Nucleósido-difosfato quinasa

Nucleósido-difosfato quinasas (NDPK, también NDP quinasa, (poli)nucleótido quinasas y nucleósido difosfoquinasas) son enzimas que catalizan el intercambio de fosfato terminal entre diferentes nucleósidos difosfatos (NDP) y trifosfatos (NTP) de forma reversible para producir nucleótidos trifosfatos. Muchos NDP sirven como aceptores, mientras que NTP son donantes de grupo fosfato. La reacción general mediante el mecanismo de ping-pong es la siguiente: XDP + YTP ←→ XTP + YDP (X e Y representan cada uno una base nitrogenada diferente). Las actividades de NDPK mantienen un equilibrio entre las concentraciones de diferentes nucleósidos trifosfato, como, por ejemplo, cuando el trifosfato de guanosina (GTP) producido en el ciclo del ácido cítrico (Krebs) se convierte en trifosfato de adenosina (ATP). Otras actividades incluyen la proliferación, diferenciación y desarrollo celular, transducción de señales, receptor acoplado a proteína G, endocitosis y expresión génica.

Estructura

Las NDPK son proteínas homohexaméricas formadas por monómeros de aproximadamente 152 aminoácidos de longitud con un peso teórico de 17,17 KDa. El complejo se encuentra en las mitocondrias y en el citoplasma soluble de las células.

Función

Las NDPK se encuentran en todas las células, no muestran mucha especificidad hacia los tipos de bases de nucleósidos y son capaces de aceptar nucleótidos y desoxirribonucleótidos como sustratos o donantes. Por tanto, NDPK es la fuente de precursores de ARN y ADN, excepto ATP. NDPK utiliza una cinética enzimática específica para la reacción de múltiples sustratos, es decir, el mecanismo de ping-pong. Un mecanismo de ping-pong integra la fosforilación de un residuo de histidina mediante la transferencia del grupo fosfato terminal (γ-fosfato) del ATP al NDP β-fosfato para producir un NTP, y el NDPK cataliza dichas reacciones reversibles. NTP fosforila una histidina, que a su vez fosforila NDP. Las NDPK participan en la síntesis de nucleósidos trifosfato (NTP), como el trifosfato de guanosina (GTP), el trifosfato de citidina (CTP), el trifosfato de uridina (UTP) y el trifosfato de timidina (TTP).

Detrás de esta reacción aparentemente simple hay un mecanismo de varios pasos. Los pasos clave de la transfosforilación son los siguientes:

• NDPK se une a un NTP1
• Un grupo fosforil de NTP1 es transferido a Su sitio activo de NDPK
• Se forma Phosphoenzyme Intermedio
• El NDP1 se libera inicialmente de NDPK con el nuevo NDP2
• Phosphoryl group is transferred from NDPK-His to NDP2 or dNDP2, creating a bound NTP2
• NDPK libera el nuevo NTP2

Cada paso es parte de un proceso reversible, de modo que el equilibrio de varios pasos tiene la siguiente forma.

NDPK + NTP ↔ NDPK~NTP ↔ NDPK-P~NDP ↔ NDPK-P + NDP

Las funciones del NDPK en estos NTP difieren; en general, las quinasas aportan NTP para la síntesis de ácidos nucleicos. CTP se proporciona para la síntesis de lípidos, UTP para la síntesis de polisacáridos, mientras que GTP se utiliza para el alargamiento de proteínas y la transducción de señales. Durante la transducción de señales mediada por AMPc, NDPK es responsable de fosforilar el GDP liberado de las proteínas G activadas por la unión al receptor; Una vez que el ATP dona un grupo fosfato mediante la actividad de NDPK, el GTP se une consecutivamente. El aumento de la actividad de NDPK asociada a la membrana produce la síntesis de AMPc. NDPK controla los canales de K+, las proteínas G, la secreción celular, la producción de energía celular y la síntesis de UTP.

Reglamento

Inhibición por AMPK

NDPK normalmente consume ATP, el nucleótido celular más abundante, y almacena los nucleótidos. Sin embargo, el consumo de ATP influiría definitivamente en el equilibrio energético celular, lo que provoca la regulación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK). AMPK actúa como sensor de energía y regula las vías de ATP activando o no las vías generadoras. Debido a tal actividad, la AMPK podría inhibir directamente la NDPK mediante la fosforilación. Para ser más específicos, NDPK apoya la producción de nucleótidos en estados celulares de alta energía y bajo estrés. Sin embargo, esto sólo puede suceder cuando la AMPK está inactivada porque los estados celulares de ATP de bajo estrés desencadenan la activación de la AMPK, lo que eventualmente disminuye la actividad de la NDPK al fosforilar los residuos de serina.

Sistemas procarióticos

En la mayoría de los procariotas, la enzima NDPK es tetramérica. Se ha informado en varios patógenos. La función de NDPK se ha estudiado en Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Microccocus luteus y Myxococcus xanthus. El NDPK procariótico forma un homotetrámero funcional. La actividad de nucleósido difosfato quinasa implica la transferencia del γ-fosfato del nucleósido trifosfato (NTP) al nucleósido difosfato (NDP), donde N1 y N2 pueden ser ribo o desoxirribonucleósidos. Esto se hace mediante un intermediario fosfohistidina de alta energía. Además de participar en la síntesis de nucleótidos de pirimidina, la NDPK procariótica también participa en varios ciclos metabólicos. También se ha descubierto que NDPK actúa como una proteína histidina quinasa, lo que implica una fosforilación reversible de histidina como una señal reguladora bien conocida. Sin embargo, en la mayoría de los procariotas, los niveles de expresión de NDPK están implicados en el crecimiento, desarrollo y diferenciación celular del organismo, especialmente de las bacterias.

(p)metabolismo ppGpp

En el ciclo de biosíntesis de (p)ppGpp, NDPK desempeña un papel importante. Cuando hay ausencia de un ARNt cargado en el sitio A de un ribosoma, el ribosoma se detendrá y desencadenará la síntesis de la molécula de pentafosfato de guanosina ((p)ppGpp). La biosíntesis de (p)ppGpp es parte de la vía del metabolismo de las purinas y coordina una serie de actividades celulares en respuesta a la abundancia nutricional. La síntesis de (p)ppGpp se desencadena por la falta de carbono, o la falta de carbono en el entorno de la célula, y hace que se active la proteína SpoT. SpoT funciona junto con NDPK y ambos sirven como enzimas esenciales en el ciclo de biosíntesis de (p)ppGpp. NDPK sintetiza la formación de GDP a partir de GTP mediante desfosforilación.

Función del gen Nm23

Si bien actualmente se desconoce el mecanismo biomolecular por el cual funciona el gen Nm23 en las células, como en la mayoría de los procariotas, los niveles de expresión de la nucleósido difosfato quinasa (NDPK) determinan el crecimiento y la diferenciación celular. Normalmente, el gen Nm23 (NME) participa en la supresión de metástasis en humanos. En los procariotas, el gen Nm23 participa en el desarrollo y la diferenciación celular normal. Se han encontrado homólogos altamente conservados del gen Nm23 en procariotas, más concretamente en Myxococcus xanthus, una bacteria gramnegativa del suelo. Homólogos de Nm23 en M. xanthus han sido cerrados y caracterizados como una nucleósido difosfato quinasa (gen ndk) y parece ser esencial para M. xanto crecimiento. Durante M. xanthus, también se ha demostrado que la actividad de la nucleósido difosfato quinasa disminuye drásticamente.

Sistemas eucariotas

Hay al menos cuatro isoformas enzimáticamente activas de NDPK en humanos: NDPK-A, NDPK-B, NDPK-C y NDPK-D. Las cuatro isoformas tienen estructuras muy similares y pueden combinarse de cualquier forma para convertirse en hexámeros NDPK funcionales. Se sugiere que NDPK participe en la señalización transmembrana en células eucariotas.

En humanos

En los sistemas eucarióticos, la función del NDK es sintetizar nucleósidos trifosfato distintos del ATP. El ATP gamma fosfato se transfiere al NDP beta fosfato mediante un mecanismo de ping-pong, utilizando un intermediario de sitio activo fosforilado, y se sintetizan productos como el UTP. NDK posee nucleósido-difosfato quinasa, proteína quinasa específica de serina/treonina, pirofosfato quinasa de geranilo y farnesilo, histidina proteína quinasa y quinasa 3'-5' actividades exonucleasas. Sus procesos están involucrados con la proliferación, diferenciación y desarrollo celular, y la expresión genética en células humanas. También es parte del proceso de desarrollo neuronal, que incluye patrones neuronales y determinación del destino celular. Además, NDPK participa en los procesos de transducción de señales y en la endocitosis del receptor acoplado a proteína G, ya que transfiere un grupo fosfato a las subunidades G β y convierte el GDP en GTP. Este aumento en la concentración de GTP cerca de las subunidades α de la proteína G provoca la activación de las subunidades α de la proteína G para la señalización de la proteína G. Además de la señalización, la NDPK participa en el control de los canales de K+, la secreción celular y la producción de energía celular.

En plantas

Las reacciones bioquímicas catalizadas por la NDP quinasa en plantas son análogas a las actividades descritas en humanos, ya que la actividad de autofosforilación tiene lugar a partir de ATP y GTP. Además de esto, las plantas tienen cuatro tipos de isoformas de NDPK. La NDPK citosólica tipo I participa en el metabolismo, el crecimiento y las respuestas al estrés de las plantas. El NDPK tipo II se concentra en el cloroplasto y se cree que participa en el proceso de fotosíntesis y en el manejo del estrés oxidativo, pero aún no se conoce con claridad su función. La NDPK tipo III se dirige tanto a las mitocondrias como al cloroplasto y participa principalmente en el metabolismo energético. La localización y función exacta del NDPK tipo IV aún no se conocen bien y necesitan más investigaciones. Además, la NDPK está asociada con la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos mediada por H₂O₂ en las plantas.

Enfermedades relacionadas con NDPK

Diez genes parálogos codifican las proteínas NDPK, que se separan en dos grupos. El primer grupo codifica proteínas con funciones NDPK. Los genes del otro grupo codifican otras proteínas que muestran actividades NDPK bajas o nulas. En el primer grupo, uno de los genes denominado NM23 fue identificado como la primera proteína supresora de metástasis y su gen Nm23 estaba menos activado en las células metastásicas. En un experimento diferente, se cultivó Nm23 humano con células cancerosas y mostró inhibición de la metástasis. El nivel de proteína NM23 fue inversamente proporcional al potencial metastásico de los tumores sólidos humanos. Sin embargo, otros tipos de tumores, como el cáncer de ovario, el neuroblastoma y las neoplasias malignas hematológicas, mostraron niveles de NM23 regulados positivamente en muestras de pacientes. Por tanto, comprender las bases biológicas de la familia de genes Nm23 es necesario para tener un conocimiento firme de sus diversos resultados.

Enfermedad cardiovascular

Nme2, uno de los genes NDPK, se ha asociado con funciones cardiovasculares. Se sabe que el gen Nme2 forma un complejo con la subunidad beta de la proteína G heterotrimétrica en las células del corazón y regula la contractilidad del corazón. Hay dos funciones de Nme2 que permiten dicha regulación; una es la actividad de la histidina quinasa, que es la fosforilación de los canales para regular lo que pasa y la otra es una función de andamiaje de la formación de caveolas. El agotamiento de la interacción Nme2/caveolina mostró una disminución de la tasa de contractilidad cardíaca. Además, más estudios con pez cebra revelaron que el agotamiento de NDPK tiene un efecto perjudicial sobre el funcionamiento del corazón.

Nme1 y Nme2 como supresora de metástasis

Hubo mucho debate sobre si el gen NM23 es responsable de suprimir o activar la metástasis. Los dos lados contradictorios sobre este tema permanecieron ambiguos e indefinidos a lo largo de los estudios del NDPK. Sin embargo, experimentos recientes comenzaron a mostrar evidencia de que NM23 es un supresor de metástasis. Nme2 se marcó como un gen antimetástasis, utilizando tecnología de chip de tejido e inmunohistoquímica. Cuando los productos del gen Nme2 se produjeron en exceso en las células de cáncer gástrico, hubo una disminución en la proliferación, migración e invasión de dichas células cancerosas. Los cultivos celulares revelaron que Nme2 afecta las células de cáncer gástrico, pero aún queda la pregunta sobre qué regula las actividades de Nme2 entre los distintos tipos de cáncer. Nme1 se encontró en gran número en sublíneas poco metastásicas de células de melanoma. Además, la transfección de Nme1 en una línea de melanoma altamente metastásica redujo significativamente la metástasis. Esta teoría también se ha probado con ratones; los ratones con deficiencia de Nme1 formaron mayores metástasis pulmonares que los ratones de tipo salvaje, lo que demuestra que este gen tiene actividad supresora. La invasión del cáncer se produce debido a cambios en la adhesión celular y es causada por cambios en la expresión genética en la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT). Sorprendentemente, hay muchas moléculas de adhesión, factores de motilidad, vías de señalización, eventos proteolíticos, características de EMT y otros programas transcripcionales que se han relacionado con las proteínas Nme1. Estas proteínas interrumpen la metástasis uniéndose a proteínas promotoras de metástasis. Las proteínas Nme1 se unen a proteínas virales, oncogenes y otros factores promotores de metástasis. La unión puede ser indirecta mediante el uso del complejo de señalización.