NASBA (biología molecular)

La amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, comúnmente conocida como NASBA, es un método de biología molecular que se utiliza para producir múltiples copias de ARN monocatenario. NASBA es un proceso de dos pasos que toma ARN y lo hibrida con cebadores especialmente diseñados, luego utiliza un cóctel de enzimas para amplificarlo.

La amplificación de ácidos nucleicos es una técnica que se utiliza para producir varias copias de un segmento específico de ARN/ADN. El ARN y el ADN amplificados se pueden utilizar para diversas aplicaciones, como la genotipificación, la secuenciación y la detección de bacterias o virus. Existen dos tipos diferentes de amplificación: no isotérmica e isotérmica. La amplificación no isotérmica produce múltiples copias de ARN/ADN mediante ciclos reiterativos entre diferentes temperaturas. La amplificación isotérmica produce múltiples copias de ARN/ADN a una temperatura de reacción constante. La NASBA toma ARN monocatenario, le aplica cebadores a 65 °C y luego lo amplifica a 41 °C para producir múltiples copias de ARN monocatenario. Para que se produzca una amplificación exitosa, se utiliza un cóctel de enzimas que contiene transcriptasa inversa de mieloblastosis aviar (AMV-RT), ARNasa H y ARN polimerasa. La AMV-RT sintetiza una cadena de ADN complementaria (ADNc) a partir de la plantilla de ARN una vez que se ha hibridado el cebador. Luego, la ARNasa H degrada la plantilla de ARN y el otro cebador se une al ADNc para formar ADN bicatenario, que la ARN polimerasa utiliza para sintetizar copias de ARN. Un aspecto clave de la NASBA es que el material de partida y el producto final siempre es ARN monocatenario. Dicho esto, se puede utilizar para amplificar ADN, pero el ADN debe traducirse a ARN para que se produzca una amplificación exitosa.

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es otra técnica de amplificación isotérmica.

NASBA fue desarrollado por J. Compton en 1991, quien lo definió como "una tecnología dependiente de cebadores que puede utilizarse para la amplificación continua de ácidos nucleicos en una única mezcla a una temperatura". Inmediatamente después de la invención de NASBA se utilizó para el diagnóstico rápido y la cuantificación del VIH-1 en sueros de pacientes. Aunque el ARN también puede amplificarse mediante PCR utilizando una transcriptasa inversa (para sintetizar una cadena de ADN complementaria como plantilla), la principal ventaja de NASBA es que funciona en condiciones isotérmicas, normalmente a una temperatura constante de 41 °C o dos temperaturas diferentes, dependiendo de los cebadores y las enzimas utilizadas. Incluso cuando se aplican dos temperaturas diferentes, se sigue considerando isotérmica, porque no oscila entre esas temperaturas. NASBA puede utilizarse en diagnósticos médicos como una alternativa a la PCR que es más rápida y sensible en algunas circunstancias.

Explicado brevemente, NASBA funciona de la siguiente manera:

1. Plantilla RNA agregada a la mezcla de reacción, la primera cartilla con la región promotora T7 en su extremo 5' se adhiere a su sitio complementario al final de 3' de la plantilla.
2. La transcriptasa inversa sintetiza el hilo de ADN complementario opuesto que extiende el extremo de 3' de la imprimación, moviéndose a lo largo de la plantilla de ARN.
3. RNAse H destruye la plantilla de ARN del compuesto ADN-RNA (RNAse H sólo destruye ARN en híbridos RNA-DNA, pero no ARN monoplazado).
4. La segunda cartilla se adhiere al final de 5' de la cadena de ADN (antisense).
5. La transcripción inversa nuevamente sintetiza otra cadena de ADN de la imprimación adjunta que resulta en ADN doble hebrado.
6. La polimerasa T7 RNA se une a la región promotora en el doble hilo. Desde La polimerasa T7 RNA sólo puede transcribir en la dirección de 3' a 5' el ADN sentido se transcribe y se produce un ARN anti-sentido. Esto se repite, y la polimerasa produce continuamente hilos de ARN complementarios de esta plantilla que resulta en la amplificación.
7. Ahora una fase cíclica puede comenzar similar a los pasos anteriores. Aquí, sin embargo, el segundo primero se une a la (-) ARN
8. La transcripción inversa ahora produce un dúplex (+)cDNA/(-)RNA.
9. RNAse H degrada de nuevo el ARN y el primer primicio se une a la ahora sola hebrada +(cDNA)
10. La transcripción inversa ahora produce el DNA complementario, creando un dsDNA duplex
11. Exactamente como el paso 6, la polimerasa T7 se une a la región promotora para producir (-) ARN, y el ciclo está completo.

La técnica NASBA se ha utilizado para desarrollar pruebas de diagnóstico rápido para varios virus patógenos con genomas de ARN monocatenario, por ejemplo, la gripe A, el virus del Zika, el virus de la fiebre aftosa, el coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS), el bocavirus humano (HBoV) y también parásitos como Trypanosoma brucei.

Recientemente, se ha desarrollado la reacción NASBA con fluorescencia, tira reactiva y lectura de secuenciación de última generación para el diagnóstico de COVID-19.

• Reacción de cadena de polimerasa en tiempo real