Nitrilasa

Nitrilasa (nitrilo aminohidrolasa; EC 3.5.5.1) catalizan la hidrólisis de los nitrilos a ácidos carboxílicos y amoníaco, sin la formación de compuestos "libres&#34. ; intermedios de amida. Las nitrilasas participan en la biosíntesis de productos naturales y en modificaciones postraduccionales en plantas, animales, hongos y ciertos procariotas. Las nitrilasas también se pueden utilizar como catalizadores en química orgánica preparativa. Entre otras, se han utilizado nitrilasas para la resolución de mezclas racémicas. La nitrilasa no debe confundirse con la nitrilo hidratasa (nitrilo hidroliasa; EC 4.2.1.84), que hidroliza los nitrilos a amidas. Las nitrilo hidratasas casi invariablemente se coexpresan con una amidasa, que convierte la amida en ácido carboxílico. En consecuencia, a veces puede resultar difícil distinguir la actividad nitrilasa de la actividad nitrilo hidratasa más amidasa.

Mecanismo

La nitrilasa se descubrió por primera vez a principios de la década de 1960 por su capacidad para catalizar la hidratación de un nitrilo a un ácido carboxílico. Aunque en ese momento se sabía que la nitrilasa podía operar con una amplia especificidad de sustrato en la producción del ácido correspondiente, estudios posteriores informaron de la primera actividad NHasa (nitrilo hidratasa) exhibida por la nitrilasa. Es decir, también podrían formarse compuestos de amida mediante hidrólisis de nitrilo. Investigaciones adicionales han revelado varias condiciones que promueven la formación de amidas, que se describen a continuación.

• La liberación temprana del sustrato enzimático después de la primera hidrolisis de agua seguida de la adición retardada del segundo agua
• Temperatura baja y condiciones de pH aumentadas. Para bioconversiones por nitrilase para la mayoría de bacterias y hongos, el rango óptimo de pH es entre 7.0-8.0 y el rango óptimo de temperatura es entre 30 y 50 °C.
• Grupos de retiro de electrones en la ⍺-posición

A continuación se muestra una lista de los pasos necesarios para transformar un compuesto de nitrilo genérico con nitrilasa:

1. El carbono electrofílico del nitrilo está sujeto a ataque nucleófilo por uno de los dos grupos SH en nitrilase.
2. La thioimidate formada es posteriormente hidrolizada a la acilencime y amoníaco se crea como subproducto.
3. La acilencime puede pasar por una de dos vías dependiendo de las condiciones resaltadas anteriormente:
   • La hidrolización adicional de la acilenzima con agua produce el ácido carboxílico y la enzima regenerada.
   • La acilencime es hidrolizada por amoníaco, desplazando la enzima y formando el producto de la amida.

Estructura

La mayoría de las nitrilasas están formadas por un solo polipéptido que varía de 32 a 45 kDa, y su estructura es un pliegue ⍺-β-β-⍺. La forma preferida de la enzima es un filamento grande que consta de 6 a 26 subunidades. La nitrilasa explota la tríada catalítica Lys-Cys-Glu, que es esencial para la función de su sitio activo y para mejorar su rendimiento.

La estructura de una nitrilasa termoactiva de P. abyssi consiste en un dímero doblemente simétrico en el que cada subunidad contiene 262 residuos. Al igual que otras nitrilasas de la familia de las nitrilasas, cada subunidad tiene un pliegue sándwich ⍺-β-β-⍺; cuando las dos subunidades se unen e interactúan, la proteína forma una estructura de "súper sándwich" (⍺-β-β-⍺-⍺-β-β-⍺). Para dimerizar, los terminales C de cada subunidad se extienden desde el núcleo e interactúan entre sí, y esto es posible en gran medida gracias a los puentes salinos formados entre los residuos de arginina y glutamato.

Aunque aún se desconoce el mecanismo exacto de unión al sustrato de nitrilo, al realizar comparaciones entre la secuencia y la estructura con otras nitrilasas, se determinó que la tríada catalítica estaba formada por Glu 42, Lys 113 y Cys 146. Con la ayuda de En los programas de modelado de proteínas, se observó que Glu 42 era la base catalítica en la activación del nucleófilo (Cys 146) en función de la distancia relativamente corta entre el O en Glu y el S en Cys. Asimismo, se infirió que Lys 113 era el ácido catalítico responsable de la transferencia de protones al sustrato.

Función biológica

Las nitrilasas desempeñan funciones críticas en las interacciones entre plantas y microbios para la defensa, la desintoxicación, la utilización del nitrógeno y la síntesis de hormonas vegetales. En las plantas, existen dos grupos distinguibles con respecto a la especificidad de sustrato: aquellas con alta actividad hidrolítica hacia los arilacetonitrilos y aquellas con alta actividad hacia la β-ciano-L-alanina. NIT1, 2 y 3 de la especie A. thaliana son ejemplos del primer grupo de nitrilasas vegetales (arilacetonitrilasas) que hidrolizan los nitrilos producidos durante la síntesis o degradación de glucósidos y glucosinolatos cianogénicos. Los sustratos de arilcetonitrilo para estas enzimas particulares consisten en fenilpropionitrilo y otros productos que resultan del metabolismo del glucosinolato. Sin embargo, NIT4 pertenece al segundo grupo de nitrilasas vegetales y es fundamental para la desintoxicación de cianuro en las plantas.

Además, los microbios también podrían utilizar la nitrilasa para desintoxicar y asimilar los nitrilos y el cianuro que existen en el entorno vegetal. Un ejemplo de esto es la β-ciano-L-alanina nitrilasa de la bacteria vegetal P. fluorescens SBW25. Aunque se desconoce si esta bacteria vegetal encuentra niveles tóxicos de β-ciano-ʟ-alanina en entornos naturales, se ha observado actividad nitrilasa en plantas cianogénicas; por tanto, parece que la nitrilasa sirve como mecanismo predominante para desintoxicar el cianuro en lugar de la β-ciano-ʟ-alanina. Otras aplicaciones bacterianas de las nitrilasas producidas por microorganismos asociados a plantas incluyen la degradación de nitrilos vegetales para obtener una fuente de carbono y nitrógeno. P. fluorescens EBC191 hidroliza muchos arilacetonitrilos, concretamente el mandelonitrilo, que sirve como defensa contra los herbívoros.