Optimización de la reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una herramienta de biología molecular de uso común para amplificar el ADN, y los biólogos moleculares han desarrollado diversas técnicas para la optimización de la PCR con el fin de mejorar el rendimiento de la PCR y minimizar los fallos.

El método PCR es extremadamente sensible, ya que requiere solo unas pocas moléculas de ADN en una sola reacción para la amplificación en varios órdenes de magnitud. Por lo tanto, se requieren medidas adecuadas para evitar la contaminación con cualquier ADN presente en el entorno del laboratorio (bacterias, virus o fuentes humanas). Debido a que los productos de las amplificaciones PCR anteriores son una fuente común de contaminación, muchos laboratorios de biología molecular han implementado procedimientos que implican dividir el laboratorio en áreas separadas. Un área del laboratorio está dedicada a la preparación y manipulación de reactivos pre-PCR y la configuración de la reacción PCR, y otra área al procesamiento post-PCR, como la electroforesis en gel o la purificación del producto PCR. Para la configuración de las reacciones PCR, muchos procedimientos operativos estándar implican el uso de pipetas con puntas de filtro y el uso de guantes de laboratorio nuevos, y en algunos casos una cabina de flujo laminar con lámpara UV como estación de trabajo (para destruir cualquier formación de neomultímeros extraños). La PCR se evalúa rutinariamente contra una reacción de control negativo que se configura de manera idéntica a la PCR experimental, pero sin ADN molde, y se realiza junto con la PCR experimental.

Las estructuras secundarias en el ADN pueden provocar el plegamiento o anudamiento de la plantilla de ADN o de los cebadores, lo que lleva a una disminución del rendimiento del producto o al fracaso de la reacción. Las horquillas, que consisten en pliegues internos causados por el apareamiento de bases entre nucleótidos en repeticiones invertidas dentro del ADN monocatenario, son estructuras secundarias comunes y pueden provocar el fracaso de las PCR.

Normalmente, el diseño de cebadores que incluye una verificación de posibles estructuras secundarias en los cebadores, o la adición de DMSO o glicerol a la PCR para minimizar las estructuras secundarias en la plantilla de ADN, se utilizan en la optimización de PCR que tienen un historial de fallas debido a sospechas de horquillas de ADN.

La polimerasa Taq carece de una actividad exonucleasa 3' a 5'. Por lo tanto, Taq no tiene actividad de corrección de errores, que consiste en la escisión de cualquier base de nucleótido recién incorporada incorrectamente de la cadena de ADN naciente (es decir, que se extiende) que no coincida con su base opuesta en la cadena de ADN complementaria. La falta de corrección de errores 3' a 5' de la enzima Taq da como resultado una alta tasa de error (mutaciones por nucleótido por ciclo) de aproximadamente 1 en 10.000 bases, lo que afecta la fidelidad de la PCR, especialmente si los errores ocurren al principio de la PCR con bajas cantidades de material de partida, lo que causa la acumulación de una gran proporción de ADN amplificado con secuencia incorrecta en el producto final.

Se han puesto a disposición varias polimerasas de ADN termoestables de "alta fidelidad", que han diseñado una actividad de exonucleasa de 3' a 5', que permiten una amplificación más precisa para su uso en PCR para secuenciación o clonación de productos. Entre los ejemplos de polimerasas con actividad de exonucleasa de 3' a 5' se incluyen: la polimerasa de ADN KOD, una forma recombinante de Thermococcus kodakaraensis KOD1; Vent, que se extrae de Thermococcus litoralis; la polimerasa de ADN Pfu, que se extrae de Pyrococcus furiosus; Pwo, que se extrae de Pyrococcus woesii; la polimerasa Q5, con una amplificación de fidelidad 280 veces mayor en comparación con Taq.

El magnesio es necesario como cofactor para la ADN polimerasa termoestable. La Taq polimerasa es una enzima dependiente del magnesio y determinar la concentración óptima a utilizar es fundamental para el éxito de la reacción de PCR. Algunos de los componentes de la mezcla de reacción, como la concentración de la plantilla, los dNTP y la presencia de agentes quelantes (EDTA) o proteínas, pueden reducir la cantidad de magnesio libre presente, lo que reduce la actividad de la enzima. Los cebadores que se unen a sitios de plantilla incorrectos se estabilizan en presencia de concentraciones excesivas de magnesio, lo que da como resultado una menor especificidad de la reacción. Las concentraciones excesivas de magnesio también estabilizan el ADN bicatenario y evitan la desnaturalización completa del ADN durante la PCR, lo que reduce el rendimiento del producto. La descongelación inadecuada de MgCl2 puede dar como resultado la formación de gradientes de concentración dentro de la solución de cloruro de magnesio suministrada con la ADN polimerasa y también contribuye a que muchos experimentos fallen.

La PCR funciona bien con una plantilla de ADN de hasta dos o tres mil pares de bases de longitud. Sin embargo, por encima de este tamaño, los rendimientos del producto suelen disminuir, ya que al aumentar la longitud, los efectos aleatorios, como la terminación prematura por parte de la polimerasa, comienzan a afectar la eficiencia de la PCR. Es posible amplificar fragmentos más grandes de hasta 50.000 pares de bases con un ciclo de calentamiento más lento y polimerasas especiales. Se trata de polimerasas fusionadas a una proteína de unión al ADN que mejora la procesividad, lo que mejora la adherencia de la polimerasa al ADN.

Otras propiedades valiosas de las polimerasas quiméricas TopoTaq y PfuC2 incluyen una termoestabilidad mejorada, especificidad y resistencia a contaminantes e inhibidores. Fueron diseñadas utilizando los dominios de unión al ADN de hélice-horquilla-hélice (HhH) únicos de la topoisomerasa V de la hipertermófila Methanopyrus kandleri. Las polimerasas quiméricas superan muchas limitaciones de las enzimas nativas y se utilizan en la amplificación por PCR directa a partir de cultivos celulares e incluso muestras de alimentos, evitando así los laboriosos pasos de aislamiento del ADN. Una sólida actividad de desplazamiento de cadena de la polimerasa híbrida TopoTaq ayuda a resolver los problemas de PCR que pueden ser causados por horquillas y dobles hélices cargadas con G. Las hélices con un alto contenido de G-C poseen una temperatura de fusión más alta, lo que a menudo perjudica la PCR, según las condiciones.

La unión no específica de los cebadores se produce con frecuencia y puede deberse a varias razones, como la repetición de secuencias en la plantilla de ADN, la unión no específica entre el cebador y la plantilla, un contenido alto o bajo de G-C en la plantilla o una unión incompleta del cebador, que deja el extremo 5' del cebador sin unir a la plantilla. La unión no específica de los cebadores degenerados también es común. La manipulación de la temperatura de hibridación y la concentración de iones de magnesio se puede utilizar para aumentar la especificidad. Por ejemplo, concentraciones más bajas de magnesio u otros cationes pueden evitar interacciones no específicas de los cebadores, lo que permite una PCR exitosa. Una enzima polimerasa de "inicio en caliente" cuya actividad se bloquea a menos que se caliente a una temperatura alta (p. ej., 90–98˚C) durante el paso de desnaturalización del primer ciclo, se utiliza comúnmente para evitar la ceba no específica durante la preparación de la reacción a temperaturas más bajas. Las PCR de inicio en caliente mediadas químicamente requieren temperaturas más altas y tiempos de incubación más prolongados para la activación de la polimerasa, en comparación con las PCR de inicio en caliente basadas en anticuerpos o aptámeros.

Otros métodos para aumentar la especificidad incluyen la PCR anidada y la PCR Touchdown.

Se pueden realizar simulaciones por computadora de los resultados teóricos de PCR (PCR electrónica) para ayudar en el diseño de cebadores.

La reacción en cadena de la polimerasa Touchdown o reacción en cadena de la polimerasa estilo Touchdown es un método de reacción en cadena de la polimerasa mediante el cual los cebadores evitarán amplificar secuencias no específicas. La temperatura de hibridación durante una reacción en cadena de la polimerasa determina la especificidad de la hibridación del cebador. El punto de fusión del cebador establece el límite superior de la temperatura de hibridación. A temperaturas justo por debajo de este punto, solo se producirá un apareamiento de bases muy específico entre el cebador y la plantilla. A temperaturas más bajas, los cebadores se unen de forma menos específica. La unión no específica de los cebadores oscurece los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa, ya que las secuencias no específicas a las que se hibridan los cebadores en los primeros pasos de la amplificación "inundarán" cualquier secuencia específica debido a la naturaleza exponencial de la amplificación por polimerasa.

Los primeros pasos de un ciclo de reacción en cadena de la polimerasa de touchdown tienen altas temperaturas de hibridación. La temperatura de hibridación se reduce en incrementos para cada conjunto posterior de ciclos (el experimentador elige la cantidad de ciclos individuales y los incrementos de disminución de la temperatura). El cebador se hibridará a la temperatura más alta que sea menos permisiva para la unión no específica que pueda tolerar. Por lo tanto, la primera secuencia amplificada es la que se encuentra entre las regiones de mayor especificidad del cebador; es más probable que esta sea la secuencia de interés. Estos fragmentos se amplificarán aún más durante las rondas posteriores a temperaturas más bajas y superarán a las secuencias no específicas a las que los cebadores pueden unirse a esas temperaturas más bajas. Si el cebador inicialmente (durante las fases de temperatura más alta) se une a la secuencia de interés, se pueden realizar rondas posteriores de reacción en cadena de la polimerasa sobre el producto para amplificar aún más esos fragmentos.

La hibridación del extremo 3' de un cebador con él mismo o con el segundo cebador puede provocar la extensión del cebador, lo que da lugar a la formación de los denominados dímeros de cebadores, visibles como bandas de bajo peso molecular en los geles de PCR. La formación de dímeros de cebadores a menudo compite con la formación del fragmento de ADN de interés y se puede evitar utilizando cebadores que están diseñados de manera que carezcan de complementariedad (especialmente en los extremos 3') con él mismo o con el otro cebador utilizado en la reacción. Si el diseño del cebador está limitado por otros factores y si se producen dímeros de cebadores, los métodos para limitar su formación pueden incluir la optimización de la concentración de MgCl2 o el aumento de la temperatura de hibridación en la PCR.

Los desoxinucleótidos (dNTP) pueden unirse a los iones Mg2+ y, por lo tanto, afectar la concentración de iones magnesio libres en la reacción. Además, cantidades excesivas de dNTP pueden aumentar la tasa de error de la ADN polimerasa e incluso inhibir la reacción. Un desequilibrio en la proporción de los cuatro dNTP puede provocar una incorporación incorrecta a la cadena de ADN recién formada y contribuir a una disminución de la fidelidad de la ADN polimerasa.