodopsina-2 desde su caracterización funcional por Georg Nagel y Hegemann.Zhuo-Hua Pan, de la Universidad Estatal de Wayne, investigando cómo restaurar la visión en personas con ceguera, probó la canalrodopsina en células ganglionares, las neuronas del ojo humano que se conectan directamente con el cerebro. La primera observación de Pan sobre la activación óptica de las neuronas retinianas con canalrodopsina tuvo lugar en febrero de 2004, según Pan, cinco meses antes de la observación inicial de Deisseroth en julio de 2004. De hecho, las neuronas transfectadas se activaron eléctricamente en respuesta a la luz, y en 2005 Zhuo-Hua Pan informó sobre la transfección exitosa in vivo de canalrodopsina en células ganglionares retinianas de ratones, así como sobre las respuestas eléctricas a la fotoestimulación en cultivos de cortes de retina. Este enfoque fue finalmente implementado en un paciente humano por Botond Roska y colaboradores en 2021.En abril de 2005, Susana Lima y Miesenböck informaron del primer uso de la fotoestimulación P2X2 genéticamente dirigida para controlar el comportamiento de un animal. Demostraron que la fotoestimulación de grupos de neuronas genéticamente circunscritos, como los del sistema dopaminérgico, provocaba cambios conductuales característicos en las moscas de la fruta.En octubre de 2005, Lynn Landmesser y Stefan Herlitze también publicaron el uso de la canalrodopsina-2 para controlar la actividad neuronal en neuronas hipocampales cultivadas y circuitos de médula espinal de pollo en embriones intactos en desarrollo. Además, introdujeron por primera vez la rodopsina de vertebrados, un receptor acoplado a proteína G activado por luz, como herramienta para inhibir la actividad neuronal mediante el reclutamiento de vías de señalización intracelular, también en neuronas hipocampales y en embriones intactos de pollo en desarrollo.Los grupos de Alexander Gottschalk y Georg Nagel crearon el primer mutante ChR2 (H134R) y fueron los primeros en utilizar la canalrodopsina-2 para controlar la actividad neuronal en un animal intacto, demostrando que los patrones motores en el nematodo C. elegans podían evocarse mediante la estimulación lumínica de circuitos neuronales genéticamente seleccionados (publicado en diciembre de 2005). En ratones, la expresión controlada de herramientas optogenéticas se logra a menudo con métodos Cre/loxP específicos para cada tipo celular, desarrollados para neurociencia por Joe Z. Tsien en la década de 1990 para activar o inhibir regiones cerebrales y tipos celulares específicos in vivo.En 2007, los laboratorios de Boyden y Deisseroth (junto con los grupos de Gottschalk y Georg Nagel) informaron simultáneamente de la exitosa inhibición optogenética de la actividad neuronal.En 2007, los grupos de Georg Nagel y Hegemann iniciaron la manipulación optogenética del AMPc. En 2014, Avelar et al. informaron del primer gen de rodopsina-guanilil ciclasa de hongos. En 2015, Scheib et al. y Gao et al. caracterizaron la actividad del gen de rodopsina-guanilil ciclasa. Shiqiang Gao et al., Georg Nagel y Alexander Gottschalk lo identificaron como la primera rodopsina de 8 TM.

Descripción

Fig 1. Channelrhodopsin-2 (ChR2) induce actividad temporalmente precisa de luz azul derivada en las neuronas corticales prelimbias de rata. a) In vitro schematic (izquierda) mostrando la entrega de luz azul y la grabación de parche de células enteras de la actividad evocada por la luz de un fluorescente CaMKllα::ChR2-EYFP expresando neurona piramidal (derecha) en una rebanada cerebral aguda. b) In vivo esquemática (izquierda) mostrando luz azul (473 nm) entrega y grabación de una sola unidad. Rebanada cerebral coronal mostrando expresión de CaMKllα::ChR2-EYFP en la región prelimbia. La flecha azul ligera muestra la punta de la fibra óptica; la flecha negra muestra la punta del electrodo de grabación (izquierda). Barra blanca, 100 μm. In vivo grabación de luz de la neurona cortical prefrontal en un CaMKllα transducido::ChR2-EYFP rata que muestra el araña ligeramente evocada a 20 Hz entrega de pulsos de luz azul (derecha). Inset, representative light-evoked single-unit response.
Fig 2. Halorhodopsin (NpHR) silencia rápidamente y reversiblemente la actividad espontánea in vivo en la corteza prefrontal de rata prelimbia. (Top left) in vivo verde (532 nm) entrega de luz y registro de una unidad de una CaMKllα espontáneamente activa::eNpHR3.0- EYFP expresando neurona piramidal. (Right) Ejemplo de traza que muestra que la iluminación continua de 532 nm inhibe la actividad de unidad única in vivo. Inset, evento único representativo; barra verde, 10 segundos.
Un nematodo que expresa el canal de iones sensible a la luz Mac. Mac es una bomba de protón originalmente aislada en el hongo Leptosphaeria maculans y ahora expresado en las células musculares C. elegans que se abre en respuesta a la luz verde y causa la inhibición hiperpolarizante. Cabe destacar la extensión de la longitud corporal que el gusano sufre cada vez que está expuesto a la luz verde, que presumiblemente es causada por los efectos relajanos musculares de Mac.
Un nematodo que expresa ChR2 en su grupo muscular gubernacular-oblique respondiendo a la estimulación por la luz azul. La estimulación de la luz azul hace que los músculos oblicuos gubernacular se contraigan repetidamente, causando empujes repetitivos de la espíla, como se vería naturalmente durante la copulación.
La optogenética proporciona una precisión temporal de milisegundos que permite al experimentador mantenerse al día con el rápido procesamiento de la información biológica (por ejemplo, al investigar la función causal de patrones específicos de potenciales de acción en neuronas definidas). De hecho, para investigar el código neuronal, la optogenética, por definición, debe operar en la escala de tiempo de milisegundos para permitir la adición o eliminación de patrones de actividad precisos dentro de células específicas en los cerebros de animales intactos, incluidos los mamíferos (véase la Figura 1). En comparación, la precisión temporal de las manipulaciones genéticas tradicionales (empleadas para investigar la función causal de genes específicos dentro de las células, mediante cambios de «pérdida de función» o «ganancia de función» en estos genes) es bastante lenta, desde horas o días hasta meses. Es importante también contar con lecturas rápidas en optogenética que puedan seguir el ritmo del control óptico. Esto puede lograrse mediante registros eléctricos (optrodos) o con proteínas reporteras que actúan como biosensores, donde los científicos han fusionado proteínas fluorescentes con proteínas detectoras. Además, más allá de su impacto científico, la optogenética representa un importante caso de estudio sobre el valor tanto de la conservación ecológica (ya que muchas de las herramientas clave de la optogenética surgen de organismos microbianos que ocupan nichos ambientales especializados) como de la importancia de la ciencia básica pura, ya que estas opsinas fueron estudiadas durante décadas por su propio interés por biofísicos y microbiólogos, sin considerar su potencial valor para el desarrollo de conocimientos en neurociencia y enfermedades neuropsiquiátricas.

Proteínas activadas por luz: canales, bombas y enzimas

El sello distintivo de la optogenética, por lo tanto, es la introducción de canales, bombas y enzimas rápidas activadas por luz que permiten la manipulación temporal precisa de eventos eléctricos y bioquímicos, manteniendo al mismo tiempo la resolución celular mediante mecanismos de focalización específicos. Entre las opsinas microbianas que pueden utilizarse para investigar la función de los sistemas neuronales se encuentran las canalrodopsinas (ChR2, ChR1, VChR1 y SFO) para excitar neuronas, y las canalrodopsinas conductoras de aniones para la inhibición inducida por la luz. Recientemente, se han diseñado canales de potasio controlados indirectamente por luz para prevenir la generación de potenciales de acción en neuronas durante la iluminación con luz azul. Las bombas de iones impulsadas por luz también se utilizan para inhibir la actividad neuronal, por ejemplo, la halorrodopsina (NpHR), las halorrodopsinas mejoradas (eNpHR2.0 y eNpHR3.0, véase la Figura 2), la arquerodopsina (Arch), las opsinas fúngicas (Mac) y la bacteriorrodopsina mejorada (eBR).

El control optogenético de eventos bioquímicos bien definidos en mamíferos en comportamiento también es ahora posible. Basándose en trabajos previos que fusionaban opsinas de vertebrados con receptores específicos acoplados a proteínas G, se creó una familia de herramientas optogenéticas quiméricas de un solo componente que permitieron a los investigadores manipular, en mamíferos en comportamiento, la concentración de mensajeros intracelulares definidos, como el AMPc y el IP3, en células diana. Poco después, se desarrollaron otros enfoques bioquímicos para la optogenética (fundamentalmente, con herramientas que mostraban baja actividad en la oscuridad), cuando se logró el control óptico sobre pequeñas GTPasas y adenilil ciclasas en células cultivadas mediante estrategias novedosas de diversos laboratorios. Se han descubierto adenilil ciclasas fotoactivadas en hongos y se han utilizado con éxito para controlar los niveles de AMPc en neuronas de mamíferos. Este repertorio emergente de actuadores optogenéticos permite ahora un control específico para cada tipo celular y con precisión temporal de múltiples ejes de la función celular en animales intactos.

Hardware para aplicaciones ligeras

Otro factor necesario es el hardware (p. ej., fuentes de luz integradas de fibra óptica y de estado sólido) que permite controlar tipos específicos de células, incluso en las profundidades del cerebro, en animales en libertad. Esto último se consigue habitualmente mediante la tecnología de diodos acoplados a fibra óptica, introducida en 2007. Sin embargo, para evitar el uso de electrodos implantados, los investigadores han diseñado formas de inscribir una "ventana" de zirconio, modificada para ser transparente, e implantada en cráneos de ratones. Esto permite que las ondas ópticas penetren más profundamente y estimulen o inhiban neuronas individuales. Para estimular áreas cerebrales superficiales, como la corteza cerebral, se pueden montar fibras ópticas o LED directamente en el cráneo del animal. Se han utilizado fibras ópticas implantadas a mayor profundidad para suministrar luz a áreas cerebrales más profundas. Como complemento a los enfoques basados en fibra, se han desarrollado técnicas completamente inalámbricas que utilizan energía suministrada de forma inalámbrica a LED colocados en la cabeza para el estudio sin obstáculos de comportamientos complejos en organismos en libertad.

Expresión de actuadores optogenéticos

La optogenética también incluye necesariamente el desarrollo de estrategias de focalización genética, como promotores celulares específicos u otros virus condicionalmente activos personalizados, para dirigir las sondas fotosensibles a poblaciones específicas de neuronas en el cerebro de animales vivos (p. ej., gusanos, moscas de la fruta, ratones, ratas y monos). En invertebrados como gusanos y moscas de la fruta, se suplementa cierta cantidad de all-trans-retinal (ATR) con los alimentos. Una ventaja clave de las opsinas microbianas, como se mencionó anteriormente, es que son completamente funcionales sin la adición de cofactores exógenos en vertebrados.

Técnica

Tres componentes primarios en la aplicación de la optogenética son los siguientes (A) Identificación o síntesis de una proteína sensible a la luz (opsin) como canalrhodopsin-2 (ChR2), halorhodopsin (NpHR), etc... (B) El diseño de un sistema para introducir el material genético que contiene el olfato en células para la expresión de proteínas como la aplicación de Cre recombinase o un virus asociado adeno (C) aplicación de instrumentos emisores de luz.
La técnica de la optogenética es flexible y se adapta a las necesidades del experimentador. Las canalrodopsinas selectivas de cationes (p. ej., ChR2) se utilizan para excitar neuronas, mientras que las canalrodopsinas conductoras de aniones (p. ej., GtACR2) inhiben la actividad neuronal. La combinación de estas herramientas en una sola construcción (p. ej., BiPOLES) permite tanto la inhibición como la excitación, dependiendo de la longitud de onda de la iluminación.Introducir la opsina microbiana en un subconjunto específico de células es un desafío. Un enfoque popular consiste en introducir un vector viral diseñado que contiene el gen actuador optogenético unido a un promotor específico como CAMKIIα, activo en neuronas excitatorias. Esto permite cierto nivel de especificidad, previniendo, por ejemplo, la expresión en células gliales.Un enfoque más específico se basa en ratones transgénicos "conductores" que expresan la recombinasa Cre, una enzima que cataliza la recombinación entre dos sitios lox-P, en un subconjunto específico de células, por ejemplo, las interneuronas que expresan parvalbúmina. Al introducir un vector viral modificado que contiene el gen del actuador optogenético entre dos sitios lox-P, solo las células productoras de la recombinasa Cre expresarán la opsina microbiana. Esta técnica ha permitido utilizar múltiples actuadores optogenéticos modificados sin necesidad de crear una línea completa de animales transgénicos cada vez que se necesita una nueva opsina microbiana.Tras la introducción y expresión de la opsina microbiana, es necesario acoplar ópticamente una fuente de luz controlada por computadora a la región cerebral en cuestión. Se utilizan con frecuencia diodos emisores de luz (LED) o láseres de estado sólido bombeados por diodos acoplados a fibra (DPSS). Entre los avances recientes se incluye la aparición de dispositivos inalámbricos que se colocan en la cabeza y que aplican LED a las áreas objetivo, lo que proporciona a los animales mayor libertad de movimiento.Los enfoques basados en fibra también pueden utilizarse para combinar la estimulación óptica con la obtención de imágenes de calcio. Esto permite a los investigadores visualizar y manipular la actividad de neuronas individuales en animales despiertos. También es posible registrar simultáneamente múltiples regiones cerebrales profundas mediante lentes GRIN conectadas mediante fibra óptica a un fotodetector y un fotoestimulador externos.

Problemas técnicos

Expresión selectiva

Uno de los principales problemas de la optogenética es que no todas las células en cuestión pueden expresar el gen de la opsina microbiana al mismo nivel. Por lo tanto, incluso la iluminación con una intensidad luminosa definida tendrá efectos variables en cada célula. La estimulación optogenética de las neuronas cerebrales es aún menos controlada, ya que la intensidad de la luz de la fuente luminosa (p. ej., fibra óptica implantada) disminuye exponencialmente.Sigue siendo difícil dirigir la opsina a compartimentos subcelulares definidos, como la membrana plasmática, las vesículas sinápticas o las mitocondrias. Restringir la opsina a regiones específicas de la membrana plasmática, como las dendritas, los somas o las terminales axónicas, proporciona una comprensión más sólida de los circuitos neuronales.El modelado matemático muestra que la expresión selectiva de opsina en tipos celulares específicos puede alterar drásticamente el comportamiento dinámico del circuito neuronal. En particular, la estimulación optogenética, dirigida preferentemente a las células inhibidoras, puede transformar la excitabilidad del tejido neuronal, afectando también a las neuronas no transfectadas.

Kinética y sincronización

La canalrodopsina-2 original se cerraba más lentamente que los canales catiónicos típicos de las neuronas corticales, lo que provocaba una despolarización prolongada y una mayor entrada de calcio. Desde entonces, se han diseñado numerosas variantes de la canalrodopsina con una cinética más favorable.[55] [56]

Una diferencia entre los patrones de picos naturales y la activación optogenética radica en que la estimulación con luz pulsada produce una activación sincrónica de las neuronas que se expresan, lo que elimina la posibilidad de actividad secuencial en la población estimulada. Por lo tanto, resulta difícil comprender cómo se comunican entre sí las células de la población afectada o cómo se relacionan sus propiedades fásicas de activación con el funcionamiento del circuito.La activación optogenética se ha combinado con la resonancia magnética funcional (RMf) para dilucidar el conectoma, un mapa exhaustivo de las conexiones neuronales del cerebro. La activación optogenética sincronizada con precisión se utiliza para calibrar la señal hemodinámica retardada (BOLD) en la que se basa la RMf.

espectro de absorción de luz

Las proteínas opsinas actualmente en uso presentan picos de absorción en todo el espectro visual, pero siguen siendo considerablemente sensibles a la luz azul. Esta superposición espectral dificulta enormemente la combinación de la activación de la opsina con indicadores genéticamente codificados (GEVI, GECI, GluSnFR, sinapto-pHluorina), la mayoría de los cuales requieren excitación con luz azul. Las opsinas con activación infrarroja, con un valor de irradiancia estándar, aumentarían la penetración de la luz y la resolución mediante la reducción de la dispersión de la luz.

Respuesta espacial

Debido a la dispersión, un haz de luz estrecho para estimular neuronas en una zona de tejido neural puede generar un perfil de respuesta mucho más amplio que el del haz de estimulación. En este caso, las neuronas pueden activarse (o inhibirse) involuntariamente. Se utilizan herramientas de simulación computacional para estimar el volumen de tejido estimulado para diferentes longitudes de onda de luz.

Aplicaciones

El campo de la optogenética ha profundizado en la comprensión científica fundamental de cómo tipos celulares específicos contribuyen a la función de tejidos biológicos, como los circuitos neuronales, in vivo. En el ámbito clínico, la investigación basada en la optogenética ha generado conocimientos sobre la restauración con luz[1], la enfermedad de Parkinson y otros trastornos neurológicos y psiquiátricos como el autismo, la esquizofrenia, la drogadicción, la ansiedad y la depresión. Un tratamiento experimental para la ceguera implica un canal de rodopsina expresado en células ganglionares, estimulado con patrones de luz de gafas diseñadas.

Identificación de neuronas y redes particulares

Amygdala

Se han utilizado enfoques optogenéticos para mapear los circuitos neuronales de la amígdala que contribuyen al condicionamiento del miedo. Un ejemplo de circuito neuronal es la conexión que se establece entre la amígdala basolateral y la corteza prefrontal dorsomedial, donde se han observado oscilaciones neuronales de 4 Hz en correlación con la inmovilización inducida por el miedo en ratones. Se introdujo canalrodopósina-2 en ratones transgénicos unidos a un promotor de parvalbúmina-Cre, que infectó selectivamente las interneuronas ubicadas tanto en la amígdala basolateral como en la corteza prefrontal dorsomedial, responsables de las oscilaciones de 4 Hz. Las interneuronas se estimularon ópticamente generando una inmovilización, lo que demostró que estas oscilaciones de 4 Hz podrían ser responsables de la respuesta básica al miedo producida por las poblaciones neuronales a lo largo de la corteza prefrontal dorsomedial y la amígdala basolateral.

Bombilla olfativa

La activación optogenética de las neuronas sensoriales olfativas fue crucial para demostrar la sincronización del procesamiento de olores y para el mecanismo de las conductas olfativas guiadas por neuromodulación (p. ej., agresión, apareamiento). Además, con la ayuda de la optogenética, se ha reproducido evidencia que demuestra que la "remanente" de los olores se concentra más centralmente alrededor del bulbo olfatorio que en la periferia, donde se ubicarían las neuronas receptoras olfativas. Ratones transgénicos infectados con el canal de rodopsina Thy1-ChR2 fueron estimulados con un láser de 473 nm colocado transcranealmente sobre la sección dorsal del bulbo olfatorio. La fotoestimulación prolongada de las células mitrales en el bulbo olfatorio condujo a observaciones de una actividad neuronal más duradera en la región después de cesar la fotoestimulación, lo que significa que el sistema sensorial olfativo es capaz de experimentar cambios a largo plazo y reconocer diferencias entre olores antiguos y nuevos.

Nucleus accumbens

La optogenética, el comportamiento de mamíferos en movimiento, la electrofisiología in vivo y la fisiología de cortes se han integrado para explorar las interneuronas colinérgicas del núcleo accumbens mediante excitación o inhibición directa. A pesar de representar menos del 1% de la población total de neuronas accumbales, estas células colinérgicas pueden controlar la actividad de las terminales dopaminérgicas que inervan las neuronas espinosas medianas (NME) en el núcleo accumbens. Se sabe que estas NME accumbales participan en la vía neuronal a través de la cual la cocaína ejerce sus efectos, ya que se ha demostrado que la disminución de los cambios inducidos por la cocaína en la actividad de estas neuronas inhibe el condicionamiento a la cocaína. Las pocas neuronas colinérgicas presentes en el núcleo accumbens podrían ser dianas viables para la farmacoterapia en el tratamiento de la dependencia a la cocaína.

Corteza frontal

jaulas para rata equipada con conmutadores LED optogenéticos que permiten in vivo estudio del comportamiento animal durante las estimulaciones optogenéticas
Grabaciones in vivo e in vitro del Laboratorio de Optofisiología de la Universidad de Colorado, Boulder, del Dr. Donald C. Cooper, que muestran neuronas piramidales individuales que expresan CAMKII AAV-ChR2 en la corteza prefrontal, las cuales mostraron una salida de potencial de acción de alta fidelidad con pulsos cortos de luz azul a 20 Hz (Figura 1).

Corteza motora

La estimulación optogenética repetida in vivo en animales sanos logró inducir convulsiones. Este modelo se ha denominado optokindling.

Corteza piriforme

In vivo, la estimulación optogenética repetida de las células piramidales de la corteza piriforme en animales sanos logró inducir convulsiones. Estudios in vitro han revelado una pérdida de la inhibición por retroalimentación en el circuito piriforme debido a una síntesis deficiente de GABA.

Corazón

Se aplicó la optogenética a cardiomiocitos auriculares para corregir con luz las arritmias de ondas espirales presentes en la fibrilación auricular. Este método aún se encuentra en desarrollo. Un estudio reciente exploró las posibilidades de la optogenética como método para corregir arritmias y resincronizar la estimulación cardíaca. El estudio introdujo canalrodopsina-2 en cardiomiocitos de las áreas ventriculares de corazones de ratones transgénicos y realizó estudios in vitro de fotoestimulación en ratones de cavidad abierta y cerrada. La fotoestimulación provocó una mayor activación celular y, por lo tanto, un aumento de las contracciones ventriculares, lo que resultó en un aumento de la frecuencia cardíaca. Además, este enfoque se ha aplicado en la terapia de resincronización cardíaca (TRC) como un nuevo marcapasos biológico que sustituye a la TRC con electrodos. Últimamente, la optogenética se ha utilizado en el corazón para desfibrilar arritmias ventriculares con iluminación epicárdica local, iluminación generalizada de todo el corazón o con patrones de estimulación personalizados basados en mecanismos arritmogénicos para reducir la energía de desfibrilación.

Pandilla espiral

La estimulación optogenética del ganglio espiral en ratones sordos restauró la actividad auditiva. La aplicación optogenética en la región coclear permite la estimulación o inhibición de las células ganglionares espirales (CGE). Además, debido a las características de los potenciales de reposo de las CGE, se han empleado diferentes variantes de la proteína canalrodopsina-2, como Chronos, CatCh y f-Chrimson. Las variantes de Chronos y CatCh son particularmente útiles, ya que permanecen menos tiempo en sus estados desactivados, lo que permite una mayor actividad con menos ráfagas de luz azul emitidas. Asimismo, el uso de canales modificados con desplazamiento al rojo, como f-Chrimson, permite la estimulación con longitudes de onda más largas, lo que disminuye los riesgos potenciales de fototoxicidad a largo plazo sin comprometer la velocidad de activación. Como resultado, el LED que produce la luz requeriría menos energía y la idea de prótesis cocleares asociadas con la fotoestimulación sería más viable.

Cerebro

La estimulación optogenética de una canalrodopsina modificada excitable por luz roja (ReaChR), expresada en el núcleo motor facial, permitió la activación mínimamente invasiva de motoneuronas eficaces para impulsar los movimientos de los bigotes en ratones. Un estudio novedoso empleó la optogenética en el núcleo del rafe dorsal para activar e inhibir la liberación dopaminérgica en el área tegmental ventral. Para producir la activación, se infectaron ratones transgénicos con canalrodopsina-2 con un promotor TH-Cre y, para producir inhibición, se añadió la opsina hiperpolarizante NpHR a dicho promotor. Los resultados mostraron que la activación óptica de las neuronas dopaminérgicas condujo a un aumento de las interacciones sociales, y su inhibición disminuyó la necesidad de socializar solo después de un período de aislamiento.

Sistema visual

Estudiar el sistema visual mediante optogenética puede ser un desafío. De hecho, la luz empleada para el control optogenético puede provocar la activación de fotorreceptores debido a la proximidad entre los circuitos visuales primarios y estos fotorreceptores. En este caso, la selectividad espacial es difícil de lograr (particularmente en el caso del lóbulo óptico de la mosca). Por lo tanto, el estudio del sistema visual requiere separación espectral, utilizando canales que se activan con longitudes de onda de luz diferentes a las de las rodopsinas dentro de los fotorreceptores (activación máxima a 480 nm para la rodopsina 1 en Drosophila). La CsChrimson desplazada al rojo o la canalrodopsina biestable se utilizan para la activación optogenética de neuronas (es decir, la despolarización), ya que ambas permiten la separación espectral. Para lograr el silenciamiento neuronal (es decir, la hiperpolarización), se puede utilizar una canalrodopsina aniónica descubierta en la especie de alga criptofita Guillardia theta (denominada GtACR1). GtACR1 es más sensible a la luz que otros canales inhibidores, como las bombas de cloruro de la clase Halorrodopsina, y presenta una conductancia fuerte. Dado que su pico de activación (515 nm) es cercano al de la Rodopsina 1, es necesario calibrar cuidadosamente la iluminación optogenética, así como el estímulo visual. Los factores a considerar son la longitud de onda de la iluminación optogenética (posiblemente mayor que el pico de activación de GtACR1), el tamaño del estímulo (para evitar la activación de los canales por la luz del estímulo) y la intensidad de la iluminación optogenética. Se ha demostrado que GtACR1 puede ser una herramienta inhibidora útil en el estudio optogenético del sistema visual de Drosophila al silenciar la expresión de las neuronas T4/T5. Estos estudios también pueden realizarse en animales intactos con comportamiento, por ejemplo, para investigar la respuesta optomotora.

Sistema sensorimotor

La inhibición o activación optogenética de neuronas evalúa su necesidad y suficiencia, respectivamente, para generar un comportamiento. Con este enfoque, los investigadores pueden analizar los circuitos neuronales que controlan la respuesta motora. Al perturbar neuronas en diversas partes del sistema sensoriomotor, los investigadores han aprendido sobre el papel de las neuronas descendentes en la generación de comportamientos estereotipados, cómo la información sensorial táctil localizada y la actividad de las interneuronas altera la locomoción, y el papel de las células de Purkinje en la generación y modulación del movimiento. Esta es una técnica eficaz para comprender los fundamentos neuronales de la locomoción y el movimiento animal de forma más amplia.

Control temporal preciso de las intervenciones

Los actuadores optogenéticos disponibles actualmente permiten un control temporal preciso de la intervención requerida (es decir, inhibición o excitación de las neuronas objetivo) con una precisión que suele ser de milisegundos. Sin embargo, la precisión temporal varía según el actuador optogenético y depende de la frecuencia e intensidad de la estimulación.Ahora se pueden diseñar experimentos en los que la luz utilizada para la intervención se activa mediante un elemento específico de la conducta (para inhibirla), un estímulo incondicionado específico (para asociar algo con dicho estímulo) o un evento oscilatorio específico en el cerebro (para inhibir el evento). Este tipo de enfoque ya se ha utilizado en varias regiones cerebrales:

Hippocampus

Las ondas agudas y complejos de ondulación (SWR) son eventos oscilatorios de alta frecuencia distintivos en el hipocampo que se cree que desempeñan un papel en la formación y consolidación de la memoria. Estos eventos pueden detectarse fácilmente siguiendo los ciclos oscilatorios del potencial de campo local registrado en línea. De esta manera, el inicio del evento puede utilizarse como señal de activación para un destello de luz que se dirige de vuelta al hipocampo para inhibir neuronas específicamente durante las SWR y también para inhibir optogenéticamente la propia oscilación. Este tipo de experimentos de "bucle cerrado" son útiles para estudiar los complejos SWR y su papel en la memoria.

Biología celular/vías de señalización celular

Control optogenético de las fuerzas celulares e inducción de la mechanotransducción. Las células imaginadas reciben una hora de imagen concurrente con la luz azul que pulsa cada 60 segundos. Esto también se indica cuando el punto azul aparece en la imagen. La célula se relaja por una hora sin activación de la luz y luego este ciclo repite de nuevo. El conjunto cuadrado magnifica el núcleo de la célula.
De forma similar a cómo los canales iónicos fotodependientes, como la canalrodopsina-2, permiten el control óptico del flujo iónico, especialmente útil en neurociencia, las proteínas de transducción de señales fotodependientes también permiten el control óptico de las vías bioquímicas, incluyendo la generación de segundos mensajeros y las interacciones proteína-proteína, especialmente útiles en el estudio de la biología celular y del desarrollo. En 2002, se demostró el primer ejemplo del uso de fotoproteínas de otro organismo para controlar una vía bioquímica mediante la interacción fotoinducida entre el fitocromo vegetal y el factor de interacción con el fitocromo (PIF) para controlar la transcripción génica en levaduras. Al fusionar el fitocromo con un dominio de unión al ADN y el PIF con un dominio de activación transcripcional, la luz podría inducir la activación transcripcional de los genes reconocidos por el dominio de unión al ADN. Este estudio anticipó aspectos del desarrollo posterior de la optogenética en el cerebro, por ejemplo, al sugerir que «la administración de luz dirigida mediante fibra óptica tiene el potencial de dirigirse a células o tejidos específicos, incluso en organismos más grandes y opacos». La literatura ha sido inconsistente en cuanto a si el control de la bioquímica celular con fotoproteínas debería incluirse en la definición de optogenética, ya que el término optogenética, en el uso común, se refiere específicamente al control de la activación neuronal con opsinas, y dado que el control de la activación neuronal con opsinas es posterior al control de la bioquímica celular con fotoproteínas y utiliza mecanismos distintos.

Proteínas fotosensibles utilizadas en varias vías de señalización celular

Además de los fitocromos, presentes en plantas y cianobacterias, los dominios LOV (dominio sensor de luz, oxígeno y voltaje) de plantas y levaduras, así como los dominios criptocromos de plantas, son otros dominios fotosensoriales naturales que se han utilizado para el control óptico de vías bioquímicas celulares. Asimismo, se ha diseñado un dominio fotosensor sintético a partir de la proteína fluorescente Dronpa para el control óptico de vías bioquímicas. En los dominios fotosensoriales, la absorción de luz se asocia a un cambio en las interacciones proteína-proteína (en el caso de los fitocromos, algunos dominios LOV, criptocromos y mutantes de Dronpa) o a un cambio conformacional que expone un segmento proteico ligado o altera la actividad de un dominio proteico ligado (en el caso de los fitocromos y algunos dominios LOV). Las interacciones proteína-proteína reguladas por la luz pueden utilizarse para reclutar proteínas al ADN, por ejemplo, para inducir la transcripción génica o modificaciones del ADN, o a la membrana plasmática, por ejemplo, para activar proteínas señalizadoras residentes. CRY2 también se agrupa cuando está activo, por lo que se ha fusionado con dominios de señalización y posteriormente se ha fotoactivado para permitir la activación basada en agrupamiento. El dominio LOV2 de Avena sativa (avena común) se ha utilizado para exponer péptidos cortos o un dominio proteico activo de forma fotodependiente. La introducción de este dominio LOV en otra proteína puede regular la función mediante un trastorno peptídico inducido por la luz. La proteína asLOV2, que expone optogenéticamente un péptido, también se ha utilizado como andamiaje para varios sistemas sintéticos de dimerización y disociación inducida por la luz (iLID y LOVTRAP, respectivamente). Estos sistemas pueden utilizarse para controlar proteínas mediante una estrategia de división proteica. Los dominios Dronpa fotodisociables también se han utilizado para encapsular un sitio activo de proteína en la oscuridad, liberarlo tras la iluminación con luz cian y reencapsularlo tras la iluminación con luz violeta.

Control temporal de transducción de señal con luz

Se está explorando la capacidad de controlar ópticamente señales durante diferentes periodos de tiempo para dilucidar cómo las vías de señalización celular convierten la duración y la respuesta de la señal en diferentes señales. Las cascadas de señalización natural son capaces de responder con diferentes señales a las diferencias en la duración y la dinámica del estímulo. Por ejemplo, el tratamiento de células PC12 con factor de crecimiento epidérmico (EGF, que induce un perfil transitorio de actividad de ERK) conduce a la proliferación celular, mientras que la introducción de factor de crecimiento nervioso (NGF, que induce un perfil sostenido de actividad de ERK) conduce a la diferenciación en células neuronales. Este comportamiento se caracterizó inicialmente mediante la aplicación de EGF y NGF, pero el hallazgo se ha replicado parcialmente con señales ópticas. Además, se descubrió un bucle de retroalimentación negativa rápida en la vía RAF-MEK-ERK mediante la activación pulsátil de un RAF fotoconmutable diseñado con dominios Dronpa fotodisociables.

Fotoestimulación de ruido otogenético

El grupo de investigación del profesor Elías Manjarrez presentó la fotoestimulación con ruido optogenético. Esta técnica utiliza luz ruidosa aleatoria para activar neuronas que expresan ChR2. Un nivel óptimo de fotoestimulación con ruido optogenético en el cerebro puede aumentar los potenciales de campo evocados somatosensoriales, la respuesta de frecuencia de disparo de las neuronas piramidales a la estimulación somatosensorial y la amplitud de la corriente de sodio.

Premios

El poderoso impacto de la tecnología optogenética en la investigación cerebral ha sido reconocido con numerosos premios otorgados a figuras clave en este campo.En 2010, Georg Nagel, Peter Hegemann y Ernst Bamberg recibieron el Premio Wiley en Ciencias Biomédicas y también estuvieron entre los galardonados con el Premio Karl Heinz Beckurts en 2010. Ese mismo año, Karl Deisseroth recibió el primer Premio Nakasone de la HFSP por «su trabajo pionero en el desarrollo de métodos optogenéticos para estudiar la función de las redes neuronales subyacentes al comportamiento».En 2012, Bamberg, Deisseroth, Hegemann y Georg Nagel recibieron el Premio Zülch de la Sociedad Max Planck, y Miesenböck recibió el Premio de Salud Baillet Latour por "haber sido pionero en enfoques optogenéticos para manipular la actividad neuronal y controlar el comportamiento animal".En 2013, Georg Nagel y Hegemann estuvieron entre los galardonados con el Premio Louis-Jeantet de Medicina. Ese mismo año, Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck y Georg Nagel recibieron conjuntamente el Premio del Cerebro por «su invención y perfeccionamiento de la optogenética».En 2017, Deisseroth recibió el Premio de Investigación Else Kröner Fresenius por «sus descubrimientos en optogenética y química de tejidos de hidrogel, así como por su investigación sobre la base del circuito neuronal de la depresión».En 2018, la Fundación Inamori otorgó a Deisseroth el Premio Kioto por "liderar la optogenética" y "revolucionar la investigación en neurociencia de sistemas".En 2019, Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck y Georg Nagel recibieron el Premio Rumford de la Academia Estadounidense de las Artes y las Ciencias en reconocimiento a sus extraordinarias contribuciones relacionadas con la invención y el perfeccionamiento de la optogenética.En 2020, Deisseroth recibió el Premio Heineken de Medicina de la Real Academia de las Artes y las Ciencias de los Países Bajos por el desarrollo de la optogenética y la química de tejidos con hidrogel.En 2020, Miesenböck, Hegemann y Georg Nagel recibieron conjuntamente el Premio Shaw en Ciencias de la Vida y Medicina.En 2021, Hegemann, Deisseroth y Dieter Oesterhelt recibieron el Premio Albert Lasker de Investigación Médica Básica.

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