Nanotecnología de ADN

Nanotecnología de ADN es el diseño y fabricación de estructuras artificiales de ácidos nucleicos para usos tecnológicos. En este campo, los ácidos nucleicos se utilizan como materiales de ingeniería no biológicos para la nanotecnología más que como portadores de información genética en células vivas. Los investigadores en el campo han creado estructuras estáticas como redes cristalinas bidimensionales y tridimensionales, nanotubos, poliedros y formas arbitrarias, y dispositivos funcionales como máquinas moleculares y computadoras de ADN. El campo está comenzando a utilizarse como una herramienta para resolver problemas científicos básicos en biología estructural y biofísica, incluidas aplicaciones en cristalografía de rayos X y espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas para determinar estructuras. También se están investigando posibles aplicaciones en electrónica y nanomedicina a escala molecular.

La base conceptual de la nanotecnología del ADN fue establecida por primera vez por Nadrian Seeman a principios de la década de 1980, y el campo comenzó a atraer un interés generalizado a mediados de la década de 2000. Este uso de ácidos nucleicos está permitido por sus estrictas reglas de emparejamiento de bases, que hacen que solo porciones de cadenas con secuencias de bases complementarias se unan para formar estructuras de doble hélice fuertes y rígidas. Esto permite el diseño racional de secuencias de bases que se ensamblarán selectivamente para formar estructuras diana complejas con características a nanoescala controladas con precisión. Se utilizan varios métodos de ensamblaje para hacer estas estructuras, incluidas estructuras basadas en mosaicos que se ensamblan a partir de estructuras más pequeñas, estructuras plegables mediante el método de origami de ADN y estructuras reconfigurables dinámicamente mediante métodos de desplazamiento de hebras. El nombre del campo hace referencia específicamente al ADN,nanotecnología de ácidos nucleicos.

Conceptos fundamentales

Propiedades de los ácidos nucleicos

La nanotecnología a menudo se define como el estudio de materiales y dispositivos con características en una escala inferior a 100 nanómetros. La nanotecnología de ADN, específicamente, es un ejemplo de autoensamblaje molecular ascendente, en el que los componentes moleculares se organizan espontáneamente en estructuras estables; la forma particular de estas estructuras es inducida por las propiedades físicas y químicas de los componentes seleccionados por los diseñadores. En la nanotecnología del ADN, los materiales componentes son hebras de ácidos nucleicos como el ADN; estas hebras a menudo son sintéticas y casi siempre se usan fuera del contexto de una célula viva. El ADN se adapta bien a la construcción a nanoescala porque la unión entre dos cadenas de ácido nucleico depende de reglas simples de emparejamiento de bases que se entienden bien y forman la estructura a nanoescala específica de la doble hélice del ácido nucleico. Estas cualidades hacen que el ensamblaje de estructuras de ácidos nucleicos sea fácil de controlar mediante el diseño de ácidos nucleicos. Esta propiedad está ausente en otros materiales utilizados en nanotecnología, incluidas las proteínas, para las cuales el diseño de proteínas es muy difícil, y las nanopartículas, que carecen de la capacidad de ensamblaje específico por sí mismas.

La estructura de una molécula de ácido nucleico consta de una secuencia de nucleótidos que se distinguen por la nucleobase que contienen. En el ADN, las cuatro bases presentes son adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Los ácidos nucleicos tienen la propiedad de que dos moléculas solo se unirán entre sí para formar una doble hélice si las dos secuencias son complementarias, lo que significa que forman secuencias coincidentes de pares de bases, con A solo uniéndose a T y C solo a G. Debido a que la formación de pares de bases emparejados correctamente es energéticamente favorable, en la mayoría de los casos se espera que las hebras de ácido nucleico se unan entre sí en la conformación que maximiza el número de bases emparejadas correctamente. Las secuencias de bases en un sistema de cadenas determinan el patrón de unión y la estructura general de una manera fácilmente controlable. En la nanotecnología del ADN, los investigadores diseñan racionalmente las secuencias de bases de las hebras para que las interacciones de emparejamiento de bases hagan que las hebras se ensamblen en la conformación deseada. Si bien el ADN es el material dominante utilizado, también se han construido estructuras que incorporan otros ácidos nucleicos como el ARN y el ácido nucleico peptídico (PNA).

Subcampos

La nanotecnología de ADN a veces se divide en dos subcampos superpuestos: nanotecnología de ADN estructural y nanotecnología de ADN dinámico. La nanotecnología de ADN estructural, a veces abreviada como SDN, se centra en sintetizar y caracterizar complejos de ácidos nucleicos y materiales que se ensamblan en un estado final de equilibrio estático. Por otro lado, la nanotecnología de ADN dinámico se centra en complejos con un comportamiento de no equilibrio útil, como la capacidad de reconfigurarse en función de un estímulo químico o físico. Algunos complejos, como los dispositivos nanomecánicos de ácido nucleico, combinan características de los subcampos estructural y dinámico.

Los complejos construidos en nanotecnología de ADN estructural utilizan estructuras de ácido nucleico topológicamente ramificadas que contienen uniones. (Por el contrario, la mayor parte del ADN biológico existe como una doble hélice no ramificada). Una de las estructuras ramificadas más simples es una unión de cuatro brazos que consta de cuatro hebras de ADN individuales, partes de las cuales son complementarias en un patrón específico. A diferencia de los cruces naturales de Holliday, cada brazo en el cruce artificial inmóvil de cuatro brazos tiene una secuencia de bases diferente, lo que hace que el punto de unión se fije en una posición determinada. Las uniones múltiples se pueden combinar en el mismo complejo, como en el motivo estructural de doble cruce (DX) ampliamente utilizado, que contiene dos dominios paralelos de doble hélice con hebras individuales que se cruzan entre los dominios en dos puntos de cruce. Cada punto de cruce es, topológicamente,

La nanotecnología de ADN dinámico utiliza un mecanismo llamado desplazamiento de cadena mediado por toehold para permitir que los complejos de ácido nucleico se reconfiguren en respuesta a la adición de una nueva cadena de ácido nucleico. En esta reacción, la hebra entrante se une a una región de apoyo de una sola hebra de un complejo de doble hebra y luego desplaza una de las hebras unidas en el complejo original a través de un proceso de migración de ramificación. El efecto general es que una de las hebras del complejo se reemplaza por otra. Además, se pueden fabricar estructuras y dispositivos reconfigurables utilizando ácidos nucleicos funcionales como desoxirribozimas y ribozimas, que pueden realizar reacciones químicas, y aptámeros, que pueden unirse a proteínas específicas o moléculas pequeñas.

Nanotecnología de ADN estructural

La nanotecnología de ADN estructural, a veces abreviada como SDN, se enfoca en sintetizar y caracterizar complejos de ácidos nucleicos y materiales donde el ensamblaje tiene un punto final de equilibrio estático. La doble hélice de ácido nucleico tiene una geometría tridimensional definida y robusta que hace posible simular, predecir y diseñar las estructuras de complejos de ácido nucleico más complicados. Se han creado muchas estructuras de este tipo, incluidas estructuras bidimensionales y tridimensionales, y estructuras periódicas, aperiódicas y discretas.

Redes extendidas

Los pequeños complejos de ácidos nucleicos se pueden equipar con extremos cohesivos y se pueden combinar en redes periódicas bidimensionales más grandes que contienen un patrón teselado específico de los mosaicos moleculares individuales. El primer ejemplo de esto utilizó complejos de doble cruce (DX) como mosaicos básicos, cada uno con cuatro extremos adhesivos diseñados con secuencias que causaron que las unidades DX se combinaran en láminas planas bidimensionales periódicas que son esencialmente cristales bidimensionales rígidos de ADN.. También se han creado matrices bidimensionales a partir de otros motivos, incluida la red de rombos de unión de Holliday y varias matrices basadas en DX que utilizan un esquema de doble cohesión. Las dos imágenes superiores a la derecha muestran ejemplos de redes periódicas basadas en mosaicos.

Se pueden hacer matrices bidimensionales para exhibir estructuras aperiódicas cuyo ensamblaje implementa un algoritmo específico, exhibiendo una forma de computación de ADN. Los mosaicos DX pueden elegir sus secuencias finales adhesivas para que actúen como mosaicos Wang, lo que les permite realizar cálculos. Se ha demostrado una matriz DX cuyo ensamblaje codifica una operación XOR; esto permite que la matriz de ADN implemente un autómata celular que genera un fractal conocido como la junta de Sierpinski. La tercera imagen a la derecha muestra este tipo de matriz. Otro sistema tiene la función de un contador binario, mostrando una representación de números binarios crecientes a medida que crece. Estos resultados muestran que la computación se puede incorporar en el ensamblaje de matrices de ADN.

Las matrices DX se han fabricado para formar nanotubos huecos de 4 a 20 nm de diámetro, esencialmente redes bidimensionales que se curvan sobre sí mismas. Estos nanotubos de ADN son algo similares en tamaño y forma a los nanotubos de carbono, y aunque carecen de la conductancia eléctrica de los nanotubos de carbono, los nanotubos de ADN se modifican y conectan más fácilmente a otras estructuras. Uno de los muchos esquemas para construir nanotubos de ADN utiliza una red de mosaicos DX curvos que se enrollan sobre sí mismos y se cierran en un tubo. En un método alternativo que permite especificar la circunferencia de una manera simple y modular utilizando tejas de un solo hilo, la rigidez del tubo es una propiedad emergente.

La formación de redes tridimensionales de ADN fue el primer objetivo de la nanotecnología del ADN, pero resultó ser uno de los más difíciles de realizar. En 2009 finalmente se informó sobre el éxito con un motivo basado en el concepto de tensegridad, un equilibrio entre las fuerzas de tensión y compresión.

Estructuras discretas

Los investigadores han sintetizado muchos complejos de ADN tridimensionales que tienen la conectividad de un poliedro, como un cubo o un octaedro, lo que significa que los dúplex de ADN trazan los bordes de un poliedro con una unión de ADN en cada vértice. Las primeras demostraciones de poliedros de ADN requerían mucho trabajo y requerían múltiples ligaduras y pasos de síntesis en fase sólida para crear poliedros en cadena. El trabajo posterior produjo poliedros cuya síntesis fue mucho más fácil. Estos incluyen un octaedro de ADN hecho de una sola cadena larga diseñada para plegarse en la conformación correcta, y un tetraedro que se puede producir a partir de cuatro cadenas de ADN en un solo paso, que se muestra en la parte superior de este artículo.

Las nanoestructuras de formas arbitrarias y no regulares generalmente se fabrican utilizando el método de origami de ADN. Estas estructuras consisten en una hebra de virus natural larga como un "andamio", que se dobla en la forma deseada mediante hebras "básicas" cortas diseñadas computacionalmente. Este método tiene la ventaja de ser fácil de diseñar, ya que la secuencia de bases está predeterminada por la secuencia de la cadena del andamio, y no requiere una alta pureza de la cadena y una estequiometría precisa, como lo hacen la mayoría de los otros métodos de nanotecnología de ADN. El origami de ADN se demostró por primera vez para formas bidimensionales, como una cara sonriente, un mapa tosco del hemisferio occidental y la pintura de Mona Lisa. Se pueden hacer estructuras tridimensionales sólidas usando hélices de ADN paralelas dispuestas en un patrón de panal,y se pueden hacer estructuras con caras bidimensionales para que se plieguen en una forma tridimensional total hueca, similar a una caja de cartón. Estos pueden programarse para abrirse y revelar o liberar una carga molecular en respuesta a un estímulo, lo que los hace potencialmente útiles como jaulas moleculares programables.

Ensamblaje con plantilla

Las estructuras de ácido nucleico se pueden hacer para incorporar moléculas distintas de los ácidos nucleicos, a veces denominadas heteroelementos, incluidas proteínas, nanopartículas metálicas, puntos cuánticos, aminas y fullerenos. Esto permite la construcción de materiales y dispositivos con una gama de funcionalidades mucho mayor de lo que es posible con ácidos nucleicos solos. El objetivo es utilizar el autoensamblaje de las estructuras de ácido nucleico para moldear el ensamblaje de las nanopartículas alojadas en ellas, controlando su posición y, en algunos casos, su orientación. Muchos de estos esquemas usan un esquema de unión covalente, usando oligonucleótidos con grupos funcionales amida o tiol como un controlador químico para unir los heteroelementos. Este esquema de unión covalente se ha utilizado para organizar nanopartículas de oro en una matriz basada en DX, y para organizar las moléculas de proteína estreptavidina en patrones específicos en una matriz DX. Se usó un esquema de hospedaje no covalente que utiliza poliamidas Dervan en una matriz DX para organizar proteínas de estreptavidina en un patrón específico en una matriz DX. Los nanotubos de carbono se han alojado en matrices de ADN en un patrón que permite que el ensamblaje actúe como un dispositivo electrónico molecular, un transistor de efecto de campo de nanotubos de carbono. Además, existen métodos de metalización de ácidos nucleicos, en los que el ácido nucleico se reemplaza por un metal que asume la forma general de la estructura original del ácido nucleico, y esquemas para usar nanoestructuras de ácidos nucleicos como máscaras litográficas, transfiriendo su patrón a una superficie sólida..

Nanotecnología de ADN dinámico

La nanotecnología de ADN dinámico se centra en la formación de sistemas de ácidos nucleicos con funcionalidades dinámicas diseñadas relacionadas con sus estructuras generales, como la computación y el movimiento mecánico. Existe cierta superposición entre la nanotecnología de ADN estructural y dinámica, ya que las estructuras se pueden formar a través del recocido y luego reconfigurarse dinámicamente, o se pueden hacer para que se formen dinámicamente en primer lugar.

Dispositivos nanomecánicos

Se han creado complejos de ADN que cambian su conformación ante algún estímulo, lo que los convierte en una forma de nanorobótica. Estas estructuras se forman inicialmente de la misma manera que las estructuras estáticas hechas en nanotecnología de ADN estructural, pero están diseñadas para que la reconfiguración dinámica sea posible después del ensamblaje inicial. El primer dispositivo de este tipo hizo uso de la transición entre las formas B-DNA y Z-DNA para responder a un cambio en las condiciones de amortiguamiento mediante un movimiento giratorio. Esta dependencia de las condiciones del búfer hizo que todos los dispositivos cambiaran de estado al mismo tiempo. Los sistemas subsiguientes podrían cambiar de estado en función de la presencia de hebras de control, lo que permitiría que varios dispositivos funcionaran de forma independiente en la solución. Algunos ejemplos de tales sistemas son un diseño de "pinzas moleculares" que tiene un estado abierto y otro cerrado, un dispositivo que podría cambiar de una conformación de cruce paranémico (PX) a una conformación de doble unión (JX2), experimentando un movimiento de rotación en el proceso, y una matriz bidimensional que podría expandirse y contraerse dinámicamente en respuesta a los hilos de control. También se han creado estructuras que se abren o cierran dinámicamente, actuando potencialmente como una jaula molecular para liberar o revelar una carga funcional al abrirse.

Los caminantes de ADN son una clase de nanomáquinas de ácido nucleico que exhiben un movimiento direccional a lo largo de una pista lineal. Se han demostrado un gran número de esquemas. Una estrategia consiste en controlar el movimiento del caminante a lo largo de la pista mediante hilos de control que deben agregarse manualmente en secuencia. También es posible controlar los pasos individuales de un andador de ADN mediante la irradiación con luz de diferentes longitudes de onda. Otro enfoque es hacer uso de enzimas de restricción o desoxirribozimas para romper las hebras y hacer que el andador avance, lo que tiene la ventaja de correr de forma autónoma. Un sistema posterior podría caminar sobre una superficie bidimensional en lugar de una pista lineal, y demostró la capacidad de recoger y mover selectivamente carga molecular.En 2018, se demostró que un ADN concatenado que utiliza la transcripción de círculo rodante por una ARN polimerasa T7 adjunta camina a lo largo de una ruta de ADN, guiado por la cadena de ARN generada. Además, se ha demostrado un andador lineal que realiza la síntesis de plantillas de ADN a medida que el andador avanza a lo largo de la pista, lo que permite la síntesis química autónoma de varios pasos dirigida por el andador. La función de los caminantes de ADN sintético es similar a la de las proteínas dineína y quinesina.

Cascadas de desplazamiento de hebras

Las cascadas de reacciones de desplazamiento de hebras se pueden utilizar con fines computacionales o estructurales. Una reacción de desplazamiento de cadena individual implica revelar una nueva secuencia en respuesta a la presencia de alguna cadena iniciadora. Muchas de estas reacciones se pueden vincular en una cascada donde la secuencia de salida recién revelada de una reacción puede iniciar otra reacción de desplazamiento de cadena en otro lugar. Esto, a su vez, permite la construcción de redes de reacciones químicas con muchos componentes, exhibiendo capacidades computacionales y de procesamiento de información complejas. Estas cascadas se vuelven energéticamente favorables a través de la formación de nuevos pares de bases y la ganancia de entropía de las reacciones de desensamblaje. Las cascadas de desplazamiento de cadenas permiten la operación isotérmica del ensamblaje o proceso computacional, en contraste con el ensamblaje tradicional de ácidos nucleicos. s requisito para un paso de recocido térmico, donde la temperatura se eleva y luego se baja lentamente para asegurar la formación adecuada de la estructura deseada. También pueden apoyar la función catalítica de la especie iniciadora, donde menos de un equivalente del iniciador puede hacer que la reacción se complete.

Los complejos de desplazamiento de hebra se pueden utilizar para hacer que las puertas lógicas moleculares sean capaces de realizar cálculos complejos. A diferencia de las computadoras electrónicas tradicionales, que usan corriente eléctrica como entradas y salidas, las computadoras moleculares usan las concentraciones de especies químicas específicas como señales. En el caso de los circuitos de desplazamiento de cadenas de ácidos nucleicos, la señal es la presencia de cadenas de ácidos nucleicos que se liberan o consumen mediante eventos de unión y desunión a otras cadenas en complejos de desplazamiento. Este enfoque se ha utilizado para hacer puertas lógicas como las puertas AND, OR y NOT. Más recientemente, se demostró un circuito de cuatro bits que puede calcular la raíz cuadrada de los números enteros 0–15, utilizando un sistema de puertas que contiene 130 hebras de ADN.

Otro uso de las cascadas de desplazamiento de torones es hacer estructuras ensambladas dinámicamente. Estos utilizan una estructura de horquilla para los reactivos, de modo que cuando se une la hebra de entrada, la secuencia recién revelada está en la misma molécula en lugar de desarmarse. Esto permite agregar nuevas horquillas abiertas a un complejo en crecimiento. Este enfoque se ha utilizado para hacer estructuras simples como uniones de tres y cuatro brazos y dendrímeros.

Aplicaciones

La nanotecnología del ADN proporciona una de las pocas formas de formar estructuras complejas diseñadas con un control preciso sobre las características a nanoescala. El campo está comenzando a ver aplicaciones para resolver problemas de ciencia básica en biología estructural y biofísica. La primera aplicación de este tipo prevista para el campo, y todavía en desarrollo, es la cristalografía, donde las moléculas que son difíciles de cristalizar de forma aislada podrían organizarse dentro de una red de ácido nucleico tridimensional, lo que permite la determinación de su estructura. Otra aplicación es el uso de varillas de origami de ADN para reemplazar cristales líquidos en experimentos de acoplamiento dipolar residual en espectroscopia de RMN de proteínas; usar origami de ADN es ventajoso porque, a diferencia de los cristales líquidos, toleran los detergentes necesarios para suspender las proteínas de membrana en solución. Los caminantes de ADN se han utilizado como líneas de ensamblaje a nanoescala para mover nanopartículas y síntesis química directa. Además, las estructuras de origami de ADN han ayudado en los estudios biofísicos de la función enzimática y el plegamiento de proteínas.

La nanotecnología de ADN se está moviendo hacia posibles aplicaciones en el mundo real. La capacidad de las matrices de ácidos nucleicos para organizar otras moléculas indica sus aplicaciones potenciales en la electrónica a escala molecular. El ensamblaje de una estructura de ácido nucleico podría usarse para moldear el ensamblaje de elementos electrónicos moleculares, como cables moleculares, proporcionando un método para el control a escala nanométrica de la ubicación y la arquitectura general del dispositivo de manera análoga a una placa molecular. La nanotecnología del ADN se ha comparado con el concepto de materia programable debido al acoplamiento de la computación con sus propiedades materiales.

En un estudio realizado por un grupo de científicos de los centros iNANO y CDNA de la Universidad de Aarhus, los investigadores pudieron construir un pequeño origami de caja de ADN 3D multiconmutable. La nanopartícula propuesta se caracterizó mediante microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía electrónica de transmisión (TEM) y transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). Se demostró que la caja construida tenía un mecanismo de cierre único, que le permitía abrirse y cerrarse repetidamente en respuesta a un conjunto único de claves de ADN o ARN. Los autores propusieron que este "dispositivo de ADN se puede utilizar potencialmente para una amplia gama de aplicaciones, como el control de la función de moléculas individuales, la administración controlada de fármacos y la computación molecular".

Existen aplicaciones potenciales para la nanotecnología de ADN en la nanomedicina, haciendo uso de su capacidad para realizar cálculos en un formato biocompatible para fabricar "medicamentos inteligentes" para la administración de medicamentos dirigidos, así como para aplicaciones de diagnóstico. Uno de estos sistemas que se está investigando utiliza una caja de ADN hueca que contiene proteínas que inducen la apoptosis, o muerte celular, que solo se abrirá cuando esté cerca de una célula cancerosa. Además, ha habido interés en expresar estas estructuras artificiales en células bacterianas vivas diseñadas, muy probablemente utilizando el ARN transcrito para el ensamblaje, aunque se desconoce si estas estructuras complejas pueden plegarse o ensamblarse de manera eficiente en el citoplasma de la célula. Si tiene éxito, esto podría permitir la evolución dirigida de nanoestructuras de ácido nucleico. Científicos de la Universidad de Oxford informaron sobre el autoensamblaje de cuatro hebras cortas de ADN sintético en una jaula que puede ingresar a las células y sobrevivir durante al menos 48 horas. Se descubrió que los tetraedros de ADN marcados con fluorescencia permanecían intactos en las células de riñón humano cultivadas en laboratorio a pesar del ataque de las enzimas celulares después de dos días. Este experimento mostró el potencial de la administración de fármacos dentro de las células vivas utilizando la "jaula" de ADN. Se utilizó un tetraedro de ADN para administrar interferencia de ARN (ARNi) en un modelo de ratón, informó un equipo de investigadores del MIT. La administración del ARN de interferencia para el tratamiento ha mostrado cierto éxito con el uso de polímeros o lípidos, pero existen límites de seguridad y orientación imprecisa, además de una vida útil corta en el torrente sanguíneo. La nanoestructura de ADN creada por el equipo consta de seis cadenas de ADN para formar un tetraedro, con una cadena de ARN adherida a cada uno de los seis bordes. El tetraedro está además equipado con una proteína objetivo, tres moléculas de folato, que llevan las nanopartículas de ADN a los abundantes receptores de folato que se encuentran en algunos tumores. El resultado mostró que la expresión génica dirigida por el ARNi, la luciferasa, se redujo en más de la mitad.El tetraedro de ADN también se utilizó en un esfuerzo por superar el fenómeno de la resistencia a múltiples fármacos. La doxorrubicina (DOX) se conjugó con el tetraedro y se cargó en células de cáncer de mama MCF-7 que contenían la bomba de salida del fármaco de glicoproteína P. Los resultados del experimento mostraron que el DOX no se bombeaba y se logró la apoptosis de las células cancerosas. El tetraedro sin DOX se cargó en células para probar su biocompatibilidad y la estructura no mostró citotoxicidad en sí misma. El tetraedro de ADN también se utilizó como código de barras para perfilar la expresión subcelular y la distribución de proteínas en las células con fines de diagnóstico. El nanoestructurado tetraédrico mostró una señal mejorada debido a una mayor eficiencia y estabilidad del etiquetado.

Las aplicaciones de la nanotecnología del ADN en la nanomedicina también se centran en imitar la estructura y la función de las proteínas de membrana naturales con nanoestructuras de ADN diseñadas. En 2012, Langecker et al. introdujo una estructura de origami de ADN en forma de poro que puede autoinsertarse en las membranas lipídicas a través de modificaciones hidrofóbicas del colesterol e inducir corrientes iónicas a través de la membrana. Esta primera demostración de un canal iónico de ADN sintético fue seguida por una variedad de diseños de inducción de poros que van desde un solo dúplex de ADN hasta pequeñas estructuras basadas en mosaicos y grandes porinas transmembrana de origami de ADN.Similar a los canales iónicos de proteínas que ocurren naturalmente, este conjunto de contrapartes hechas de ADN sintético abarca múltiples órdenes de magnitud en conductancia. El estudio del dúplex de ADN único que se inserta en la membrana mostró que la corriente también debe fluir en la interfaz ADN-lípido, ya que no hay un lumen de canal central presente en el diseño que permite que los iones pasen a través de la bicapa lipídica. Esto indicó que el poro de lípido inducido por ADN tiene una forma toroidal, en lugar de cilíndrica, ya que los grupos de cabeza de lípidos se reorientan para mirar hacia la parte del ADN insertada en la membrana.Investigadores de la Universidad de Cambridge y la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign luego demostraron que dicho poro toroidal inducido por ADN puede facilitar un cambio rápido de lípidos entre las láminas de bicapa lipídica. Utilizando este efecto, diseñaron una enzima sintética construida con ADN que voltea los lípidos en las membranas biológicas órdenes de magnitudes más rápido que las proteínas naturales llamadas scramblasas. Este desarrollo destaca el potencial de las nanoestructuras de ADN sintético para fármacos y tratamientos personalizados.

Diseño

Las nanoestructuras de ADN deben diseñarse racionalmente para que las hebras de ácido nucleico individuales se ensamblen en las estructuras deseadas. Este proceso generalmente comienza con la especificación de una estructura o función objetivo deseada. Luego, se determina la estructura secundaria general del complejo objetivo, especificando la disposición de las cadenas de ácido nucleico dentro de la estructura y qué partes de esas cadenas deben unirse entre sí. El último paso es el diseño de la estructura primaria, que es la especificación de las secuencias de bases reales de cada hebra de ácido nucleico.

Diseño estructural

El primer paso en el diseño de una nanoestructura de ácido nucleico es decidir cómo debe representarse una estructura determinada mediante una disposición específica de cadenas de ácido nucleico. Este paso de diseño determina la estructura secundaria, o las posiciones de los pares de bases que mantienen juntas las hebras individuales en la forma deseada. Se han demostrado varios enfoques:

• Estructuras basadas en mosaicos. Este enfoque rompe la estructura de destino en unidades más pequeñas con una fuerte unión entre las hebras contenidas en cada unidad e interacciones más débiles entre las unidades. A menudo se usa para hacer redes periódicas, pero también se puede usar para implementar el autoensamblaje algorítmico, convirtiéndolos en una plataforma para la computación de ADN. Esta fue la estrategia de diseño dominante utilizada desde mediados de la década de 1990 hasta mediados de la década de 2000, cuando se desarrolló la metodología del origami de ADN.
• Estructuras plegables. Una alternativa al enfoque basado en baldosas, los enfoques de plegado hacen que la nanoestructura se forme a partir de una hebra larga, que puede tener una secuencia diseñada que se pliega debido a sus interacciones consigo misma, o se puede plegar en la forma deseada mediante el uso de "fibras" más cortas. "hebras. Este último método se llama origami de ADN, que permite formar formas bidimensionales y tridimensionales a nanoescala (ver Estructuras discretas más arriba).
• Montaje dinámico. Este enfoque controla directamente la cinética del autoensamblaje del ADN, especificando todos los pasos intermedios en el mecanismo de reacción además del producto final. Esto se hace utilizando materiales de partida que adoptan una estructura de horquilla; estos luego se ensamblan en la conformación final en una reacción en cascada, en un orden específico (ver Cascadas de desplazamiento de hebra a continuación). Este enfoque tiene la ventaja de proceder isotérmicamente, a una temperatura constante. Esto contrasta con los enfoques termodinámicos, que requieren un paso de recocido térmico en el que se requiere un cambio de temperatura para desencadenar el ensamblaje y favorecer la formación adecuada de la estructura deseada.

Diseño de secuencia

Después de utilizar cualquiera de los enfoques anteriores para diseñar la estructura secundaria de un complejo diana, se debe idear una secuencia real de nucleótidos que formará la estructura deseada. El diseño de ácidos nucleicos es el proceso de asignar una secuencia de bases de ácido nucleico específica a cada una de las hebras constituyentes de una estructura para que se asocien en la conformación deseada. La mayoría de los métodos tienen el objetivo de diseñar secuencias de modo que la estructura objetivo tenga la energía más baja y, por lo tanto, sea la termodinámicamente más favorable, mientras que las estructuras ensambladas incorrectamente tienen energías más altas y, por lo tanto, se ven desfavorecidas. Esto se hace a través de métodos heurísticos simples y más rápidos, como la minimización de la simetría de secuencia, o mediante el uso de un modelo termodinámico completo del vecino más cercano, que es más preciso pero más lento y computacionalmente más intensivo.

El diseño de ácidos nucleicos tiene objetivos similares al diseño de proteínas. En ambos, la secuencia de monómeros está diseñada para favorecer la estructura objetivo deseada y desfavorecer otras estructuras. El diseño de ácidos nucleicos tiene la ventaja de ser mucho más fácil desde el punto de vista computacional que el diseño de proteínas, porque las reglas simples de emparejamiento de bases son suficientes para predecir la favorabilidad energética de una estructura y no se requiere información detallada sobre el plegamiento tridimensional general de la estructura. Esto permite el uso de métodos heurísticos simples que producen diseños experimentalmente robustos. Las estructuras de ácido nucleico son menos versátiles que las proteínas en su función debido a la mayor capacidad de las proteínas para plegarse en estructuras complejas y la diversidad química limitada de los cuatro nucleótidos en comparación con los veinte aminoácidos proteinogénicos.

Materiales y métodos

Las secuencias de las hebras de ADN que componen una estructura diana se diseñan computacionalmente, utilizando software de modelado molecular y termodinámico. A continuación, los propios ácidos nucleicos se sintetizan utilizando métodos estándar de síntesis de oligonucleótidos, normalmente automatizados en un sintetizador de oligonucleótidos, y las hebras de secuencias personalizadas están disponibles comercialmente. Las hebras se pueden purificar mediante electroforesis en gel desnaturalizante si es necesario, y las concentraciones precisas se pueden determinar mediante cualquiera de varios métodos de cuantificación de ácidos nucleicos mediante espectroscopia de absorbancia ultravioleta.

Las estructuras diana completamente formadas se pueden verificar mediante electroforesis en gel nativo, que proporciona información sobre el tamaño y la forma de los complejos de ácido nucleico. Un ensayo de cambio de movilidad electroforética puede evaluar si una estructura incorpora todas las hebras deseadas. El etiquetado fluorescente y la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) se utilizan a veces para caracterizar la estructura de los complejos.

Las estructuras de ácido nucleico se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fuerza atómica, que es muy adecuada para estructuras bidimensionales extendidas, pero menos útil para estructuras tridimensionales discretas debido a la interacción de la punta del microscopio con la frágil estructura de ácido nucleico; La microscopía electrónica de transmisión y la microscopía crioelectrónica se utilizan a menudo en este caso. Las redes tridimensionales extendidas se analizan mediante cristalografía de rayos X.

Historia

La base conceptual de la nanotecnología del ADN fue establecida por primera vez por Nadrian Seeman a principios de la década de 1980. La motivación original de Seeman fue crear una red de ADN tridimensional para orientar otras moléculas grandes, lo que simplificaría su estudio cristalográfico al eliminar el difícil proceso de obtener cristales puros. Según los informes, esta idea se le ocurrió a fines de 1980, después de darse cuenta de la similitud entre el grabado en madera Profundidad de MC Escher y una serie de uniones de seis brazos de ADN. En ese momento se conocían varias estructuras naturales de ADN ramificado, incluida la horquilla de replicación del ADN y la unión móvil de Holliday, pero la idea de Seeman fue que las uniones de ácido nucleico inmóviles podrían crearse mediante el diseño adecuado de las secuencias de las hebras para eliminar la simetría en la molécula ensamblada, y que estas uniones inmóviles podrían, en principio, combinarse en redes cristalinas rígidas. El primer artículo teórico que proponía este esquema se publicó en 1982 y la primera demostración experimental de una unión de ADN inmóvil se publicó al año siguiente.

En 1991, el laboratorio de Seeman publicó un informe sobre la síntesis de un cubo hecho de ADN, la primera nanoestructura de ácido nucleico tridimensional sintética, por la que recibió el Premio Feynman de Nanotecnología en 1995. Esto fue seguido por un octaedro truncado de ADN. Pronto quedó claro que estas estructuras, formas poligonales con uniones flexibles como vértices, no eran lo suficientemente rígidas para formar redes tridimensionales extendidas. Seeman desarrolló el motivo estructural de doble cruce (DX) más rígido y, en 1998, en colaboración con Erik Winfree, publicó la creación de celosías bidimensionales de mosaicos DX. Estas estructuras basadas en mosaicos tenían la ventaja de que brindaban la capacidad de implementar computación de ADN, lo que fue demostrado por Winfree y Paul Rothemund en su artículo de 2004 sobre el autoensamblaje algorítmico de una estructura de junta de Sierpinski, y para el cual compartieron el Feynman de 2006. Premio en Nanotecnología. La idea clave de Winfree fue que los mosaicos DX podrían usarse como mosaicos Wang, lo que significa que su ensamblaje podría realizar cálculos. Seeman finalmente publicó la síntesis de una red tridimensional en 2009, casi treinta años después de haberse propuesto lograrla.

Se siguieron descubriendo nuevas habilidades para las estructuras de ADN diseñadas a lo largo de la década de 2000. La primera nanomáquina de ADN, un motivo que cambia su estructura en respuesta a una entrada, fue demostrada en 1999 por Seeman. Bernard Yurke demostró al año siguiente un sistema mejorado, que fue el primer dispositivo de ácido nucleico que hizo uso del desplazamiento de hebras mediado por toehold. El siguiente avance fue traducir esto en movimiento mecánico, y en 2004 y 2005, los grupos de Seeman, Niles Pierce, Andrew Turberfield y Chengde Mao demostraron varios sistemas de caminantes de ADN. La idea de usar matrices de ADN para moldear el ensamblaje de otras moléculas como nanopartículas y proteínas, sugerida por primera vez por Bruche Robinson y Seeman en 1987, fue demostrada en 2002 por Seeman, Kiehl et al.y posteriormente por muchos otros grupos.

En 2006, Rothemund demostró por primera vez el método de origami de ADN para formar fácilmente y de forma sólida estructuras de ADN plegadas de forma arbitraria. Rothemund había concebido este método como conceptualmente intermedio entre las redes DX de Seeman, que usaban muchas hebras cortas, y el octaedro de ADN de William Shih, que consistía principalmente en una hebra muy larga. El origami de ADN de Rothemund contiene una hebra larga cuyo plegamiento es asistido por varias hebras cortas. Este método permitió formar estructuras mucho más grandes que antes, y que son técnicamente menos exigentes para diseñar y sintetizar. El origami de ADN fue la historia de portada de Nature el 15 de marzo de 2006. La investigación de Rothemund que demostró estructuras de origami de ADN bidimensional fue seguida por la demostración de origami de ADN tridimensional sólido por parte de Douglas et al. en 2009, mientras que los laboratorios de Jørgen Kjems y Yan demostraron estructuras tridimensionales huecas hechas de caras bidimensionales.

La nanotecnología de ADN se encontró inicialmente con cierto escepticismo debido al uso inusual no biológico de los ácidos nucleicos como materiales para construir estructuras y realizar cálculos, y la preponderancia de los experimentos de prueba de principio que ampliaron las capacidades del campo pero estaban lejos de las aplicaciones reales. El artículo de Seeman de 1991 sobre la síntesis del cubo de ADN fue rechazado por la revista Science después de que un revisor elogiara su originalidad mientras que otro lo criticaba por su falta de relevancia biológica. A principios de la década de 2010, se consideró que el campo había aumentado sus capacidades hasta el punto de que las aplicaciones para la investigación científica básica comenzaban a realizarse y las aplicaciones prácticas en medicina y otros campos comenzaban a considerarse factibles. El campo había crecido de muy pocos laboratorios activos en 2001 a por lo menos 60 en 2010, lo que aumentó el grupo de talentos y, por lo tanto, la cantidad de avances científicos en el campo durante esa década.