Mutagénesis

Mutagénesis () es un proceso por el cual la información genética de un organismo es cambiada por la producción de una mutación. Puede ocurrir espontáneamente en la naturaleza o como resultado de la exposición a mutágenos. También se puede lograr experimentalmente utilizando procedimientos de laboratorio. Un mutágeno es un agente causante de mutaciones, ya sea químico o físico, que da como resultado una mayor tasa de mutaciones en el código genético de un organismo. En la naturaleza, la mutagénesis puede provocar cáncer y diversas enfermedades hereditarias, y también es una fuerza impulsora de la evolución. La mutagénesis como ciencia se desarrolló a partir del trabajo realizado por Hermann Muller, Charlotte Auerbach y J. M. Robson en la primera mitad del siglo XX.

Historia

El ADN puede ser modificado, ya sea de forma natural o artificial, por una serie de agentes físicos, químicos y biológicos, lo que da como resultado mutaciones. Hermann Muller descubrió que las "altas temperaturas" tienen la capacidad de mutar genes a principios de la década de 1920 y, en 1927, demostraron un vínculo causal con la mutación al experimentar con una máquina de rayos X, notando cambios filogenéticos al irradiar moscas de la fruta con una dosis relativamente alta de rayos X. Muller observó una serie de reordenamientos cromosómicos en sus experimentos y sugirió la mutación como causa del cáncer. La asociación de la exposición a la radiación y el cáncer se había observado ya en 1902, seis años después del descubrimiento de los rayos X por Wilhelm Röntgen y el descubrimiento de la radiactividad por Henri Becquerel. Lewis Stadler, contemporáneo de Muller, también mostró el efecto de los rayos X en las mutaciones de la cebada en 1928, y de la radiación ultravioleta (UV) en el maíz en 1936. En la década de 1940, Charlotte Auerbach y J. M. Robson encontraron que el gas mostaza puede también causan mutaciones en moscas de la fruta.

Si bien los primeros investigadores pudieron observar fácilmente los cambios en el cromosoma causados por los rayos X y el gas mostaza, otros cambios en el ADN inducidos por otros mutágenos no fueron tan fáciles de observar; el mecanismo por el cual ocurren puede ser complejo y tomar más tiempo para descifrarlo. Por ejemplo, se sugirió que el hollín era una causa de cáncer ya en 1775, y se demostró que el alquitrán de hulla causaba cáncer en 1915. Más tarde se demostró que los químicos involucrados en ambos eran hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). Los PAH por sí mismos no son cancerígenos, y en 1950 se propuso que las formas cancerígenas de los PAH son los óxidos producidos como metabolitos a partir de procesos celulares. El proceso metabólico fue identificado en la década de 1960 como catálisis por el citocromo P450, que produce especies reactivas que pueden interactuar con el ADN para formar aductos o moléculas producto resultantes de la reacción del ADN y, en este caso, del citocromo P450; sin embargo, el mecanismo por el cual los aductos de PAH dan lugar a la mutación aún está bajo investigación.

Distinción entre una mutación y daño en el ADN

El daño al ADN es una alteración anormal en la estructura del ADN que no puede, por sí misma, replicarse cuando el ADN se replica. Por el contrario, una mutación es un cambio en la secuencia de ácido nucleico que se puede replicar; por lo tanto, una mutación se puede heredar de una generación a la siguiente. El daño puede ocurrir por la adición química (aducto), o la interrupción estructural de una base de ADN (creando un nucleótido anormal o un fragmento de nucleótido), o una ruptura en una o ambas cadenas de ADN. Tal daño en el ADN puede resultar en una mutación. Cuando el ADN que contiene daño se replica, se puede insertar una base incorrecta en la nueva cadena complementaria a medida que se sintetiza (ver Reparación de ADN § Síntesis de translesión). La inserción incorrecta en la cadena nueva ocurrirá frente al sitio dañado en la cadena molde, y esta inserción incorrecta puede convertirse en una mutación (es decir, un par de bases cambiado) en la próxima ronda de replicación. Además, las roturas de doble cadena en el ADN pueden repararse mediante un proceso de reparación impreciso, unión de extremos no homólogos, que produce mutaciones. Por lo general, las mutaciones se pueden evitar si los sistemas de reparación de ADN precisos reconocen el daño en el ADN y lo reparan antes de completar la siguiente ronda de replicación. Al menos 169 enzimas se emplean directamente en la reparación del ADN o influyen en los procesos de reparación del ADN. De estos, 83 se emplean directamente en los 5 tipos de procesos de reparación del ADN indicados en el cuadro que se muestra en el artículo Reparación del ADN.

El ADN nuclear de los mamíferos puede sufrir más de 60 000 episodios de daño por célula por día, como se indica en las referencias sobre daños en el ADN (de origen natural). Si no se corrigen, estos aductos, después de una replicación errónea más allá de los sitios dañados, pueden dar lugar a mutaciones. En la naturaleza, las mutaciones que surgen pueden ser beneficiosas o perjudiciales: esta es la fuerza impulsora de la evolución. Un organismo puede adquirir nuevos rasgos a través de la mutación genética, pero la mutación también puede resultar en una función deteriorada de los genes y, en casos severos, causa la muerte del organismo. La mutación también es una fuente importante para la adquisición de resistencia a los antibióticos en las bacterias y a los agentes antifúngicos en las levaduras y los mohos. En un entorno de laboratorio, la mutagénesis es una técnica útil para generar mutaciones que permite examinar en detalle las funciones de los genes y los productos génicos, produciendo proteínas con características mejoradas o funciones novedosas, así como cepas mutantes con propiedades útiles. Inicialmente, se aprovechó la capacidad de la radiación y los mutágenos químicos para causar mutaciones para generar mutaciones aleatorias, pero posteriormente se desarrollaron técnicas para introducir mutaciones específicas.

En los seres humanos, se transmite un promedio de 60 nuevas mutaciones de padres a hijos. Los machos humanos, sin embargo, tienden a transmitir más mutaciones dependiendo de su edad, transmitiendo un promedio de dos nuevas mutaciones a su progenie con cada año adicional de edad.

Mecanismos

La mutagénesis puede ocurrir de forma endógena (p. ej., hidrólisis espontánea), a través de procesos celulares normales que pueden generar especies reactivas de oxígeno y aductos de ADN, o a través de errores en la replicación y reparación del ADN. La mutagénesis también puede ocurrir como resultado de la presencia de mutágenos ambientales que inducen cambios en el ADN de un organismo. El mecanismo por el que se produce la mutación varía según el mutágeno o el agente causante implicado. La mayoría de los mutágenos actúan directa o indirectamente a través de metabolitos mutagénicos sobre el ADN de un organismo, produciendo lesiones. Sin embargo, algunos mutágenos pueden afectar el mecanismo de replicación o partición cromosómica y otros procesos celulares.

La mutagénesis también puede ser autoinducida por organismos unicelulares cuando las condiciones ambientales son restrictivas para el crecimiento del organismo, como bacterias que crecen en presencia de antibióticos, levaduras que crecen en presencia de un agente antifúngico u otras bacterias unicelulares. organismos que crecen en un ambiente que carece de un nutriente esencial

Muchos mutágenos químicos requieren activación biológica para volverse mutagénicos. Un grupo importante de enzimas involucradas en la generación de metabolitos mutagénicos es el citocromo P450. Otras enzimas que también pueden producir metabolitos mutagénicos incluyen la glutatión S-transferasa y la epóxido hidrolasa microsomal. Los mutágenos que no son mutagénicos por sí mismos pero requieren activación biológica se denominan promutágenos.

Si bien la mayoría de los mutágenos producen efectos que finalmente resultan en errores en la replicación, por ejemplo, creando aductos que interfieren con la replicación, algunos mutágenos pueden afectar directamente el proceso de replicación o reducir su fidelidad. El análogo de base, como el 5-bromouracilo, puede sustituir a la timina en la replicación. Los metales como el cadmio, el cromo y el níquel pueden aumentar la mutagénesis de varias maneras además del daño directo al ADN, por ejemplo, reduciendo la capacidad de reparar errores, así como produciendo cambios epigenéticos.

Las mutaciones a menudo surgen como resultado de problemas causados por lesiones en el ADN durante la replicación, lo que genera errores en la replicación. En las bacterias, el daño extenso al ADN debido a mutágenos da como resultado brechas de ADN monocatenario durante la replicación. Esto induce la respuesta SOS, un proceso de reparación de emergencia que también es propenso a errores, lo que genera mutaciones. En las células de mamíferos, el estancamiento de la replicación en los sitios dañados induce una serie de mecanismos de rescate que ayudan a evitar las lesiones del ADN; sin embargo, esto también puede dar lugar a errores. La familia Y de ADN polimerasas se especializa en la derivación de lesiones de ADN en un proceso denominado síntesis de translesión (TLS) mediante el cual estas polimerasas de derivación de lesiones reemplazan a la polimerasa de ADN replicativa de alta fidelidad estancada, transitan la lesión y extienden el ADN hasta que la lesión ha sido superada. que la replicación normal puede reanudarse; estos procesos pueden ser propensos a errores o libres de errores.

Daño en el ADN y mutación espontánea

La cantidad de episodios de daño en el ADN que ocurren en una célula de mamífero por día es alta (más de 60 000 por día). La ocurrencia frecuente de daño en el ADN es probablemente un problema para todos los organismos que contienen ADN, y la necesidad de hacer frente al daño en el ADN y minimizar sus efectos nocivos es probablemente un problema fundamental para la vida.

La mayoría de las mutaciones espontáneas probablemente surjan de la síntesis trans-lesión propensa a errores más allá de un sitio dañado en el ADN en la hebra molde durante la replicación del ADN. Este proceso puede superar bloqueos potencialmente letales, pero a costa de introducir imprecisiones en el ADN hijo. La relación causal entre el daño del ADN y la mutación espontánea se ilustra mediante el crecimiento aeróbico de E. coli, en la que el 89% de las mutaciones de sustitución de bases que ocurren espontáneamente son causadas por el daño en el ADN inducido por especies reactivas de oxígeno (ROS). En la levadura, más del 60 % de las sustituciones y deleciones espontáneas de un solo par de bases probablemente se deban a la síntesis trans-lesión.

Una fuente importante adicional de mutaciones en eucariotas es el proceso de reparación de ADN impreciso que se une a extremos no homólogos, que a menudo se emplea en la reparación de roturas de doble cadena.

En general, parece que la principal causa subyacente de la mutación espontánea es la síntesis trans-lesión propensa a errores durante la replicación del ADN y que la vía de reparación de unión final no homóloga propensa a errores también puede ser un contribuyente importante en eucariotas.

Hidrólisis espontánea

El ADN no es completamente estable en solución acuosa y puede ocurrir la depuración del ADN. En condiciones fisiológicas, el enlace glucosídico puede hidrolizarse espontáneamente y se estima que 10.000 sitios de purina en el ADN se depuran cada día en una célula. Existen numerosas vías de reparación del ADN para el ADN; sin embargo, si el sitio apurínico no se repara, puede ocurrir una incorporación incorrecta de nucleótidos durante la replicación. La adenina se incorpora preferentemente por las ADN polimerasas en un sitio apurínico.

La citidina también puede desaminarse a uridina a una quinientosima parte de la tasa de depuración y puede resultar en una transición de G a A. Las células eucariotas también contienen 5-metilcitosina, que se cree que está involucrada en el control de la transcripción de genes, que puede convertirse en timina.

Tautomerismo

La tautomerización es el proceso mediante el cual los compuestos se reorganizan espontáneamente para adoptar sus formas de isómeros estructurales. Por ejemplo, las formas ceto (C=O) de guanina y timina pueden reorganizarse en sus raras formas de enol (-OH), mientras que las formas amino (-NH₂) de adenina y citosina pueden resultar en las formas imino (=NH) más raras. En la replicación del ADN, la tautomerización altera los sitios de emparejamiento de bases y puede provocar el emparejamiento inadecuado de bases de ácidos nucleicos.

Modificación de bases

Las bases pueden ser modificadas endógenamente por moléculas celulares normales. Por ejemplo, el ADN puede ser metilado por S-adenosilmetionina, alterando así la expresión del gen marcado sin incurrir en una mutación en la propia secuencia de ADN. La modificación de histonas es un proceso relacionado en el que las proteínas histonas alrededor de las cuales se enrolla el ADN pueden modificarse de manera similar mediante metilación, fosforilación o acetilación; estas modificaciones pueden actuar para alterar la expresión génica del ADN local y también pueden actuar para indicar ubicaciones de ADN dañado que necesitan reparación. El ADN también se puede glicosilar mediante azúcares reductores.

Muchos compuestos, como PAH, aminas aromáticas, aflatoxinas y alcaloides de pirrolizidina, pueden formar especies reactivas de oxígeno catalizadas por el citocromo P450. Estos metabolitos forman aductos con el ADN, lo que puede causar errores en la replicación, y los aductos aromáticos voluminosos pueden formar una intercalación estable entre las bases y bloquear la replicación. Los aductos también pueden inducir cambios conformacionales en el ADN. Algunos aductos también pueden resultar en la depuración del ADN; sin embargo, no está claro cuán significativa es la depuración causada por los aductos en la generación de la mutación.

La alquilación y arilación de bases puede causar errores en la replicación. Algunos agentes alquilantes como las N-nitrosaminas pueden requerir la reacción catalítica del citocromo-P450 para la formación de un catión alquilo reactivo. N⁷ y O⁶ de guanina y N³ y N⁷ de adenina son los más susceptibles al ataque. Los aductos de N⁷-guanina forman la mayor parte de los aductos de ADN, pero parecen no ser mutagénicos. Sin embargo, la alquilación en O⁶ de guanina es perjudicial porque la reparación por escisión del aducto de O⁶ de guanina puede ser deficiente en algunos tejidos, como el cerebro. La metilación de O⁶ de la guanina puede dar como resultado una transición de G a A, mientras que la O⁴-metiltimina puede emparejarse incorrectamente con la guanina. Sin embargo, el tipo de mutación generada puede depender del tamaño y tipo del aducto, así como de la secuencia de ADN.

La radiación ionizante y las especies reactivas de oxígeno a menudo oxidan la guanina para producir 8-oxoguanina.

Arrows indica rupturas cromosómicas debido al daño del ADN

Daño en la columna

La radiación ionizante puede producir radicales libres altamente reactivos que pueden romper los enlaces en el ADN. Las roturas de doble cadena son especialmente dañinas y difíciles de reparar, produciendo translocación y deleción de parte de un cromosoma. Los agentes alquilantes como el gas mostaza también pueden causar roturas en la columna vertebral del ADN. El estrés oxidativo también puede generar especies de oxígeno altamente reactivas que pueden dañar el ADN. La reparación incorrecta de otros daños inducidos por las especies altamente reactivas también puede provocar mutaciones.

Reticulación

Los enlaces covalentes entre las bases de los nucleótidos en el ADN, ya sea en la misma hebra o en hebras opuestas, se denominan entrecruzamiento del ADN; el entrecruzamiento del ADN puede afectar tanto a la replicación como a la transcripción del ADN, y puede ser causado por la exposición a una variedad de agentes. Algunas sustancias químicas naturales también pueden promover la reticulación, como los psoralenos después de la activación por la radiación UV y el ácido nitroso. El entrecruzamiento entre cadenas (entre dos cadenas) causa más daño, ya que bloquea la replicación y la transcripción y puede causar roturas y reordenamientos cromosómicos. Algunos agentes de entrecruzamiento como la ciclofosfamida, la mitomicina C y el cisplatino se usan como quimioterapéuticos contra el cáncer debido a su alto grado de toxicidad para las células en proliferación.

Dimerización

La dimerización consiste en la unión de dos monómeros para formar un oligómero, como la formación de dímeros de pirimidina como resultado de la exposición a la radiación UV, que promueve la formación de un anillo de ciclobutilo entre timinas adyacentes en el ADN. En las células de la piel humana, se pueden formar miles de dímeros en un día debido a la exposición normal a la luz solar. La ADN polimerasa η puede ayudar a evitar estas lesiones sin errores; sin embargo, las personas con una función de reparación del ADN defectuosa, como las que padecen xeroderma pigmentoso, son sensibles a la luz solar y pueden ser propensas al cáncer de piel.

Ethidium intercaló entre dos pares base de adenina-timina.

Clínicamente, si un tumor se ha formado como consecuencia directa de la radiación ultravioleta es discernible a través del análisis de secuenciación de ADN para el patrón de dimerización específico del contexto característico que ocurre debido a la exposición excesiva a la luz solar.

Intercalación entre bases

La estructura plana de sustancias químicas como el bromuro de etidio y la proflavina les permite insertarse entre las bases del ADN. Este inserto hace que la columna vertebral del ADN se estire y hace que sea más probable que ocurra un deslizamiento en el ADN durante la replicación, ya que el estiramiento hace que la unión entre las hebras sea menos estable. El deslizamiento hacia adelante dará como resultado una mutación por eliminación, mientras que el deslizamiento hacia atrás dará como resultado una mutación por inserción. Además, la intercalación en el ADN de antraciclinas como la daunorrubicina y la doxorrubicina interfiere con el funcionamiento de la enzima topoisomerasa II, bloqueando la replicación y provocando la recombinación homóloga mitótica.

Mutagénesis por inserción

Los transposones y los virus o retrotransposones pueden insertar secuencias de ADN en regiones codificantes o elementos funcionales de un gen y provocar la inactivación del gen.

Mecanismos de mutagénesis adaptativa

La mutagénesis adaptativa se ha definido como mecanismos de mutagénesis que permiten a un organismo adaptarse a un estrés ambiental. Dado que la variedad de tensiones ambientales es muy amplia, los mecanismos que lo permiten también son bastante amplios, según ha demostrado la investigación en el campo. Por ejemplo, en bacterias, mientras que se ha demostrado que la modulación de la respuesta SOS y la síntesis de ADN profago endógeno aumentan la resistencia de Acinetobacter baumannii a la ciprofloxacina. Se supone que los mecanismos de resistencia están relacionados con mutaciones cromosómicas intransferibles mediante transferencia horizontal de genes en algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae, como E. coli, Salmonella spp., Klebsiella spp. y Enterobacter spp. Los eventos cromosómicos, especialmente la amplificación de genes, también parecen ser relevantes para esta mutagénesis adaptativa en bacterias.

La investigación en células eucariotas es mucho más escasa, pero los eventos cromosómicos también parecen ser bastante relevantes: mientras que se ha informado que una recombinación intracromosómica ectópica está involucrada en la adquisición de resistencia a la 5-fluorocitosina en Saccharomyces cerevisiae, se ha encontrado que las duplicaciones del genoma confieren resistencia en S. cerevisiae a ambientes pobres en nutrientes.

Aplicaciones de laboratorio

En el laboratorio, la mutagénesis es una técnica mediante la cual las mutaciones del ADN se modifican deliberadamente para producir genes, proteínas o cepas de organismos mutantes. Varios constituyentes de un gen, como sus elementos de control y su producto génico, pueden mutarse para que la función de un gen o proteína pueda examinarse en detalle. La mutación también puede producir proteínas mutantes con propiedades alteradas o funciones mejoradas o novedosas que pueden resultar de utilidad comercial. También se pueden producir cepas mutantes de organismos que tienen aplicaciones prácticas o permiten investigar la base molecular de una función celular particular.

Los primeros métodos de mutagénesis producían mutaciones completamente aleatorias; sin embargo, los métodos modernos de mutagénesis son capaces de producir mutaciones específicas del sitio. Las modernas técnicas de laboratorio utilizadas para generar estas mutaciones incluyen:

• mutagenesis dirigida
• mutagenesis/ PCR dirigida por el sitio
• mutagénesis insercional
• Firma etiquetada mutagenesis
• Transposon mutagenesis
• mutagénesis de la saturación de secuencias