Nitrógeno asimilable de levadura

El nitrógeno asimilable de levadura o YAN es la combinación de amino nitrógeno libre (FAN), amoníaco (NH ₃) y amonio (NH ₄) que está disponible para una levadura, por ejemplo, la levadura de vino Saccharomyces cerevisiae, para usar durante la fermentación. Fuera de los azúcares fermentables glucosa y fructosa, el nitrógeno es el nutriente más importante que se necesita para llevar a cabo una fermentación exitosa que no finalice antes del punto deseado de secado o vea el desarrollo de malos olores y fallas relacionadas con el vino. En este sentido, los enólogos suelen complementar los recursos YAN disponibles con aditivos nitrogenados como el fosfato diamónico (DAP).

Sin embargo, la adición de cantidades excesivas de nitrógeno también puede crear un peligro, ya que otros organismos, además de la levadura de vino beneficiosa, pueden utilizar los nutrientes. Estos incluyen organismos de deterioro como Brettanomyces, Acetobacter y bacterias del ácido láctico de Lactobacillus y Pediococcus.géneros Esta es la razón por la que muchas bodegas medirán el YAN después de la cosecha y el triturado utilizando uno de los varios métodos disponibles en la actualidad, incluido el ensayo de nitrógeno por o-ftaldialdehído (NOPA), que requiere el uso de un espectrómetro o el método de titulación de formol. Conocer el YAN en el mosto permite a los enólogos calcular la cantidad correcta de aditivo necesaria para pasar por la fermentación, dejando solo un "desierto de nutrientes" para cualquier organismo de deterioro que venga después.

La cantidad de YAN que los enólogos verán en sus mostos de uva depende de una serie de componentes que incluyen la variedad de uva, el portainjerto, los suelos de los viñedos y las prácticas vitivinícolas (como el uso de fertilizantes y el manejo del dosel), así como las condiciones climáticas de cosechas particulares.

Componentes

YAN es una medida de las fuentes de nitrógeno primarias orgánicas (aminoácidos libres) e inorgánicas (amoníaco y amonio) que pueden ser asimiladas por S. cerevisiae. Hay varios compuestos nitrogenados que se encuentran en el mosto y el vino, incluidos péptidos, proteínas más grandes, amidas, aminas biogénicas, piridinas, purinas y ácidos nucleicos, pero estos no pueden ser utilizados directamente por la levadura para su metabolismo. En conjunto, el contenido total de nitrógeno del mosto de uva puede oscilar entre 60 y 2400 mg de nitrógeno por litro, sin embargo, no todo este nitrógeno será asimilable. La falta de enzimas proteasas, que descomponen los péptidos más grandes en componentes más pequeños, que pueden funcionar fuera de la célula, limita el tamaño de las moléculas que la levadura puede utilizar como fuente de nitrógeno.

La cantidad de YAN que los enólogos verán en sus mostos de uva depende de una serie de componentes que incluyen la variedad de uva, el portainjerto, los suelos de los viñedos y las prácticas vitivinícolas (como el uso de fertilizantes y el manejo del dosel), así como las condiciones climáticas de cosechas particulares. Las infecciones por moho, como Botrytis cinerea (conocida como podredumbre noble cuando se desea) pueden reducir el contenido de aminoácidos del mosto de uva hasta en un 61%. Algunas regiones se destacan por tener un YAN bajo, como el estado de Washington, que durante una cosecha típica tendrá el 90 % del mosto probado por debajo de 400 mg N/L y casi una cuarta parte por debajo de 150 mg N/L.

En el viñedo, el nitrógeno es absorbido por la vid en forma de nitrato (NO ₃), amonio o urea que se reduce a amoníaco. A través de reacciones adicionales, el nitrógeno se incorpora a la glutamina y al glutamato y finalmente se utiliza en la síntesis de otros aminoácidos y compuestos nitrogenados. Después de la cosecha, la mayoría (alrededor del 80%) de los compuestos nitrogenados disponibles que se encuentran en las uvas se concentran en las pieles y las semillas. Estos compuestos se liberan en el mosto durante el proceso de estrujado y durante la maceración/contacto con los hollejos. Incluso después de prensar, hasta el 80% del contenido inicial de nitrógeno dentro de cada baya de uva quedará en el orujo.

Aminoácidos

De los aminoácidos libres de nitrógeno (FAN) que componen YAN, los aminoácidos arginina, prolina y glutamina son los más abundantes, seguidos de alanina, treonina, serina y ácido aspártico en concentraciones mucho más pequeñas, aunque se pueden encontrar trazas de la mayoría de los aminoácidos conocidos. en mosto de uva. La prolina suele ser la más concentrada y puede representar hasta el 30% de la cantidad total de aminoácidos. La cantidad exacta de FAN variará y puede oscilar entre 22 y 1242 mg de nitrógeno/litro de YAN derivado de aminoácidos libres.

Mientras que la arginina, la glutamina y otros aminoácidos se consumen rápidamente, a menudo muy temprano en la fermentación, la levadura no consume prolina en absoluto durante las condiciones anaeróbicas normales de las fermentaciones. Esto se debe a que una de las enzimas requeridas para su uso es una oxidasa (que requiere oxígeno molecular) y la otra es reprimida por la presencia de amonio (otra fuente de nitrógeno asimilable que necesita la levadura) en el mosto. Sin embargo, los cultivos iniciadores bien aireados que contienen mosto al que no se le ha agregado fosfato diamónico generalmente verán alguna utilización de prolina antes de que se activen las condiciones anaeróbicas de la fermentación. Cuando los enólogos miden FAN, deben saber si su ensayo está incluyendo prolina ya que esto hará que su medición de YAN sea más alta. Chardonnay y Cabernet Sauvignon son dosVariedades de Vitis vinifera que se sabe que tienen niveles muy altos de prolina, mientras que Riesling y Sauvignon blanc suelen tener niveles muy bajos.

La levadura transporta aminoácidos y péptidos pequeños (menos de 5 residuos de aminoácidos) a la célula a través de un proceso de transporte activo que utiliza proteínas de membrana especializadas y la diferencia en el gradiente de pH de la solución de vino ácido (pH entre 3 y 4) y el cercano pH neutro del citoplasma dentro de las células de levadura. Las proteínas simportadoras de protones en la membrana toman el aminoácido junto con un ion de hidrógeno que luego es expulsado por la célula a través de una bomba de iones de hidrógeno. Este es un proceso dependiente de la energía que se vuelve más desfavorable desde el punto de vista energético para la célula de levadura a medida que avanza la fermentación y aumentan los niveles de etanol, creando una "fuga pasiva" del exceso de iones de hidrógeno en la célula. La célula' Las bombas de iones de hidrógeno tienen que trabajar aún más para mantener su pH interno, por lo que envía una señal a las proteínas simportadoras para que dejen de traer otros iones. Esta es una de las razones por las que las adiciones de nitrógeno de fermentación tardía tienen poca o ninguna eficacia ya que los mecanismos de transporte del nitrógeno a la célula se cierran.

Compuestos de amoníaco

A lo largo de la fermentación, el amonio es la principal forma de nitrógeno asimilable disponible para la levadura. Sin embargo, al triturar el jugo puede contener de 0 a 150 mg/L de sales de amonio, dependiendo de la cantidad de nitrógeno que recibió la vid en el viñedo.

En la célula, el amoníaco inorgánico y los iones de amonio se "fijan" a través de una serie de reacciones químicas que finalmente producen el glutamato como fuente de nitrógeno orgánico. El ion de amonio también sirve como regulador alostérico para una de las enzimas utilizadas en la glucólisis y también puede tener un efecto sobre cómo la célula de levadura transporta la glucosa y la fructosa al interior de la célula. Se ha demostrado que las proteínas utilizadas en el principal sistema de transporte de glucosa tienen una vida media de 12 horas. En los estudios que sometieron a las células de levadura a "falta de amoníaco", todo el sistema se apagó después de 50 horas, lo que brinda una fuerte evidencia de que la falta de amoníaco/amonio puede crear un mayor riesgo de tener una fermentación estancada.

El glutatión (GSH: L-gamma-glutamil-L-cisteinilglicina) está presente en altas concentraciones de hasta 10 mM en células de levadura. Asume un papel fundamental en respuesta a la falta de azufre y nitrógeno.

El amoníaco no es utilizado por bacterias como Acetobacter y las bacterias del ácido láctico utilizadas en la fermentación maloláctica.

Importancia en la elaboración del vino.

El nitrógeno asimilable es un nutriente esencial que necesita la levadura del vino para completar completamente la fermentación con una cantidad mínima de subproductos indeseables (como compuestos como el sulfuro de hidrógeno que pueden crear malos olores) creados. En el transcurso de una fermentación, la levadura puede usar hasta 1000 mg/L de aminoácidos, aunque a menudo mucho menos de la cantidad necesaria. La levadura puede almacenar aminoácidos en vacuolas intracelulares y luego usarlos directamente, incorporándolos a proteínas, o descomponerlos y usar sus componentes de carbono y nitrógeno por separado.

En ausencia de nitrógeno, la levadura comenzará a apagarse y morir. Algunas cepas comenzarán a descomponer los aminoácidos que contienen azufre, como la cisteína y la metionina, liberando un átomo de azufre que puede combinarse con hidrógeno para producir sulfuro de hidrógeno (H₂S) que pueden impartir olores de huevo podrido al vino. Sin embargo, no existe una correlación directa entre los niveles de YAN y la producción de sulfuro de hidrógeno, ya que la levadura puede producir H ₂ S incluso en presencia de abundante nitrógeno, pero en cambio carece de otros nutrientes vitales (como la vitamina ácido pantoténico). Incluso hay algunas cepas de S. cerevisiae que producen H ₂ S como respuesta a tener demasiado nitrógeno disponible (particularmente demasiado ácido glutámico y alanina). Esta es la razón por la que un enfoque profiláctico de agregar indiscriminadamente suplementos de nitrógeno a cada fermentación puede no tener los resultados deseados de prevención de H ₂ S.

Los niveles de nitrógeno en el vino pueden influir en muchos aspectos sensoriales del vino resultante, incluida la síntesis de muchos compuestos aromáticos. Los alcoholes de fusel se fabrican mediante la degradación de aminoácidos, aunque en presencia de altos niveles de amoníaco y urea se reduce su producción. Cuando el nitrógeno disponible es limitado, los niveles de glicerol y trehalosa, que pueden influir en la sensación en la boca, son más altos.

Estimaciones de cuánto se necesita

La cantidad de YAN necesaria dependerá de cuáles sean los objetivos del enólogo para la fermentación, particularmente si se desea o no una fermentación salvaje o si el vino se fermentará por completo hasta la sequedad. El estado de las uvas y las condiciones de fermentación influirán en la cantidad de nitrógeno necesaria. La fruta que está dañada, mohosa o infectada con botritis generalmente tendrá menos nitrógeno (así como otros recursos vitamínicos) cuando llegan del viñedo que las uvas limpias e intactas. Este agotamiento puede verse agravado aún más por la clarificación excesiva del mosto y el alto contenido de azúcar. Los vinos fermentados a temperaturas más altas tienden a progresar a un ritmo más rápido, requiriendo más nitrógeno que una fermentación más prolongada y más fría.

El rango sugerido por los enólogos varía de 150 mg/L YAN a 400 mg de nitrógeno por litro. Algunos estudios han demostrado que se pueden lograr tasas máximas de fermentación con YAN en el rango de 400 a 500 mg N/L. Sin embargo, no todos los enólogos querrán tener una fermentación al máximo (en términos de biomasa de levadura, temperatura y velocidad) debido al impacto que puede tener en otros aspectos sensoriales del vino, como el desarrollo del aroma y la retención de la fruta.

Un estudio realizado por el Departamento de Viticultura y Enología de UC Davis encontró que las recomendaciones sobre los niveles óptimos de nitrógeno para completar una fermentación exitosa podrían basarse en el nivel Brix de cosecha que han sido adoptados por muchos fabricantes de levadura y nutrientes.

• 21°Bx = 200 mg N/L
• 23°Bx = 250 mg N/L
• 25°Bx = 300 mg N/L
• 27°Bx = 350 mg N/L

Sin embargo, otros estudios han demostrado que se lleva a cabo una fermentación exitosa con niveles de YAN por debajo de estas recomendaciones, así como fermentaciones lentas/atascadas que ocurren incluso cuando los niveles de YAN están en línea con las recomendaciones.

En fermentación maloláctica

Al igual que la levadura, las bacterias del ácido láctico (BAL) utilizadas en la fermentación maloláctica (generalmente Oenococcus oeni) requieren nitrógeno. Sin embargo, a diferencia de S. cerevisiae, las LAB no pueden utilizar amoníaco y las adiciones como el fosfato diamónico (DAP) no ofrecen beneficios nutricionales. Los enólogos que, sin darse cuenta, usan DAP como un aditivo nutritivo para su inoculación de FML corren el riesgo de proporcionar nutrientes en su lugar para organismos de deterioro como Brettanomyces.

Si bien algunos enólogos inocularán sus LAB con nutrientes que incluyen nitrógeno, la mayoría de los nutrientes necesarios para la FML provienen de la descomposición (o autolisis) de las células de levadura muertas. Además, la mayoría de las bacterias utilizadas en la FML tienen la capacidad de producir enzimas proteasas extracelulares que también pueden descomponer cadenas peptídicas más grandes en sus residuos de aminoácidos básicos que luego pueden usarse para el metabolismo.

Mediciones y pruebas

El ensayo de nitrógeno por o-ftaldialdehído (NOPA) se usa para medir los aminoácidos primarios disponibles en el jugo de uva usando un espectrofotómetro que puede medir en longitudes de onda de 335 nm. Dado que el ensayo solo mide los aminoácidos primarios, los resultados producidos no incluirán las concentraciones de prolina o amoníaco. La prolina se puede medir por separado con un ensayo que usa ninhidrina para reaccionar con el aminoácido en presencia de ácido fórmico, produciendo un compuesto que se puede absorber a 517 nm.

La titulación con formol, inventada por el químico danés SPL Sørensen en 1907, utiliza formaldehído en presencia de hidróxido de potasio o sodio para medir la concentración de aminoácidos y amoníaco con la ayuda de un medidor de pH. Los reactivos también reaccionarán con la prolina, lo que puede dar una medida de YAN ligeramente superior a la de NOPA. El método Formal también tiene las desventajas de implicar el uso y la eliminación de formaldehído, que es un carcinógeno conocido, y el reactivo altamente tóxico cloruro de bario.

El amoníaco y el amonio se pueden medir utilizando una sonda de electrodo selectivo de iones y un medidor de pH.

Suplemento de nitrógeno

Los enólogos saben desde hace mucho tiempo que algunas fermentaciones son más predecibles y "más sanas" si se agrega orujo (las pieles sólidas, las semillas y los restos que quedan después del prensado) de otro vino al lote. Este es un método que todavía se usa hoy en día para hacer el vino italiano Ripasso. En la Toscana del siglo XIV, la técnica del gobierno utilizada en algunos de los primeros Chiantis consistía en agregar uvas pasas al lote. Si bien eso también agregó azúcar, ambos métodos proporcionaron nitrógeno adicional y otros nutrientes aún disponibles en las pieles y semillas.

A medida que los enólogos comenzaron a comprender mejor la ciencia de la fermentación, el nitrógeno se identificó como un nutriente principal y los enólogos ya en el siglo XX comenzaron a agregar sales de amonio a su mosto. La urea también se usó como un suplemento de nitrógeno temprano, pero la investigación que la vincula con el desarrollo del carbamato de etilo ha llevado a su prohibición en muchos países, incluido Estados Unidos desde 1990.

Hay muchos tipos de suplementos de nitrógeno disponibles para que los utilicen los enólogos. La mayoría de ellos son formulaciones complejas que incluyen nitrógeno (ya sea de aminoácidos o sales de amonio) junto con vitaminas, minerales y otros factores de crecimiento y se venden bajo marcas como Go-Ferm, Superfood, Fermaid K (los dos últimos también contienen algo de DAP). Los aminoácidos se pueden agregar directamente al mosto, aunque a partir de 2010 solo se permite agregar glicina al mosto en los Estados Unidos.

Las cáscaras de levadura (o fantasmas de levadura) son los remanentes de las paredes celulares de levadura que quedan de la producción comercial de cepas de levadura que se usarán para la inoculación. Además de proporcionar una fuente de nitrógeno asimilable a partir de aminoácidos, también proporcionan lípidos y esteroles que las células pueden utilizar para fortalecer su membrana plasmática, lo que permite la absorción de otras fuentes de nitrógeno.

Riesgo de añadir demasiado

Los suplementos de nitrógeno, particularmente DAP, estimulan la reproducción de la levadura y pueden aumentar considerablemente la biomasa. Esto podría tener como consecuencia acelerar la tasa de fermentación más rápido de lo que un enólogo puede desear y también aumentará la temperatura de fermentación debido al calor generado por la levadura. El exceso de biomasa también puede crear una escasez de otros nutrientes de la levadura, como vitaminas y esteroles, debido al aumento de la competencia y puede conducir a la producción de malos olores (como el sulfuro de hidrógeno) e incluso fermentaciones estancadas.

Los niveles excesivos del aminoácido arginina (más de 400 mg/L), especialmente cerca del final de la fermentación, pueden presentar el riesgo de aumentar la producción de carbamato de etilo. Esto se debe a que la arginina se descompone en urea que puede ser reabsorbida y utilizada por la levadura o metabolizada en amoníaco. Sin embargo, la urea también reacciona con el etanol si no se metaboliza por completo, lo que, junto con la exposición a largo plazo (así como las altas temperaturas), puede conducir a la producción del éster de carbamato de etilo.

Sin embargo, el mayor riesgo de suplementar en exceso un mosto es que se deje un exceso de nitrógeno y otros nutrientes después de que se complete la fermentación. Esto puede crear inestabilidad microbiana ya que los organismos de deterioro pueden usar estos nutrientes en exceso.

Leyes y reglamentos del vino.

En los Estados Unidos, la Oficina de Impuestos y Comercio de Alcohol y Tabaco (TTB) limita el uso de fosfato diamónico como aditivo de nitrógeno a 968 mg/L (8 lbs/1000 gal), lo que proporciona 203 mg N/L de YAN. En la Unión Europea, la mayoría de los países siguen las directrices de la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV), que dicta un límite de 300 mg/L. En Australia, el límite se basa en el nivel de fosfato inorgánico con un límite máximo permitido de 400 mg/L de fosfato.

Influencia del tiempo

Como la mayoría de los suplementos de nutrientes alimentan a todos los microorganismos vivos en el mosto (ya sea deseable o no), los enólogos a menudo esperarán para agregar los nutrientes hasta que estén listos para inocular el mosto con la cepa deseada de S. cerevisiae. Los productores que usan fermentos silvestres también pueden esperar hasta después de que las adiciones de dióxido de azufre hayan eliminado los microbios no deseados o alimentarlos antes porque les gustaría la complejidad potencial que otros microbios podrían agregar al vino. Cuando se agrega, el nitrógeno suele estar en forma de aminoácidos, combinado con vitaminas y minerales para ayudar a iniciar la fermentación.

Poco después de la inoculación, la levadura comienza a consumir rápidamente el nitrógeno asimilable disponible y hasta el 46% de YAN se consume por completo al comienzo de la fermentación completa.Debido a que el nitrógeno inorgánico, como las sales de amonio en DAP, son tóxicos para la levadura en niveles altos, nunca se agrega durante la inoculación cuando la biomasa de la levadura recién rehidratada es baja. Muchos enólogos dividen la dosis de DAP y la primera adición se realiza al final de la fase de latencia, cuando la levadura entra en su período de crecimiento exponencial y comienza la fermentación alcohólica. En la mayoría de los mostos, esto es alrededor de 48 a 72 horas después de la inoculación. A menudo, se agrega una segunda dosis alrededor de un tercio de la fermentación del azúcar y, a menudo, antes de que los niveles de azúcar alcancen los 12-10 Brix (6,5 a 5,5 Baumé, 48,3 a 40,0 Oechsle) porque a medida que avanza la fermentación, las células de levadura ya no pueden llevar el nitrógeno a la celda debido a la creciente toxicidad del etanol que rodea las celdas.