Micrótomo

Un micrótomo (del griego mikros, que significa "pequeño", y temnein, que significa " cortar") es una herramienta de corte que se utiliza para producir rodajas extremadamente finas de material conocidas como secciones, y el proceso se denomina microsección. Importantes en la ciencia, los microtomos se utilizan en microscopía para la preparación de muestras para su observación bajo luz transmitida o radiación electrónica.

Los microtomos utilizan hojas de acero, vidrio o diamante dependiendo de la muestra que se corta y del grosor deseado de las secciones que se cortan. Se utilizan hojas de acero para preparar secciones histológicas de tejidos animales o vegetales para microscopía óptica. Los cuchillos de vidrio se utilizan para cortar secciones para microscopía óptica y para cortar secciones muy delgadas para microscopía electrónica. Los cuchillos de diamante de calidad industrial se utilizan para cortar materiales duros como huesos, dientes y materia vegetal resistente tanto para microscopía óptica como para microscopía electrónica. Los cuchillos de diamante con calidad de gema también se utilizan para cortar secciones delgadas para microscopía electrónica.

La microtomía es un método para la preparación de secciones delgadas para materiales como huesos, minerales y dientes, y una alternativa al electropulido y la molienda de iones. Las secciones del microtomo se pueden hacer lo suficientemente delgadas como para seccionar un cabello humano a lo ancho, con un espesor de sección de entre 50 nm y 100 μm.

Historia

En los inicios del desarrollo del microscopio óptico, las secciones de plantas y animales se preparaban manualmente utilizando hojas de afeitar. Se descubrió que para observar la estructura del espécimen bajo observación era importante realizar cortes limpios y reproducibles del orden de 100 μm, a través de los cuales se puede transmitir la luz. Esto permitió la observación de muestras utilizando microscopios ópticos en modo de transmisión.

Uno de los primeros dispositivos para la preparación de tales cortes fue inventado en 1770 por George Adams, Jr. (1750-1795) y desarrollado posteriormente por Alexander Cummings. El dispositivo fue operado manualmente y la muestra se mantuvo en un cilindro y se crearon secciones desde la parte superior de la muestra usando una manivela.

En 1835, Andrew Prichard desarrolló un modelo basado en una mesa que permitía aislar la vibración fijando el dispositivo a la mesa, separando al operador del cuchillo.

Ocasionalmente, la atribución de la invención del microtomo se atribuye al anatomista Wilhelm His, Sr. (1865). En su Beschreibung eines Mikrotoms (Descripción de un microtomo en alemán), Wilhelm escribió :

El aparato ha permitido una precisión en el trabajo mediante la cual puedo lograr secciones que a mano no puedo crear. Es decir, ha permitido la posibilidad de lograr secciones no rotas de objetos en el curso de la investigación.

Otras fuentes atribuyen además el desarrollo al fisiólogo checo Jan Evangelista Purkyně. Varias fuentes describen el modelo de Purkyne como el primero en uso práctico.

La oscuridad en los orígenes del microtomo se debe al hecho de que los primeros microtomos eran simplemente aparatos de corte, y la fase de desarrollo de los primeros dispositivos está ampliamente indocumentada.

A finales del siglo XIX, el desarrollo de muestras muy delgadas y consistentemente delgadas mediante microtomía, junto con la tinción selectiva de importantes componentes celulares o moléculas, permitió la visualización de detalles microscópicos.

Hoy en día, la mayoría de los microtomes son un diseño de bloqueo de cuchillo con un cuchillo cambiante, un soporte de especímenes y un mecanismo de avance. En la mayoría de los dispositivos el corte de la muestra comienza moviendo la muestra sobre el cuchillo, donde el mecanismo de avance se mueve automáticamente de tal manera que el siguiente corte para un espesor elegido se puede hacer. El espesor de la sección está controlado por un mecanismo de ajuste, permitiendo un control preciso.

Aplicaciones

Las aplicaciones más comunes de los micrótomos son:

• Técnica de Histología Tradicional: los tejidos son fijos, deshidratados, despejados e incrustados en parafina fundida, que cuando se enfría forma un bloque sólido. El tejido se corta luego en el microtomo a espesores que varían de 2 a 50 μm. Desde allí el tejido se puede montar en una diapositiva de microscopio, manchada con tinte acuoso adecuado después de la eliminación del parafina, y examinada mediante un microscopio ligero.
• Procedimiento de sección congelado: los tejidos ricos en agua se endurecen por congelación y cortan en el estado congelado con un microtome congelante o microtome-cryostat; las secciones se manchan y examinan con un microscopio ligero. Esta técnica es mucho más rápida que la histología tradicional (5 minutos vs 16 horas) y se utiliza junto con procedimientos médicos para lograr un diagnóstico rápido. Las criptoecciones también se pueden utilizar en la inmunohistoquímica ya que el tejido congelado detiene la degradación del tejido más rápido que el uso de un fijador y no altera ni enmascara su composición química tanto.
• Microscopia de electrones Técnica: después de incrustar tejidos en resina epoxi, se utiliza un microtome equipado con un cuchillo de diamante de grado de vidrio o gema para cortar secciones muy finas (típicamente 60 a 100 nanómetros). Las secciones se manchan con una solución acuosa de una sal de metal pesado adecuada y se examinan con un microscopio electrónico de transmisión. Este instrumento se llama a menudo ultramicrotome. El ultramicrotome también se utiliza con su cuchillo de vidrio o un cuchillo de diamante de grado industrial para cortar secciones de encuesta antes de la sección delgada. Estas secciones de la encuesta son generalmente de 0,5 a 1 μm de espesor y se montan en una diapositiva de vidrio y se manchan para localizar áreas de interés bajo un microscopio ligero antes de la sección delgada para el TEM. El corte grueso para el TEM se hace a menudo con un cuchillo de diamante de calidad de gema. Las técnicas tradicionales TEM ultramicrotomes se encuentran cada vez más montadas dentro de una cámara SEM para que la superficie de la cara del bloque pueda ser imagenada y luego removida con el microtome para descubrir la siguiente superficie para la imagen. Esta técnica se llama microscopía de escaneo de cara de bloque serie (SBFSEM).
• Microtomía Botánica Técnica: materiales duros como la madera, el hueso y el cuero requieren un microtomo de cornisa. Estos microtomos tienen cuchillas más pesadas y no pueden cortar tan delgada como un microtomo regular.
• Espectroscopia (especialmente FTIR o espectroscopia infrarroja) Técnica: se necesitan secciones de polímero fino para que el haz infrarrojo pueda penetrar la muestra bajo examen. Es normal cortar muestras a entre 20 y 100 μm de espesor. Para un análisis más detallado de áreas mucho más pequeñas en una sección delgada, se puede utilizar microscopía FTIR para la inspección de muestras.

Un desarrollo reciente es el microtome láser, que corta el espécimen objetivo con un láser femtosecond en lugar de un cuchillo mecánico. Este método es libre de contacto y no requiere técnicas de preparación de muestras. El microtomo láser tiene la capacidad de cortar casi todos los tejidos en su estado nativo. Dependiendo del material que se procesa, los espesores de rodajas de 10 a 100 μm son factibles.

Los intervalos de seccionamiento se pueden clasificar principalmente en:

• Seccionamiento de serie: obtener una cinta continua de secciones de un bloque de parafina y utilizar todo para diapositivas.
• Secciones de paso: recogidas en profundidades especificadas en el bloque.

Tipos

Trineo

Un micrótomo de trineo es un dispositivo en el que la muestra se coloca en un soporte fijo (lanzadera), que luego se mueve hacia adelante y hacia atrás a través de un cuchillo. Los micrótomos de trineo modernos tienen el trineo colocado sobre un cojinete lineal, un diseño que permite al microtomo cortar fácilmente muchas secciones gruesas. Al ajustar los ángulos entre la muestra y la cuchilla del microtomo, se puede reducir la presión aplicada a la muestra durante el corte. Las aplicaciones típicas de este diseño de microtomo son la preparación de muestras grandes, como las incluidas en parafina para preparaciones biológicas. El espesor de corte típico que se puede lograr en un micrótomo de trineo es de entre 1 y 60 μm.

Rotativo

Este instrumento es un diseño de microtomo común. Este dispositivo funciona con una acción giratoria por etapas de modo que el corte real sea parte del movimiento giratorio. En un microtomo rotatorio, la cuchilla normalmente se fija en posición vertical.

En la figura de la izquierda se explica el principio del corte. Mediante el movimiento del portamuestras, la muestra se corta con la cuchilla de la posición 1 a la posición 2, momento en el que la sección fresca permanece en la cuchilla. En el punto más alto del movimiento giratorio, el portamuestras avanza con el mismo espesor que la sección que se va a realizar, permitiendo realizar la siguiente sección.

El volante de muchos micrótomos se puede operar manualmente. Esto tiene la ventaja de que se puede realizar un corte limpio, ya que la masa relativamente grande del volante evita que la muestra se detenga durante el corte de la muestra. El volante en los modelos más nuevos suele estar integrado dentro de la carcasa del microtomo. El espesor de corte típico de un micrótomo rotatorio está entre 1 y 60 µm. Para materiales duros, como una muestra incrustada en una resina sintética, este diseño de microtomo puede permitir una buena muestra "semifina" Secciones con un espesor de tan solo 0,5 μm.

Criomicrotomo

Para cortar muestras congeladas, muchos micrótomos rotatorios se pueden adaptar para cortar en una cámara de nitrógeno líquido, en una configuración denominada criomicrotomo. La temperatura reducida permite aumentar la dureza de la muestra, por ejemplo sometiéndola a una transición vítrea, que permite la preparación de muestras semifinas. Sin embargo, la temperatura de la muestra y la temperatura de la cuchilla deben controlarse para optimizar el espesor de la muestra resultante.

Ultramicrotomo

Un ultramicrotomo es una herramienta principal de la ultramicrotomía. Permite la preparación de secciones extremadamente delgadas, funcionando el dispositivo de la misma manera que un micrótomo rotacional, pero con tolerancias muy estrictas en la construcción mecánica. Como resultado de la cuidadosa construcción mecánica, la expansión térmica lineal del soporte se utiliza para proporcionar un control muy fino del espesor.

Estos cortes extremadamente finos son importantes para su uso con el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBFSEM) y, a veces, también son importantes para la microscopía óptica óptica. El espesor típico de estos cortes está entre 40 y 100 nm para microscopía electrónica de transmisión y, a menudo, entre 30 y 50 nm para SBFSEM. También se toman secciones más gruesas de hasta 500 nm para aplicaciones TEM especializadas o para secciones de estudio de microscopía óptica para seleccionar un área para las secciones delgadas finales. Con los ultramicrótomos se utilizan cuchillas de diamante (preferiblemente) y cuchillas de vidrio. Para recolectar las secciones, se hacen flotar sobre un líquido a medida que se cortan y se recogen con cuidado sobre rejillas adecuadas para la visualización de muestras TEM. El espesor de la sección se puede estimar mediante los colores de interferencia de la luz reflejada en películas delgadas que se ven debido al espesor extremadamente pequeño de la muestra.

Vibrando

El micrótomo vibratorio funciona cortando usando una cuchilla vibratoria, lo que permite que el corte resultante se realice con menos presión de la que se requeriría para una cuchilla estacionaria. El microtomo vibratorio se utiliza habitualmente para muestras biológicas difíciles. El espesor del corte suele ser de 30 a 500 μm para tejido vivo y de 10 a 500 μm para tejido fijo.

Una variación del microtomo vibratorio es el microtomo Compresstome. El Compresstome utiliza una jeringa para muestras o una jeringa con forma de lápiz labial. tubo para sujetar el tejido. La muestra de tejido se incrusta completamente en agarosa (un polisacárido) y el tejido se presiona lenta y suavemente fuera del tubo para que la cuchilla vibratoria lo corte. El dispositivo funciona de la siguiente manera: el extremo del tubo de muestra por donde emerge el tejido es ligeramente más estrecho que el extremo de carga, lo que permite una suave "compresión" del tejido a medida que sale del tubo. La ligera compresión evita que se formen artefactos de cizallamiento, corte desigual y vibración. Tenga en cuenta que la tecnología de compresión no daña ni afecta el tejido que se está seccionando.

El microtomo Compresstome tiene varias ventajas: 1) la inclusión en agarosa proporciona estabilidad a toda la muestra en todos los lados, lo que evita el corte o corte desigual del tejido; 2) la tecnología de compresión comprime suavemente el tejido para lograr un corte uniforme, de modo que la cuchilla no empuje el tejido; 3) seccionamiento más rápido que la mayoría de los micrótomos vibratorios; y 4) corta bien el tejido de animales más viejos o maduros para proporcionar tejidos más sanos.

Sierra

El micrótomo de sierra es especial para materiales duros como dientes o huesos. El micrótomo de este tipo dispone de una sierra giratoria empotrada que corta la muestra. El espesor de corte mínimo es de aproximadamente 30 μm y puede realizarse para muestras comparativamente grandes.

Láser

El microtomo láser es un instrumento para cortar sin contacto. No se requiere preparación previa de la muestra mediante inclusión, congelación o fijación química, lo que minimiza los artefactos de los métodos de preparación. Alternativamente, este diseño de microtomo también se puede utilizar para materiales muy duros, como huesos o dientes, así como algunas cerámicas. Dependiendo de las propiedades del material de muestra, el espesor alcanzable se sitúa entre 10 y 100 µm.

El dispositivo funciona mediante la acción de corte de un láser infrarrojo. Como el láser emite radiación en el infrarrojo cercano, en este régimen de longitud de onda el láser puede interactuar con materiales biológicos. Mediante un enfoque nítido de la sonda dentro de la muestra, se puede lograr un punto focal de muy alta intensidad, hasta TW/cm². Mediante la interacción no lineal de la penetración óptica en la región focal se produce una separación de materiales en un proceso conocido como fotodisrupción. Al limitar la duración del pulso láser al rango de femtosegundos, la energía gastada en la región objetivo se controla con precisión, limitando así la zona de interacción del corte a menos de un micrómetro. Fuera de esta zona, el tiempo de aplicación del haz ultracorto introduce un daño térmico mínimo o nulo al resto de la muestra.

La radiación láser se dirige a un sistema óptico basado en espejos de escaneo rápido, que permite el posicionamiento tridimensional del cruce del haz, al tiempo que permite el recorrido del haz hasta la región de interés deseada. La combinación de alta potencia con una alta velocidad de trama permite que el escáner corte grandes áreas de muestra en poco tiempo. En el microtomo láser también es posible la microdisección láser de áreas internas de tejidos, estructuras celulares y otros tipos de pequeñas características.

Cuchillos

La selección del perfil de la hoja de la cuchilla del micrótomo depende del material y la preparación de las muestras, así como de los requisitos finales de la muestra (por ejemplo, espesor y calidad del corte).

Diseño y tipos de corte

Generalmente, los cuchillos se caracterizan por el perfil de la hoja, que se clasifica en las categorías de diseños planos cóncavos, en forma de cuña o en forma de cincel.

Las cuchillas planas cóncavas del microtomo son extremadamente afiladas, pero también muy delicadas y, por lo tanto, solo se utilizan con muestras muy blandas. Las cuchillas de perfil en cuña son algo más estables y se utilizan en materiales moderadamente duros, como en el corte de muestras criogénicas o epoxi. Finalmente, el perfil de cincel con su borde romo aumenta la estabilidad del cuchillo, al tiempo que requiere mucha más fuerza para realizar el corte.

Para los ultramicrótomos se necesitan cuchillas de vidrio y diamante, por lo que la anchura de corte de la hoja es del orden de unos pocos milímetros y, por lo tanto, es significativamente más pequeña que para las cuchillas de micrótomo clásicas. Los cuchillos de vidrio generalmente se fabrican rompiendo barras de vidrio utilizando herramientas especiales de "fabricante de cuchillos" dispositivos de fractura. Se pueden utilizar cuchillas de vidrio para la preparación inicial de muestras incluso cuando se pueden utilizar cuchillas de diamante para el corte final. Los cuchillos de vidrio suelen tener pequeños canales, hechos con cinta plástica, que se llenan de agua para permitir que la muestra flote para su posterior recolección. Se pueden incorporar discos de diamante en dicho canal existente, permitiendo el mismo método de recolección.

Seccionamiento

Antes del corte con micrótomo, los materiales biológicos generalmente se colocan en un fijador más rígido, en un proceso conocido como incrustación. Esto se logra mediante la entrada de una sustancia líquida alrededor de la muestra, como parafina (cera) o epoxi, que se coloca en un molde y luego se endurece para producir un "bloque" que se corta fácilmente.

La declinación es el ángulo de contacto entre la muestra vertical y la hoja del cuchillo. Si la hoja del cuchillo está en ángulo recto (declinación = 90), el corte se realiza directamente usando un modo basado en presión y, por lo tanto, las fuerzas son proporcionalmente mayores. Sin embargo, si la cuchilla está inclinada, el movimiento relativo de la misma es cada vez más paralelo al movimiento de la muestra, lo que permite una acción de corte. Este comportamiento es muy importante para muestras grandes o duras.

La inclinación de la cuchilla es el ángulo entre la cara de la cuchilla y la muestra. Para un resultado óptimo, este ángulo debe elegirse adecuadamente. El ángulo óptimo depende de la geometría de la cuchilla, la velocidad de corte y muchos otros parámetros. Si el ángulo se ajusta a cero, el corte de la cuchilla a menudo puede volverse errático y se debe utilizar una nueva ubicación de la cuchilla para suavizarlo.

Si el ángulo es demasiado grande, la muestra puede arrugarse y la cuchilla puede provocar variaciones periódicas de espesor en el corte. Si se aumenta aún más el ángulo hasta que sea demasiado grande, se puede dañar la propia hoja del cuchillo.

Disponibilidad comercial del dispositivo

Muchas empresas producen dispositivos de microtomo con fines comerciales.

Micrótomo rotatorio

Los micrótomos rotativos se utilizan ampliamente en laboratorios y aplicaciones de histología para el corte preciso de muestras biológicas. Pocos fabricantes reconocidos por su producción de microtomos rotativos.

Leica Microsystems

Leica Microsystems es una empresa conocida por producir equipos de laboratorio. Ofrecen una gama de microtomes rotativos diseñados para la sección consistente y delgada de especímenes biológicos.

Instrumentos de precisión

Instrumentos Precisionarios especializados en soluciones de sección de tejidos, incluyendo microtomos rotativos. Sus microtomes son reconocidos por su diseño innovador y la capacidad de entregar secciones precisas y uniformes de muestras de tejido.