Nocaut de gen

La inactivación de genes (también conocida como eliminación o inactivación de genes) es una técnica de ingeniería genética ampliamente utilizada que implica la eliminación o inactivación selectiva de un gen específico dentro del genoma de un organismo. Esto se puede hacer a través de una variedad de métodos, incluida la recombinación homóloga, CRISPR-Cas9 y TALEN.

Una de las principales ventajas de la desactivación de genes es que permite a los investigadores estudiar la función de un gen específico in vivo y comprender el papel del gen en el desarrollo y la fisiología normales, así como en la patología de las enfermedades. Al estudiar el fenotipo del organismo con el gen desactivado, los investigadores pueden obtener información sobre los procesos biológicos en los que está involucrado el gen.

Hay dos tipos principales de knockouts de genes: completos y condicionales. Una desactivación completa del gen inactiva permanentemente el gen, mientras que una desactivación condicional del gen permite que el gen se apague y se encienda en momentos específicos o en tejidos específicos. Los knockouts condicionales son especialmente útiles para estudiar los procesos de desarrollo y comprender el papel de un gen en tipos de células o tejidos específicos.

La eliminación de genes se ha utilizado ampliamente en muchos organismos diferentes, incluidas bacterias, levaduras, moscas de la fruta, peces cebra y ratones. En ratones, las inactivaciones de genes se usan comúnmente para estudiar la función de genes específicos en el desarrollo, la fisiología y la investigación del cáncer.

El uso de inactivaciones genéticas en modelos de ratón ha sido particularmente valioso en el estudio de enfermedades humanas. Por ejemplo, la inactivación de genes en ratones se ha utilizado para estudiar el papel de genes específicos en el cáncer, los trastornos neurológicos, los trastornos inmunitarios y los trastornos metabólicos.

Sin embargo, las eliminaciones genéticas también tienen algunas limitaciones. Por ejemplo, la pérdida de un solo gen puede no imitar por completo los efectos de un trastorno genético, y los knockouts pueden tener efectos no deseados en otros genes o vías. Además, la desactivación de genes no siempre es un buen modelo para la enfermedad humana, ya que el genoma del ratón no es idéntico al genoma humano y la fisiología del ratón es diferente de la psiquiatría humana.

La técnica de KO es esencialmente lo opuesto a un gen knock-in. La eliminación simultánea de dos genes en un organismo se conoce como doble eliminación (DKO). De manera similar, los términos triple nocaut (TKO) y cuádruple nocaut (QKO) se utilizan para describir tres o cuatro noqueados. genes, respectivamente. Sin embargo, es necesario distinguir entre KO heterocigotos y homocigotos. En el primero, solo se elimina una de las dos copias del gen (alelos), en el último, ambos se eliminan.

Métodos

Los nocauts se logran a través de una variedad de técnicas. Originalmente, se identificaron mutaciones naturales y luego se tuvo que establecer la pérdida o inactivación de genes mediante secuenciación de ADN u otros métodos.

Un ratón de laboratorio en el que un gen que afecta el crecimiento del cabello ha sido eliminado (izquierda), se muestra junto a un ratón de laboratorio normal.

Gen knockout por mutación

La desactivación de genes por mutación se lleva a cabo comúnmente en bacterias. Un ejemplo temprano del uso de esta técnica en Escherichia coli fue publicado en 1989 por Hamilton, et al. En este experimento, se utilizaron dos recombinaciones secuenciales para eliminar el gen. Este trabajo estableció la viabilidad de eliminar o reemplazar un gen funcional en bacterias. Desde entonces, ese método se ha desarrollado para otros organismos, particularmente animales de investigación, como ratones. Los ratones knockout se usan comúnmente para estudiar genes con equivalentes humanos que pueden tener importancia para la enfermedad. Un ejemplo reciente de un estudio con ratones knockout es una investigación de las funciones de las proteínas Xirp en el síndrome de muerte nocturna súbita e inexplicable (SUNDS) y el síndrome de Brugada en la población china Han realizada por Cheng, et al.

Silenciamiento de genes

Para las investigaciones de desactivación de genes, la interferencia de ARN (RNAi), un método más reciente, también conocido como silenciamiento de genes, ha ganado popularidad. En el ARN de interferencia (ARNi), el ARN mensajero de un gen en particular se inactiva utilizando ARN de interferencia pequeño (ARNsi) o ARN de horquilla corta (ARNsh). Esto detiene efectivamente la expresión del gen. Los oncogenes como Bcl-2 y p53, así como los genes relacionados con enfermedades neurológicas, trastornos genéticos e infecciones virales, han sido objeto de silenciamiento génico utilizando ARN de interferencia (ARNi).

Recombinación homóloga

La recombinación homóloga es el intercambio de genes entre dos hebras de ADN que incluyen extensas regiones de secuencias de bases que son idénticas entre sí. En especies eucariotas, bacterias y algunos virus, la recombinación homóloga ocurre espontáneamente y es una herramienta útil en la ingeniería genética. La recombinación homóloga, que tiene lugar durante la meiosis en eucariotas, es esencial para la reparación de roturas de ADN de doble cadena y promueve la variación genética al permitir el movimiento de información genética durante el cruce cromosómico. La recombinación homóloga, un mecanismo clave de reparación del ADN en las bacterias, permite la inserción de material genético adquirido a través de la transferencia horizontal de genes y la transformación en ADN. La recombinación homóloga en virus influye en el curso de la evolución viral. La recombinación homóloga, un tipo de gen dirigido utilizado en la ingeniería genética, implica la introducción de una mutación modificada en un gen en particular para aprender más sobre la función de ese gen. Este método consiste en insertar ADN extraño en una célula que tiene una secuencia similar al gen objetivo mientras está flanqueada por secuencias que son las mismas aguas arriba y aguas abajo del gen objetivo. El ADN del gen objetivo se sustituye con la secuencia de ADN extraño durante la replicación cuando la célula detecta las regiones flanqueantes similares como homólogos. El gen objetivo está "noqueado" por el intercambio. Mediante el uso de esta técnica para apuntar a alelos particulares en células madre embrionarias en ratones, es posible crear ratones knockout. Con la ayuda de la selección de genes, se han desactivado numerosos genes de ratón, lo que ha llevado a la creación de cientos de modelos distintos de ratón de diversas enfermedades humanas, como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y trastornos neurológicos. Mario Capecchi, Sir Martin J. Evans y Oliver Smithies realizaron una investigación pionera sobre la recombinación homóloga en células madre de ratón y compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007 por sus hallazgos.

Tradicionalmente, la recombinación homóloga era el método principal para provocar la inactivación de un gen. Este método implica crear una construcción de ADN que contenga la mutación deseada. Para fines de desactivación, esto típicamente implica un marcador de resistencia a fármacos en lugar del gen de desactivación deseado. La construcción también contendrá un mínimo de 2 kb de homología con la secuencia diana. La construcción se puede administrar a las células madre mediante microinyección o electroporación. Luego, este método se basa en los propios mecanismos de reparación de la célula para recombinar la construcción de ADN en el ADN existente. Esto da como resultado que la secuencia del gen se altere y, en la mayoría de los casos, el gen se traducirá en una proteína no funcional, si es que se traduce. Sin embargo, este es un proceso ineficiente, ya que la recombinación homóloga representa solo de 10⁻² a 10^-3 de integraciones de ADN. A menudo, el marcador de selección de fármacos en la construcción se usa para seleccionar células en las que se ha producido el evento de recombinación.

Physcomitrella de tipo salvaje y musgos de knockout: Desviando fenotipos inducidos en transformadores de biblioteca de disrupción genética. Las plantas de tipo silvestre y transformadas de Physcomitrella fueron cultivadas en medio Knop mínimo para inducir la diferenciación y el desarrollo de los jugadores. Para cada planta, se muestra una visión general (filera superior; barra de escala corresponde a 1 mm) y un cierre (filera inferior; barra de escala igual a 0,5 mm). A: Planta de musgo de tipo salvaje Haploid completamente cubierta con fogones frondosos y el cierre de hoja de tipo salvaje. Diferentes mutantes.

Estas células madre que ahora carecen del gen podrían usarse in vivo, por ejemplo en ratones, insertándolas en embriones tempranos. Si el ratón quimérico resultante contenía el cambio genético en su línea germinal, esto podría transmitirse a la descendencia.

En los organismos diploides, que contienen dos alelos para la mayoría de los genes y también pueden contener varios genes relacionados que colaboran en la misma función, se realizan rondas adicionales de transformación y selección hasta que se elimine cada gen objetivo. Puede ser necesaria la cría selectiva para producir animales knockout homocigóticos.

Nucleasas específicas del sitio

Fig 1. mutación de fragmentos resultante de una sola eliminación de pares base, causando secuencia de aminoácidos alterados y codón de parada prematura.

Actualmente hay tres métodos en uso que implican apuntar con precisión a una secuencia de ADN para introducir una ruptura de doble cadena. Una vez que esto ocurre, los mecanismos de reparación de la célula intentarán reparar esta rotura de doble cadena, a menudo a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), que consiste en ligar directamente los dos extremos cortados. Esto se puede hacer de manera imperfecta, por lo que a veces provoca inserciones o eliminaciones de pares de bases, lo que provoca mutaciones de cambio de marco. Estas mutaciones pueden hacer que el gen en el que ocurren no sea funcional, creando así una desactivación de ese gen. Este proceso es más eficiente que la recombinación homóloga y, por lo tanto, se puede usar más fácilmente para crear knockouts bialélicos.

Dedos de zinc

Las nucleasas con dedos de zinc consisten en dominios de unión al ADN que pueden dirigirse con precisión a una secuencia de ADN. Cada dedo de zinc puede reconocer codones de una secuencia de ADN deseada y, por lo tanto, puede ensamblarse modularmente para unirse a una secuencia particular. Estos dominios de unión se acoplan con una endonucleasa de restricción que puede provocar una rotura de doble cadena (DSB) en el ADN. Los procesos de reparación pueden introducir mutaciones que destruyen la funcionalidad del gen.

TALENTOS

Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) también contienen un dominio de unión al ADN y una nucleasa que puede escindir el ADN. La región de unión al ADN consta de repeticiones de aminoácidos, cada una de las cuales reconoce un solo par de bases de la secuencia de ADN objetivo deseada. Si esta escisión se dirige a una región codificante de un gen, y la reparación mediada por NHEJ introduce inserciones y deleciones, a menudo se produce una mutación de cambio de marco, lo que interrumpe la función del gen.

CRISPR/Cas9

CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas) es una técnica de ingeniería genética que permite la edición precisa del genoma. Una aplicación de CRISPR es la desactivación de genes, que consiste en desactivar o "desactivar" un gen específico en un organismo.

El proceso de desactivación de genes con CRISPR implica tres pasos principales: diseñar un ARN guía (ARNg) que se dirija a una ubicación específica en el genoma, entregar el ARNg y una enzima Cas9 (que actúa como una tijera molecular) al célula objetivo, y luego permitir que la célula repare el corte en el ADN. Cuando la célula repara el corte, puede volver a unir los extremos cortados, lo que da como resultado un gen no funcional, o introducir una mutación que interrumpe la función del gen.

Esta técnica se puede utilizar en una variedad de organismos, incluidas bacterias, levaduras, plantas y animales, y permite a los científicos estudiar la función de genes específicos al observar los efectos de su ausencia. La desactivación de genes basada en CRISPR es una poderosa herramienta para comprender la base genética de la enfermedad y para desarrollar nuevas terapias.

Es importante tener en cuenta que la desactivación de genes basada en CRISPR, como cualquier técnica de ingeniería genética, tiene el potencial de producir efectos no deseados o dañinos en el organismo, por lo que debe usarse con precaución. El Cas9 acoplado provocará una ruptura de doble cadena en el ADN. Siguiendo el mismo principio que los dedos de zinc y los TALEN, los intentos de reparar estas roturas de doble cadena a menudo dan como resultado mutaciones de cambio de marco que dan como resultado un gen no funcional.

Tocando

La activación de genes es similar a la eliminación de genes, pero reemplaza un gen por otro en lugar de eliminarlo.

Tipos

Nocauts condicionales

Una desactivación condicional de genes permite la eliminación de genes en un tejido de una manera específica del tejido. Esto es necesario en lugar de la desactivación de un gen si la mutación nula conduciría a la muerte embrionaria, o si un tejido o tipo de célula específico es de interés específico. Esto se hace introduciendo secuencias cortas llamadas sitios loxP alrededor del gen. Estas secuencias se introducirán en la línea germinal a través del mismo mecanismo que un golpe de gracia. Esta línea germinal puede luego cruzarse con otra línea germinal que contenga Cre-recombinasa, que es una enzima viral que puede reconocer estas secuencias, las recombina y elimina el gen flanqueado por estos sitios.

Los genes que no están involucrados en el desarrollo temprano se han estudiado de manera efectiva mediante enfoques de inactivación que utilizan la eliminación de genes. Sin embargo, normalmente no es posible eliminar los genes que están activos durante el desarrollo temprano sin que el organismo sufra un desenlace fatal. Un método en torno a esto es el golpe de gracia condicional. Utilizando una recombinasa específica del sitio llamada Cre, la técnica de desactivación condicional original recombinó secuencias diana cortas conocidas como LoxP. Desde entonces, se han creado y empleado otras recombinasas en experimentos de desactivación condicional.

Usar

Un ratón (izquierda) que es un modelo de obesidad, en comparación con un ratón normal.

Los knockouts se utilizan principalmente para comprender la función de un gen específico o una región de ADN mediante la comparación del organismo knockout con un tipo salvaje con antecedentes genéticos similares.

Los organismos knockout también se utilizan como herramientas de detección en el desarrollo de fármacos, para detectar procesos biológicos específicos o deficiencias mediante el uso de un knockout específico, o para comprender el mecanismo de acción de un fármaco mediante el uso de una biblioteca de organismos knockout que abarca todo el genoma, como en Saccharomyces cerevisiae.