Microscopio optico

Los científicos usan microscopios ópticos para examinar células crecientes

El microscopio óptico, también conocido como microscopio de luz, es un tipo de microscopio que normalmente utiliza luz visible y un sistema de lentes para generar imágenes ampliadas de pequeños objetos. Los microscopios ópticos son el diseño de microscopio más antiguo y posiblemente se inventaron en su forma compuesta actual en el siglo XVII. Los microscopios ópticos básicos pueden ser muy simples, aunque muchos diseños complejos tienen como objetivo mejorar la resolución y el contraste de la muestra.

El objeto se coloca en un plato y se puede ver directamente a través de uno o dos oculares en el microscopio. En los microscopios de alta potencia, ambos oculares suelen mostrar la misma imagen, pero con un microscopio estereoscópico se utilizan imágenes ligeramente diferentes para crear un efecto tridimensional. Normalmente se utiliza una cámara para capturar la imagen (micrografía).

La muestra se puede iluminar de varias maneras. Los objetos transparentes se pueden iluminar desde abajo y los objetos sólidos se pueden iluminar con luz que entra (campo brillante) o alrededor (campo oscuro) de la lente del objetivo. La luz polarizada se puede utilizar para determinar la orientación del cristal de objetos metálicos. Las imágenes de contraste de fase se pueden utilizar para aumentar el contraste de la imagen al resaltar pequeños detalles de diferentes índices de refracción.

Por lo general, se proporciona una variedad de lentes de objetivo con diferentes aumentos montados en una torreta, lo que les permite rotarlos en su lugar y brindar la capacidad de acercar. El poder de aumento máximo de los microscopios ópticos generalmente se limita a alrededor de 1000x debido al poder de resolución limitado de la luz visible. Si bien son posibles ampliaciones mayores, no se resuelven detalles adicionales del objeto.

Las alternativas a la microscopía óptica que no utilizan luz visible incluyen la microscopía electrónica de barrido, la microscopía electrónica de transmisión y la microscopía de sonda de barrido y, como resultado, pueden lograr aumentos mucho mayores.

Tipos

Diagrama de un microscopio simple

Hay dos tipos básicos de microscopios ópticos: microscopios simples y microscopios compuestos. Un microscopio simple utiliza la potencia óptica de una sola lente o un grupo de lentes para la ampliación. Un microscopio compuesto utiliza un sistema de lentes (un juego que amplía la imagen producida por otro) para lograr un aumento mucho mayor de un objeto. La gran mayoría de los microscopios de investigación modernos son microscopios compuestos, mientras que algunos microscopios digitales comerciales más económicos son microscopios simples de lente única. Los microscopios compuestos se pueden dividir además en una variedad de otros tipos de microscopios que difieren en sus configuraciones ópticas, costo y propósitos previstos.

Microscopio sencillo

Un microscopio simple utiliza una lente o un conjunto de lentes para agrandar un objeto solo mediante el aumento angular, lo que brinda al observador una imagen virtual ampliada erecta. El uso de una sola lente convexa o grupos de lentes se encuentra en dispositivos de aumento simples como lupas, lupas y oculares para telescopios y microscopios.

Microscopio compuesto

Diagrama de un microscopio compuesto

Un microscopio compuesto usa una lente cerca del objeto que se está viendo para recolectar luz (llamada lente objetivo) que enfoca una imagen real del objeto dentro del microscopio (imagen 1). Luego, esa imagen se amplía con una segunda lente o grupo de lentes (llamada ocular) que le brinda al observador una imagen virtual invertida ampliada del objeto (imagen 2). El uso de una combinación de objetivo/ocular compuesto permite un aumento mucho mayor. Los microscopios compuestos comunes a menudo cuentan con lentes de objetivo intercambiables, lo que permite al usuario ajustar rápidamente la ampliación. Un microscopio compuesto también permite configuraciones de iluminación más avanzadas, como el contraste de fase.

Otras variantes de microscopio

Existen muchas variantes del diseño del microscopio óptico compuesto para fines especializados. Algunas de estas son diferencias de diseño físico que permiten la especialización para ciertos propósitos:

• Microscopio estereo, un microscopio de baja potencia que proporciona una vista estereoscópica de la muestra, comúnmente utilizada para la disección.
• Microscopio de comparación, que tiene dos vías de luz separadas que permiten la comparación directa de dos muestras a través de una imagen en cada ojo.
• Microscopio invertido, para estudiar muestras de abajo; útil para cultivos celulares en líquido, o para metalografía.
• Microscopio de inspección del conector óptico de fibra, diseñado para la inspección de la cara final del conector
• Microscopio de viaje, para estudiar muestras de alta resolución óptica.

Otras variantes de microscopio están diseñadas para diferentes técnicas de iluminación:

• Microscopio Petrográfico, cuyo diseño generalmente incluye un filtro polarizador, estadio giratorio y placa de yeso para facilitar el estudio de minerales u otros materiales cristalinos cuyas propiedades ópticas pueden variar con orientación.
• Microscopio polarizado, similar al microscopio petrónico.
• Microscopio de contraste de fase, que aplica el método de iluminación de contraste de fase.
• Microscopio de epifluorescencia, diseñado para el análisis de muestras que incluyen fluoróforos.
• Microscopio confocal, una variante ampliamente utilizada de iluminación epifluorescente que utiliza un láser de escaneo para iluminar una muestra para fluorescencia.
• Microscopio de dos fotones, utilizado para la imagen de fluorescencia más profunda en los medios de dispersión y reducir el fotobleaching, especialmente en las muestras vivientes.
• Microscopio estudiantil – un microscopio a menudo de baja potencia con controles simplificados y a veces óptica de baja calidad diseñada para el uso escolar o como instrumento de arranque para niños.
• Ultramicroscopio, un microscopio de luz adaptado que utiliza la dispersión de la luz para permitir la visualización de pequeñas partículas cuyo diámetro está por debajo o cerca de la longitud de onda de la luz visible (unos 500 nanometros); en su mayoría obsoletos desde el advenimiento de microscopios electrones
• El microscopio Raman mejorado por las propinas, es una variante del microscopio óptico basada en la espectroscopia Raman mejorada por las propinas, sin límites tradicionales de resolución basados en longitud de onda. Este microscopio se realizó principalmente en las plataformas de microscopio de procesamiento de escaneo utilizando todas las herramientas ópticas.

Microscopio digital

Un microscopio USB miniatura.

Un microscopio digital es un microscopio equipado con una cámara digital que permite la observación de una muestra a través de una computadora. Los microscopios también pueden estar parcial o totalmente controlados por computadora con varios niveles de automatización. La microscopía digital permite un mayor análisis de una imagen microscópica, por ejemplo, mediciones de distancias y áreas y cuantificación de una tinción fluorescente o histológica.

Los microscopios digitales de baja potencia, microscopios USB, también están disponibles comercialmente. Básicamente, se trata de cámaras web con una lente macro de alta potencia y, por lo general, no utilizan transiluminación. La cámara se conecta directamente al puerto USB de una computadora para que las imágenes se muestren directamente en el monitor. Ofrecen aumentos modestos (hasta unos 200×) sin necesidad de usar oculares y a un costo muy bajo. La iluminación de alta potencia generalmente la proporciona una fuente o fuentes LED adyacentes a la lente de la cámara.

La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar daños en muestras biológicas vulnerables está disponible mediante cámaras digitales sensibles de conteo de fotones. Se ha demostrado que una fuente de luz que proporciona pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de daño a las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de imágenes fantasma a la microscopía de fotones dispersos, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno de los cuales se correlaciona espacialmente con un compañero entrelazado en la banda visible para obtener imágenes eficientes con una cámara de conteo de fotones.

Historia

Invención

Los primeros microscopios eran lupas de una sola lente con aumento limitado que se remontan al menos al uso generalizado de lentes en los anteojos en el siglo XIII.

Los microscopios compuestos aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620, incluido uno demostrado por Cornelis Drebbel en Londres (alrededor de 1621) y uno exhibido en Roma en 1624.

Se desconoce el verdadero inventor del microscopio compuesto, aunque se han hecho muchas afirmaciones a lo largo de los años. Estos incluyen una afirmación 35 años después de que apareciera el fabricante de anteojos holandés Johannes Zachariassen de que su padre, Zacharias Janssen, inventó el microscopio compuesto y/o el telescopio ya en 1590. Johannes' El testimonio, que algunos afirman es dudoso, retrasa tanto la fecha de la invención que Zacharias habría sido un niño en ese momento, lo que lleva a la especulación de que, para Johannes' afirmar ser cierto, el microscopio compuesto tendría que haber sido inventado por Johannes' abuelo, Hans Martens. Otra afirmación es que el competidor de Janssen, Hans Lippershey (quien solicitó la patente del primer telescopio en 1608) también inventó el microscopio compuesto. Otros historiadores señalan al innovador holandés Cornelis Drebbel con su microscopio compuesto de 1621.

A veces también se cita a Galileo Galilei como inventor del microscopio compuesto. Después de 1610, descubrió que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños, como moscas, de cerca y/o podía mirar a través del extremo equivocado en reversa para ampliar objetos pequeños. El único inconveniente fue que su telescopio de 2 pies de largo tuvo que extenderse a 6 pies para ver objetos tan cerca. Después de ver el microscopio compuesto construido por Drebbel exhibido en Roma en 1624, Galileo construyó su propia versión mejorada. En 1625, Giovanni Faber acuñó el nombre de microscopio para el microscopio compuesto que Galileo presentó a la Accademia dei Lincei en 1624 (Galileo lo había llamado "occhiolino" o "ojo pequeño"). Faber acuñó el nombre de las palabras griegas μικρόν (micron) que significa "pequeño" y σκοπεῖν (skopein) que significa "mirar". 34;, nombre que pretende ser análogo a "telescopio", otra palabra acuñada por los linceanos.

Christiaan Huygens, otro holandés, desarrolló un sistema ocular simple de 2 lentes a fines del siglo XVII que se corrigió acromáticamente y, por lo tanto, fue un gran paso adelante en el desarrollo de microscopios. El ocular Huygens todavía se produce hasta el día de hoy, pero tiene un tamaño de campo pequeño y otras desventajas menores.

Popularización

La imagen publicada más antigua se ha hecho con un microscopio: abejas de Francesco Stelluti, 1630

A Antonio van Leeuwenhoek (1632-1724) se le atribuye haber llamado la atención de los biólogos sobre el microscopio, a pesar de que ya se producían lentes de aumento simples en el siglo XVI. Los microscopios caseros de Van Leeuwenhoek eran microscopios simples, con una sola lente muy pequeña pero resistente. Eran incómodos de usar, pero permitieron a van Leeuwenhoek ver imágenes detalladas. Se necesitaron alrededor de 150 años de desarrollo óptico antes de que el microscopio compuesto pudiera proporcionar la misma calidad de imagen que los microscopios simples de van Leeuwenhoek, debido a las dificultades para configurar lentes múltiples. En la década de 1850, John Leonard Riddell, profesor de química en la Universidad de Tulane, inventó el primer microscopio binocular práctico mientras realizaba una de las primeras y más extensas investigaciones microscópicas estadounidenses sobre el cólera.

Técnicas de iluminación

Si bien la tecnología y la óptica básicas del microscopio han estado disponibles durante más de 400 años, es mucho más reciente que se desarrollaron técnicas de iluminación de muestras para generar las imágenes de alta calidad que se ven hoy en día.

En agosto de 1893, August Köhler desarrolló la iluminación Köhler. Este método de iluminación de muestras da lugar a una iluminación extremadamente uniforme y supera muchas limitaciones de las técnicas más antiguas de iluminación de muestras. Antes del desarrollo de la iluminación de Köhler, la imagen de la fuente de luz, por ejemplo, el filamento de una bombilla, siempre era visible en la imagen de la muestra.

El Premio Nobel de física se otorgó al físico holandés Frits Zernike en 1953 por su desarrollo de la iluminación de contraste de fase que permite obtener imágenes de muestras transparentes. Mediante el uso de la interferencia en lugar de la absorción de la luz, se pueden obtener imágenes de muestras extremadamente transparentes, como células vivas de mamíferos, sin tener que utilizar técnicas de tinción. Solo dos años después, en 1955, Georges Nomarski publicó la teoría de la microscopía de contraste de interferencia diferencial, otra técnica de imagen basada en la interferencia.

Microscopía de fluorescencia

La microscopía biológica moderna depende en gran medida del desarrollo de sondas fluorescentes para estructuras específicas dentro de una célula. A diferencia de la microscopía de luz transiluminada normal, en la microscopía de fluorescencia, la muestra se ilumina a través de la lente del objetivo con un conjunto estrecho de longitudes de onda de luz. Esta luz interactúa con los fluoróforos en la muestra que luego emiten luz de una longitud de onda más larga. Es esta luz emitida la que constituye la imagen.

Desde mediados del siglo XX, las tinciones fluorescentes químicas, como DAPI, que se une al ADN, se han utilizado para marcar estructuras específicas dentro de la célula. Los desarrollos más recientes incluyen la inmunofluorescencia, que utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia para reconocer proteínas específicas dentro de una muestra, y proteínas fluorescentes como GFP que una célula viva puede expresar haciéndola fluorescente.

Componentes

Elementos básicos del microscopio óptico de transmisión (1990)

Todos los microscopios ópticos modernos diseñados para observar muestras mediante luz transmitida comparten los mismos componentes básicos de la trayectoria de la luz. Además, la gran mayoría de los microscopios tienen las mismas características 'estructurales' componentes (numerados a continuación según la imagen de la derecha):

• Ojo (objetivo ocular) 1)
• Turret objetivo, revólver o pieza de la nariz giratoria (para mantener múltiples objetivos) (2)
• Objetivos (3)
• Cuchillos de enfoque (para mover el escenario)
  • Ajuste grueso (4)
  • Ajuste fino (5)
• Etapa (para mantener el espécimen) (6)
• Fuente de luz (una luz o un espejo) (7)
• Diafragma y condensador (8)
• Etapa mecánica (9)

Ocular (lente ocular)

El ocular, o lente ocular, es un cilindro que contiene dos o más lentes; su función es enfocar la imagen para el ojo. El ocular se inserta en el extremo superior del tubo del cuerpo. Los oculares son intercambiables y se pueden insertar muchos oculares diferentes con diferentes grados de aumento. Los valores de aumento típicos para los oculares incluyen 5×, 10× (los más comunes), 15× y 20×. En algunos microscopios de alto rendimiento, la configuración óptica de la lente del objetivo y el ocular se combinan para ofrecer el mejor rendimiento óptico posible. Esto ocurre más comúnmente con objetivos apocromáticos.

Torreta de objetivo (revólver o punta giratoria)

La torreta del objetivo, revólver o punta giratoria es la parte que sostiene el juego de lentes del objetivo. Permite al usuario cambiar entre lentes objetivo.

Lente objetivo

En el extremo inferior de un microscopio óptico compuesto típico, hay uno o más objetivos que recogen la luz de la muestra. El objetivo suele estar en una carcasa cilíndrica que contiene una lente compuesta de vidrio de uno o varios elementos. Por lo general, habrá alrededor de tres lentes de objetivo atornilladas en una pieza nasal circular que se puede girar para seleccionar la lente de objetivo requerida. Estos arreglos están diseñados para ser parafocales, lo que significa que cuando uno cambia de una lente a otra en un microscopio, la muestra permanece enfocada. Los objetivos del microscopio se caracterizan por dos parámetros, a saber, aumento y apertura numérica. El primero suele oscilar entre 5× y 100×, mientras que el último oscila entre 0,14 y 0,7, lo que corresponde a distancias focales de aproximadamente 40 a 2 mm, respectivamente. Las lentes objetivas con aumentos más altos normalmente tienen una apertura numérica más alta y una profundidad de campo más corta en la imagen resultante. Algunas lentes de objetivo de alto rendimiento pueden requerir oculares a juego para ofrecer el mejor rendimiento óptico.

Objetivo de inmersión en aceite

Dos lentes objetivos del microscopio de inmersión de aceite de Leica: 100× (izquierda) y 40× (derecha)

Algunos microscopios utilizan objetivos de inmersión en aceite o en agua para obtener una mayor resolución con grandes aumentos. Estos se utilizan con material de comparación de índices, como aceite de inmersión o agua, y un cubreobjetos coincidente entre la lente del objetivo y la muestra. El índice de refracción del material de coincidencia de índice es más alto que el del aire, lo que permite que la lente del objetivo tenga una apertura numérica mayor (mayor que 1) para que la luz se transmita desde la muestra a la cara exterior de la lente del objetivo con una refracción mínima. Se pueden lograr aperturas numéricas de hasta 1,6. La apertura numérica más grande permite la recolección de más luz, lo que hace posible la observación detallada de detalles más pequeños. Una lente de inmersión en aceite generalmente tiene un aumento de 40 a 100x.

Perillas de enfoque

Las perillas de ajuste mueven el escenario hacia arriba y hacia abajo con un ajuste separado para un enfoque grueso y fino. Los mismos controles permiten que el microscopio se ajuste a especímenes de diferente grosor. En los diseños más antiguos de microscopios, las ruedas de ajuste de enfoque mueven el tubo del microscopio hacia arriba o hacia abajo en relación con el soporte y tenían una platina fija.

Marco

Tradicionalmente, todo el conjunto óptico va unido a un brazo rígido, que a su vez va unido a un robusto pie en forma de U para proporcionar la rigidez necesaria. El ángulo del brazo puede ser ajustable para permitir que se ajuste el ángulo de visión.

El marco proporciona un punto de montaje para varios controles de microscopio. Normalmente, esto incluirá controles para el enfoque, normalmente una rueda moleteada grande para ajustar el enfoque aproximado, junto con una rueda moleteada más pequeña para controlar el enfoque fino. Otras características pueden ser controles de lámpara y/o controles para ajustar el condensador.

Escenario

El escenario es una plataforma debajo de la lente del objetivo que soporta el espécimen que se está viendo. En el centro del escenario hay un agujero a través del cual pasa la luz para iluminar el espécimen. La platina suele tener brazos para sujetar portaobjetos (placas rectangulares de vidrio con unas dimensiones típicas de 25×75 mm, sobre las que se monta la muestra).

Con aumentos superiores a 100×, mover una diapositiva a mano no es práctico. Una platina mecánica, típica de los microscopios de precio medio y alto, permite pequeños movimientos del portaobjetos a través de perillas de control que reposicionan la muestra/portaobjetos según se desee. Si un microscopio no tenía originalmente una platina mecánica, es posible agregar una.

Todas las etapas se mueven hacia arriba y hacia abajo para enfocarse. Con una platina mecánica, los portaobjetos se mueven en dos ejes horizontales para posicionar la muestra y examinar los detalles de la misma.

El enfoque comienza con un aumento más bajo para que el usuario centre la muestra en el escenario. Mover a un aumento mayor requiere que la platina se mueva verticalmente más alto para volver a enfocar en el aumento mayor y también puede requerir un ligero ajuste de la posición horizontal de la muestra. Los ajustes de la posición horizontal de la muestra son la razón de tener una platina mecánica.

Debido a la dificultad de preparar muestras y montarlas en portaobjetos, para los niños es mejor comenzar con portaobjetos preparados que estén centrados y se enfoquen fácilmente, independientemente del nivel de enfoque utilizado.

Fuente de luz

Se pueden utilizar muchas fuentes de luz. En su forma más simple, la luz del día se dirige a través de un espejo. Sin embargo, la mayoría de los microscopios tienen su propia fuente de luz ajustable y controlable, a menudo una lámpara halógena, aunque la iluminación con LED y láser se está convirtiendo en una disposición más común. La iluminación de Köhler a menudo se proporciona en instrumentos más caros.

Condensador

El condensador es una lente diseñada para enfocar la luz de la fuente de iluminación en la muestra. El condensador también puede incluir otras características, como un diafragma y/o filtros, para gestionar la calidad y la intensidad de la iluminación. Para técnicas de iluminación como campo oscuro, contraste de fase y microscopía de contraste de interferencia diferencial, los componentes ópticos adicionales deben alinearse con precisión en la trayectoria de la luz.

Aumento

La potencia o aumento real de un microscopio óptico compuesto es el producto de las potencias del ocular y la lente del objetivo. Por ejemplo, un aumento del ocular de 10x y un aumento de la lente del objetivo de 100x dan un aumento total de 1000x. Los entornos modificados, como el uso de aceite o luz ultravioleta, pueden aumentar la resolución y permitir detalles resueltos con aumentos superiores a 1000x.

Operación

Agente de la Oficina de Operaciones de Campo de EE.UU. revisa la autenticidad de un documento de viaje en un aeropuerto internacional usando un microscopio estéreo

Técnicas de iluminación

Hay muchas técnicas disponibles que modifican la trayectoria de la luz para generar una imagen de contraste mejorado a partir de una muestra. Las principales técnicas para generar un mayor contraste de la muestra incluyen luz polarizada cruzada, campo oscuro, contraste de fase e iluminación de contraste de interferencia diferencial. Una técnica reciente (Sarfus) combina luz polarizada cruzada y diapositivas específicas mejoradas con contraste para la visualización de muestras nanométricas.

• Cuatro ejemplos de técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel de tejido. 1.559 μm/pixel.
• 

  Iluminación de campo brillante, contraste de muestra proviene de la absorción de luz en la muestra.

• 

  Iluminación de luz poliarizada cruzada, contraste de muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.

• 

  Iluminación de campo oscuro, contraste de muestra viene de la luz dispersa por la muestra.

• 

  Iluminación de contraste de fase, contraste de muestra proviene de interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de luz a través de la muestra.

Otras técnicas

Los microscopios modernos permiten algo más que la simple observación de la imagen de luz transmitida de una muestra; hay muchas técnicas que se pueden utilizar para extraer otros tipos de datos. La mayoría de estos requieren equipo adicional además de un microscopio compuesto básico.

• Luz reflejada o incidente, iluminación (para análisis de estructuras superficiales)
• Microscopia de fluorescencia, ambos:

• Microscopia de epifluorescencia
• Microscopia focalizada

• Microspectroscopia (donde un espectrofotómetro visible UV se integra con un microscopio óptico)
• Microscopia ultravioleta
• Microscopia infrarroja
• Microscopía de transmisión múltiple para mejorar el contraste y reducir la aberración.
• Automatización (para el escaneo automático de una muestra grande o captura de imagen)

Aplicaciones

Una imagen de magnificación 40x de células en una prueba de medición médica tomada a través de un microscopio óptico utilizando una técnica de montaje húmedo, colocando el espécimen en una diapositiva de vidrio y mezclando con una solución de sal

La microscopía óptica se usa ampliamente en microelectrónica, nanofísica, biotecnología, investigación farmacéutica, mineralogía y microbiología.

La microscopía óptica se utiliza para el diagnóstico médico, el campo se denomina histopatología cuando se trata de tejidos, o en pruebas de frotis en células libres o fragmentos de tejido.

En uso industrial, los microscopios binoculares son comunes. Aparte de las aplicaciones que necesitan una verdadera percepción de profundidad, el uso de oculares duales reduce la fatiga visual asociada con los largos días de trabajo en una estación de microscopía. En ciertas aplicaciones, los microscopios de larga distancia de trabajo o de enfoque largo son beneficiosos. Es posible que sea necesario examinar un artículo detrás de una ventana, o los temas industriales pueden ser un peligro para el objetivo. Tales ópticas se parecen a los telescopios con capacidades de enfoque cercano.

Los microscopios de medición se utilizan para mediciones de precisión. Hay dos tipos básicos. Uno tiene una retícula graduada para permitir medir distancias en el plano focal. El otro tipo (y más antiguo) tiene un retículo simple y un mecanismo micrométrico para mover el sujeto en relación con el microscopio.

Los microscopios portátiles muy pequeños han encontrado cierto uso en lugares donde un microscopio de laboratorio sería una carga.

Limitaciones

El límite de difusión establecido en piedra en un monumento para Ernst Abbe.

Con aumentos muy altos con luz transmitida, los objetos puntuales se ven como discos borrosos rodeados de anillos de difracción. Estos se llaman discos Airy. El poder de resolución de un microscopio se considera como la capacidad de distinguir entre dos discos de Airy muy próximos entre sí (o, en otras palabras, la capacidad del microscopio para revelar detalles estructurales adyacentes como distintos y separados). Son estos impactos de la difracción los que limitan la capacidad de resolver los detalles finos. El alcance y la magnitud de los patrones de difracción se ven afectados tanto por la longitud de onda de la luz (λ), los materiales de refracción utilizados para fabricar la lente del objetivo como por la apertura numérica (NA) de la lente del objetivo. Por lo tanto, existe un límite finito más allá del cual es imposible resolver puntos separados en el campo objetivo, conocido como límite de difracción. Suponiendo que las aberraciones ópticas en toda la configuración óptica son insignificantes, la resolución d se puede establecer como:

${displaystyle d={frac {fnMicrosoft} } {2NA}}$

Por lo general, se asume una longitud de onda de 550 nm, que corresponde a la luz verde. Con aire como medio externo, el NA práctico más alto es 0,95, y con aceite, hasta 1,5. En la práctica, el valor más bajo de d que se puede obtener con lentes convencionales es de unos 200 nm. Un nuevo tipo de lente que usa dispersión múltiple de luz permitió mejorar la resolución por debajo de 100 nm.

Superar el límite de resolución

Hay varias técnicas disponibles para alcanzar resoluciones superiores al límite de luz transmitida descrito anteriormente. Las técnicas holográficas, tal como las describen Courjon y Bulabois en 1979, también son capaces de romper este límite de resolución, aunque la resolución estaba restringida en su análisis experimental.

Usando muestras fluorescentes hay más técnicas disponibles. Los ejemplos incluyen Vertico SMI, microscopía óptica de barrido de campo cercano que utiliza ondas evanescentes y agotamiento de emisión estimulada. En 2005, se describió como herramienta de enseñanza un microscopio capaz de detectar una sola molécula.

A pesar del progreso significativo en la última década, las técnicas para superar el límite de difracción siguen siendo limitadas y especializadas.

Si bien la mayoría de las técnicas se centran en aumentar la resolución lateral, también existen algunas técnicas que tienen como objetivo permitir el análisis de muestras extremadamente delgadas. Por ejemplo, los métodos sarfus colocan la muestra delgada sobre una superficie que mejora el contraste y, por lo tanto, permite visualizar directamente películas tan delgadas como 0,3 nanómetros.

El 8 de octubre de 2014, se otorgó el Premio Nobel de Química a Eric Betzig, William Moerner y Stefan Hell por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia superresuelta.

Iluminación estructurada SMI

SMI (microscopía de iluminación modulada espacialmente) es un proceso óptico de luz de la llamada ingeniería de función de dispersión de puntos (PSF). Estos son procesos que modifican la PSF de un microscopio de manera adecuada para aumentar la resolución óptica, maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes que son pequeños en relación con la longitud de onda de la luz que ilumina, o extraer otros parámetros estructurales en el rango nanométrico.

Microscopía de localización SPDMphymod

Microscopia de alta resolución de doble color 3D con Her2 y Her3 en células mamarias, tintes estándar: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral), la tecnología básica de microscopía de localización es un proceso óptico de luz de microscopía de fluorescencia que permite mediciones de posición, distancia y ángulo en "ópticamente aislado" partículas (por ejemplo, moléculas) muy por debajo del límite teórico de resolución para microscopía óptica. "Ópticamente aislado" significa que, en un momento dado, solo se registra una sola partícula/molécula dentro de una región de un tamaño determinado por la resolución óptica convencional (normalmente, aproximadamente 200-250 nm de diámetro). Esto es posible cuando las moléculas dentro de dicha región llevan todos diferentes marcadores espectrales (por ejemplo, diferentes colores u otras diferencias utilizables en la emisión de luz de diferentes partículas).

Muchos colorantes fluorescentes estándar como GFP, colorantes Alexa, colorantes Atto, Cy2/Cy3 y moléculas de fluoresceína se pueden utilizar para la microscopía de localización, siempre que se den ciertas condiciones fotofísicas. Usando esta tecnología llamada SPDMphymod (fluoróforos modificables físicamente), una única longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la nanoimagen.

Microscopía de súper resolución 3D

La microscopía de superresolución 3D con tintes fluorescentes estándar se puede lograr mediante la combinación de microscopía de localización para tintes fluorescentes estándar SPDMphymod e iluminación estructurada SMI.

STED

Imagen de microscopía de emisión estimulada de filamentos de actina dentro de una célula.

El agotamiento de la emisión estimulada es un ejemplo simple de cómo es posible una resolución más alta que supere el límite de difracción, pero tiene limitaciones importantes. STED es una técnica de microscopía de fluorescencia que utiliza una combinación de pulsos de luz para inducir la fluorescencia en una pequeña subpoblación de moléculas fluorescentes en una muestra. Cada molécula produce un punto de luz limitado por difracción en la imagen, y el centro de cada uno de estos puntos corresponde a la ubicación de la molécula. Como el número de moléculas fluorescentes es bajo, es poco probable que los puntos de luz se superpongan y, por lo tanto, se pueden colocar con precisión. Luego, este proceso se repite muchas veces para generar la imagen. Stefan Hell, del Instituto Max Planck de Química Biofísica, recibió el décimo Premio Alemán del Futuro en 2006 y el Premio Nobel de Química en 2014 por su desarrollo del microscopio STED y las metodologías asociadas.

Alternativas

Para superar las limitaciones que impone el límite de difracción de la luz visible, se han diseñado otros microscopios que utilizan otras ondas.

• Microscopio de fuerza atómica (AFM)
• Microscopio electrónico de escaneo (SEM)
• Microscopía de desconductancia de iones (SICM)
• Microscopio de túnelización (STM)
• Microscopia electrónica de transmisión (TEM)
• Microscopio ultravioleta
• Microscopio de rayos X

Es importante tener en cuenta que las ondas de mayor frecuencia tienen una interacción limitada con la materia, por ejemplo, los tejidos blandos son relativamente transparentes a los rayos X, lo que da como resultado distintas fuentes de contraste y diferentes aplicaciones de destino.

El uso de electrones y rayos X en lugar de luz permite una resolución mucho mayor: la longitud de onda de la radiación es más corta, por lo que el límite de difracción es más bajo. para hacer el sonda de longitud de onda corta no destructiva, el sistema de imagen de haz atómico (nanoscopio atómico) ha sido propuesto y discutido ampliamente en la literatura, pero aún no es competitivo con los sistemas de imagen convencionales.

STM y AFM son técnicas de sonda de exploración que utilizan una pequeña sonda que se escanea sobre la superficie de la muestra. La resolución en estos casos está limitada por el tamaño de la sonda; Las técnicas de micromecanizado pueden producir sondas con radios de punta de 5 a 10 nm.

Además, métodos como la microscopía electrónica o de rayos X utilizan vacío o vacío parcial, lo que limita su uso para muestras vivas y biológicas (con la excepción de un microscopio electrónico de barrido ambiental). Las cámaras de muestra necesarias para todos estos instrumentos también limitan el tamaño de la muestra y la manipulación de la muestra es más difícil. El color no se puede ver en las imágenes creadas con estos métodos, por lo que se pierde parte de la información. Sin embargo, son esenciales cuando se investigan efectos moleculares o atómicos, como el endurecimiento por envejecimiento en aleaciones de aluminio o la microestructura de polímeros.

Fuentes citadas

• Van Helden, Albert; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). Los orígenes del telescopio. Amsterdam University Press. ISBN 978-9069846156.