Microscopio electrónico

Un microscopio electrónico es un microscopio que utiliza un haz de electrones acelerados como fuente de iluminación. Como la longitud de onda de un electrón puede ser hasta 100 000 veces más corta que la de los fotones de luz visible, los microscopios electrónicos tienen un poder de resolución mayor que los microscopios ópticos y pueden revelar la estructura de objetos más pequeños. Un microscopio electrónico de transmisión de barrido ha logrado una resolución superior a 50 pm en el modo de imagen de campo oscuro anular y aumentos de hasta aproximadamente 10 000 000 ×, mientras que la mayoría de los microscopios ópticos están limitados por difracción a una resolución de aproximadamente 200 nm y aumentos útiles por debajo de 2000 ×.

Los microscopios electrónicos utilizan campos magnéticos moldeados para formar sistemas de lentes ópticas de electrones que son análogos a las lentes de vidrio de un microscopio de luz óptica.

Los microscopios electrónicos se utilizan para investigar la ultraestructura de una amplia gama de muestras biológicas e inorgánicas, incluidos microorganismos, células, moléculas grandes, muestras de biopsia, metales y cristales. Industrialmente, los microscopios electrónicos se utilizan a menudo para el control de calidad y el análisis de fallas. Los microscopios electrónicos modernos producen micrografías electrónicas utilizando cámaras digitales especializadas y capturadores de fotogramas para capturar las imágenes.

Historia

En 1926, Hans Busch desarrolló la lente electromagnética.

Según Dennis Gabor, el físico Leó Szilárd intentó en 1928 convencerlo de que construyera un microscopio electrónico, para el que había presentado una patente. El primer prototipo de microscopio electrónico, con capacidad de aumento de 400 aumentos, fue desarrollado en 1931 por el físico Ernst Ruska y el ingeniero eléctrico Max Knoll en la Berlin Technische Hochschule o Universidad Técnica de Berlín. El aparato fue la primera demostración práctica de los principios de la microscopía electrónica. En mayo del mismo año, Reinhold Rudenberg, director científico de Siemens-Schuckertwerke, obtuvo una patente para un microscopio electrónico. En 1932, Ernst Lubcke de Siemens & Halske construyó y obtuvo imágenes de un microscopio electrónico prototipo, aplicando los conceptos descritos en la patente de Rudenberg.

Al año siguiente, 1933, Ruska construyó el primer microscopio electrónico que excedía la resolución alcanzable con un microscopio óptico (de luz). Cuatro años más tarde, en 1937, Siemens financió el trabajo de Ernst Ruska y Bodo von Borries y empleó a Helmut Ruska, el hermano de Ernst, para desarrollar aplicaciones para el microscopio, especialmente con muestras biológicas. También en 1937, Manfred von Ardenne fue pionero en el microscopio electrónico de barrido. Siemens produjo el primer microscopio electrónico comercial en 1938. Los primeros microscopios electrónicos norteamericanos fueron construidos en 1930, en la Universidad Estatal de Washington por Anderson y Fitzsimmons. y la Universidad de Toronto, por Eli Franklin Burton y los estudiantes Cecil Hall, James Hillier y Albert Prebus. Siemens produjo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) en 1939. Aunque los microscopios electrónicos de transmisión actuales son capaces de aumentar dos millones de potencias, como instrumentos científicos, se basan en el prototipo de Ruska.

Tipos

Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

La forma original del microscopio electrónico, el microscopio electrónico de transmisión (TEM), utiliza un haz de electrones de alto voltaje para iluminar la muestra y crear una imagen. El haz de electrones es producido por un cañón de electrones, comúnmente equipado con un cátodo de filamento de tungsteno como fuente de electrones. El haz de electrones es acelerado por un ánodo típicamente a +100 keV (40 a 400 keV) con respecto al cátodo, enfocado por lentes electrostáticas y electromagnéticas, y transmitido a través de la muestra que es en parte transparente a los electrones y en parte los dispersa. del haz Cuando emerge del espécimen, el haz de electrones transporta información sobre la estructura del espécimen que es ampliada por el sistema de lentes del objetivo del microscopio. La variación espacial de esta información (la "imagen") se puede ver proyectando la imagen de electrones ampliada en una pantalla de visualización fluorescente recubierta con un fósforo o un material centelleador como el sulfuro de zinc. Alternativamente, la imagen se puede registrar fotográficamente exponiendo una película o placa fotográfica directamente al haz de electrones, o se puede acoplar un fósforo de alta resolución por medio de un sistema óptico de lentes o una guía de luz de fibra óptica al sensor de una cámara digital. cámara. La imagen detectada por la cámara digital puede mostrarse en un monitor o computadora. o se puede acoplar un fósforo de alta resolución por medio de un sistema óptico de lente o una guía de luz de fibra óptica al sensor de una cámara digital. La imagen detectada por la cámara digital puede mostrarse en un monitor o computadora. o se puede acoplar un fósforo de alta resolución por medio de un sistema óptico de lente o una guía de luz de fibra óptica al sensor de una cámara digital. La imagen detectada por la cámara digital puede mostrarse en un monitor o computadora.

La resolución de los TEM está limitada principalmente por la aberración esférica, pero una nueva generación de correctores de hardware puede reducir la aberración esférica para aumentar la resolución en microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) por debajo de 0,5 angstrom (50 picómetros), lo que permite aumentos superiores a 50 millones veces. La capacidad de HRTEM para determinar las posiciones de los átomos dentro de los materiales es útil para la investigación y el desarrollo de nanotecnologías.

Los microscopios electrónicos de transmisión se utilizan a menudo en el modo de difracción de electrones. Las ventajas de la difracción de electrones sobre la cristalografía de rayos X son que la muestra no necesita ser un solo cristal o incluso un polvo policristalino, y también que la reconstrucción por transformada de Fourier de la estructura ampliada del objeto se produce físicamente y, por lo tanto, evita la necesidad de resolver el problema de la fase. que enfrentan los cristalógrafos de rayos X después de obtener sus patrones de difracción de rayos X.

Una desventaja importante del microscopio electrónico de transmisión es la necesidad de secciones extremadamente delgadas de las muestras, normalmente de unos 100 nanómetros. La creación de estas secciones delgadas para especímenes biológicos y de materiales es técnicamente muy desafiante. Las secciones delgadas de semiconductores se pueden hacer utilizando un haz de iones enfocado. Las muestras de tejido biológico se fijan químicamente, se deshidratan y se incrustan en una resina polimérica para estabilizarlas lo suficiente como para permitir un corte ultrafino. Las secciones de muestras biológicas, polímeros orgánicos y materiales similares pueden requerir tinción con etiquetas de átomos pesados ​​para lograr el contraste de imagen requerido.

Microscopio electrónico de sección en serie (ssEM)

Una aplicación de TEM es la microscopía electrónica de sección en serie (ssEM), por ejemplo, en el análisis de la conectividad en muestras volumétricas de tejido cerebral al obtener imágenes de muchas secciones delgadas en secuencia. Esto se puede lograr mediante la introducción de un método de fresado en la canalización de imágenes, mediante el cual se exponen cortes sucesivos de un volumen 3D al haz y se obtienen imágenes. Estos métodos incluyen Serial Block Face SEM (SB-SEM) y Focused Ion Beam-SEM (FIB-SEM). El preprocesamiento de volúmenes para crear muchos cortes de los que se obtienen imágenes de forma automatizada ha logrado recientemente imágenes de alto rendimiento de volúmenes de hasta 1 mm. Con este método, se pueden resolver microcircuitos neuronales locales completos, aunque los requisitos de equipo y tiempo para esto siguen siendo importantes: obtener imágenes de 1 mmbloque de tejido cerebral requirió 6 meses de imágenes casi continuas por seis TEM funcionando en paralelo.

Microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM)

El STEM rastrea una sonda incidente enfocada a través de una muestra que (al igual que con el TEM) se ha adelgazado para facilitar la detección de electrones dispersos a través de la muestra. La alta resolución del TEM es así posible en STEM. La acción de enfoque (y las aberraciones) ocurren antes de que los electrones golpeen la muestra en el STEM, pero luego en el TEM. El uso de STEM de rasterización de haz similar a SEM simplifica la obtención de imágenes de campo oscuro anular y otras técnicas analíticas, pero también significa que los datos de imagen se adquieren en serie en lugar de en paralelo. A menudo, TEM puede equiparse con la opción de escaneo y luego puede funcionar como TEM y STEM.

Microscopio electrónico de barrido (SEM)

El SEM produce imágenes al sondear la muestra con un haz de electrones enfocado que se escanea a través de un área rectangular de la muestra (escaneo de trama). Cuando el haz de electrones interactúa con la muestra, pierde energía por una variedad de mecanismos. La energía perdida se convierte en formas alternativas como calor, emisión de electrones secundarios de baja energía y electrones retrodispersados ​​de alta energía, emisión de luz (catodoluminiscencia) o emisión de rayos X, todos los cuales proporcionan señales que transmiten información sobre las propiedades de la muestra. superficie, como su topografía y composición. La imagen mostrada por un SEM mapea la intensidad variable de cualquiera de estas señales en la imagen en una posición correspondiente a la posición del haz en la muestra cuando se generó la señal. En la imagen SEM de una hormiga que se muestra abajo y a la derecha,

Generalmente, la resolución de imagen de un SEM es más baja que la de un TEM. Sin embargo, debido a que el SEM toma imágenes de la superficie de una muestra en lugar de su interior, los electrones no tienen que viajar a través de la muestra. Esto reduce la necesidad de una preparación extensa de la muestra para adelgazar la muestra hasta la transparencia de los electrones. El SEM es capaz de obtener imágenes de muestras a granel que caben en su platina y aun así se pueden maniobrar, incluida una altura inferior a la distancia de trabajo que se utiliza, a menudo de 4 milímetros para imágenes de alta resolución. El SEM también tiene una gran profundidad de campo, por lo que puede producir imágenes que son buenas representaciones de la forma tridimensional de la superficie de la muestra. Otra ventaja de los SEM viene con microscopios electrónicos de barrido ambiental (ESEM) que pueden producir imágenes de buena calidad y resolución con muestras hidratadas o en baja, en lugar de alta, vacío o bajo gases de cámara. Esto facilita la obtención de imágenes de muestras biológicas no fijadas que son inestables en el alto vacío de los microscopios electrónicos convencionales.

Microscopio electrónico de reflexión (REM)

En el microscopio electrónico de reflexión (REM) al igual que en el TEM, un haz de electrones incide sobre una superficie pero en lugar de utilizar los electrones de transmisión (TEM) o secundarios (SEM), se detecta el haz reflejado de electrones dispersados ​​elásticamente. Esta técnica generalmente se combina con la difracción de electrones de alta energía de reflexión (RHEED) y la espectroscopia de pérdida de alta energía de reflexión (RHELS). Otra variación es la microscopía electrónica de baja energía polarizada por espín (SPLEEM), que se utiliza para observar la microestructura de los dominios magnéticos.

Microscopía de túnel de barrido (STM)

En STM, una punta conductora sujeta a un voltaje se acerca a una superficie y se puede obtener un perfil basado en la probabilidad de tunelización de un electrón desde la punta hasta la muestra, ya que es una función de la distancia.

Color

En sus configuraciones más comunes, los microscopios electrónicos producen imágenes con un solo valor de brillo por píxel, y los resultados generalmente se muestran en escala de grises. Sin embargo, a menudo estas imágenes se colorean mediante el uso de software de detección de características, o simplemente editándolas a mano con un editor de gráficos. Esto se puede hacer para aclarar la estructura o por un efecto estético y, por lo general, no agrega nueva información sobre el espécimen.

En algunas configuraciones, la información sobre varias propiedades de la muestra se recopila por píxel, generalmente mediante el uso de múltiples detectores. En SEM, los atributos de topografía y contraste de materiales se pueden obtener mediante un par de detectores de electrones retrodispersados ​​y dichos atributos se pueden superponer en una imagen de un solo color asignando un color primario diferente a cada atributo. De manera similar, una combinación de señales de electrones retrodispersados ​​y secundarios puede asignarse a diferentes colores y superponerse en una micrografía de un solo color que muestra simultáneamente las propiedades de la muestra.

Algunos tipos de detectores utilizados en SEM tienen capacidades analíticas y pueden proporcionar varios elementos de datos en cada píxel. Algunos ejemplos son los detectores de espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDS) utilizados en el análisis elemental y los sistemas de microscopio de catodoluminiscencia (CL) que analizan la intensidad y el espectro de la luminiscencia inducida por electrones en (por ejemplo) especímenes geológicos. En los sistemas SEM que utilizan estos detectores, es común codificar por colores las señales y superponerlas en una sola imagen de color, de modo que las diferencias en la distribución de los diversos componentes de la muestra puedan verse claramente y compararse. Opcionalmente, la imagen estándar de electrones secundarios se puede fusionar con uno o más canales de composición, de modo que se puedan comparar la estructura y la composición de la muestra.

Preparación de la muestra

Los materiales que se van a observar bajo un microscopio electrónico pueden requerir procesamiento para producir una muestra adecuada. La técnica requerida varía según la muestra y el análisis requerido:

• Fijación química: para muestras biológicas tiene como objetivo estabilizar la estructura macromolecular móvil de la muestra mediante la reticulación química de proteínas con aldehídos como formaldehído y glutaraldehído, y lípidos con tetróxido de osmio.
• Tinción negativa: las suspensiones que contienen nanopartículas o material biológico fino (como virus y bacterias) se mezclan brevemente con una solución diluida de una solución opaca a los electrones, como molibdato de amonio, acetato de uranilo (o formiato) o ácido fosfotúngstico. Esta mezcla se aplica a una rejilla EM adecuadamente recubierta, se seca y luego se deja secar. La visualización de esta preparación en el TEM debe realizarse sin demora para obtener los mejores resultados. El método es importante en microbiología para una identificación morfológica rápida pero cruda, pero también se puede utilizar como base para la reconstrucción 3D de alta resolución utilizando la metodología de tomografía EM cuando se utilizan películas de carbono como soporte. La tinción negativa también se utiliza para la observación de nanopartículas.
• Criofijación: congelación de una muestra tan rápidamente en etano líquido que el agua forma hielo vítreo (no cristalino). Esto conserva la muestra en una instantánea de su estado de solución. Todo un campo llamado microscopía crioelectrónica se ha ramificado a partir de esta técnica. Con el desarrollo de la microscopía crioelectrónica de secciones vítreas (CEMOVIS), ahora es posible observar muestras de prácticamente cualquier espécimen biológico cerca de su estado nativo.
• Deshidratación: o reemplazo del agua con solventes orgánicos como etanol o acetona, seguido de secado en el punto crítico o infiltración con resinas de inclusión. También liofilización.
• Incrustación de especímenes biológicos: después de la deshidratación, el tejido para observación en el microscopio electrónico de transmisión se incrusta para que pueda ser seccionado y listo para su visualización. Para hacer esto, el tejido se pasa a través de un 'disolvente de transición' como óxido de propileno (epoxipropano) o acetona y luego se infiltra con una resina epoxi como Araldite, Epon o Durcupan; los tejidos también se pueden incrustar directamente en resina acrílica miscible en agua. Una vez que la resina se ha polimerizado (endurecido), la muestra se corta en secciones delgadas (secciones ultrafinas) y se tiñe, luego está lista para su visualización.
• Incrustación, materiales: después de la incrustación en resina, la muestra generalmente se muele y pule hasta obtener un acabado similar a un espejo con abrasivos ultrafinos. El proceso de pulido debe realizarse con cuidado para minimizar los rayones y otros artefactos de pulido que reducen la calidad de la imagen.
• Sombreado de metal: el metal (p. ej., platino) se evapora de un electrodo superior y se aplica a la superficie de una muestra biológica en ángulo. La topografía de la superficie da como resultado variaciones en el grosor del metal que se ven como variaciones en el brillo y el contraste en la imagen del microscopio electrónico.
• Replicación: una superficie sombreada con metal (p. ej., platino o una mezcla de carbono y platino) en ángulo se recubre con carbono puro evaporado de electrodos de carbono en ángulo recto con la superficie. A esto le sigue la eliminación del material de la muestra (por ejemplo, en un baño ácido, usando enzimas o por separación mecánica) para producir una réplica de la superficie que registra la ultraestructura de la superficie y puede examinarse mediante microscopía electrónica de transmisión.
• Seccionamiento: produce cortes finos de la muestra, semitransparentes a los electrones. Estos se pueden cortar en un ultramicrótomo con un cuchillo de vidrio o de diamante para producir secciones ultrafinas de aproximadamente 60 a 90 nm de espesor. También se utilizan cuchillos de vidrio desechables porque se pueden fabricar en el laboratorio y son mucho más baratos.
• Tinción: utiliza metales pesados ​​como plomo, uranio o tungsteno para dispersar los electrones de la imagen y, por lo tanto, contrastar entre diferentes estructuras, ya que muchos materiales (especialmente los biológicos) son casi "transparentes" a los electrones (objetos de fase débil). En biología, las muestras se pueden teñir "en bloque" antes de incluirlas y también después de seccionarlas. Normalmente, las secciones finas se tiñen durante varios minutos con una solución acuosa o alcohólica de acetato de uranilo seguida de citrato de plomo acuoso.
• Fractura por congelación o grabado por congelación: un método de preparación particularmente útil para examinar las membranas lipídicas y sus proteínas incorporadas en una vista "frontal". El tejido fresco o la suspensión de células se congela rápidamente (criofijación), luego se fractura rompiéndolo (o usando un micrótomo) mientras se mantiene a la temperatura del nitrógeno líquido. La superficie fracturada en frío (a veces "grabada" al aumentar la temperatura a aproximadamente -100 ° C durante varios minutos para dejar que un poco de hielo se sublime)luego se sombrea con platino u oro evaporado en un ángulo promedio de 45° en un evaporador de alto vacío. La segunda capa de carbono, evaporada perpendicularmente al plano de la superficie promedio, a menudo se realiza para mejorar la estabilidad de la réplica del revestimiento. El espécimen se devuelve a temperatura y presión ambiente, luego la extremadamente frágil réplica metálica "presombreada" de la superficie de la fractura se libera del material biológico subyacente mediante una cuidadosa digestión química con ácidos, solución de hipoclorito o detergente SDS. La réplica que aún flota se lava a fondo para eliminar los productos químicos residuales, se pesca cuidadosamente en rejillas finas, se seca y luego se observa en el TEM.
• Réplica de inmunomarcaje de fractura por congelación (FRIL): el método de fractura por congelación se ha modificado para permitir la identificación de los componentes de la cara de la fractura mediante marcaje con inmunooro. En lugar de eliminar todo el tejido subyacente de la réplica descongelada como paso final antes de observar en el microscopio, el grosor del tejido se minimiza durante o después del proceso de fractura. La capa delgada de tejido permanece unida a la réplica de metal para que pueda ser inmunomarcada con anticuerpos contra las estructuras elegidas. La fina capa del espécimen original sobre la réplica con oro adjunto permite la identificación de estructuras en el plano de fractura. También existen métodos relacionados que etiquetan la superficie de las células grabadas y otras variaciones de etiquetado de réplicas.
• Molienda de haz de iones: diluye las muestras hasta que sean transparentes a los electrones disparando iones (normalmente argón) a la superficie desde un ángulo y pulverizando material desde la superficie. Una subclase de esto es la molienda de haz de iones enfocados, donde los iones de galio se utilizan para producir una membrana transparente a los electrones en una región específica de la muestra, por ejemplo, a través de un dispositivo dentro de un microprocesador. El fresado con haz de iones también se puede utilizar para el pulido de secciones transversales antes del análisis SEM de materiales que son difíciles de preparar mediante pulido mecánico.
• Revestimiento conductivo: un revestimiento ultrafino de material conductor de la electricidad, depositado por evaporación a alto vacío o por pulverización catódica a bajo vacío de la muestra. Esto se hace para evitar la acumulación de campos eléctricos estáticos en la muestra debido a la irradiación de electrones requerida durante la formación de imágenes. Los materiales de recubrimiento incluyen oro, oro/paladio, platino, tungsteno, grafito, etc.
• Conexión a tierra: para evitar la acumulación de carga eléctrica en una muestra recubierta de forma conductora, generalmente se conecta eléctricamente al portamuestras de metal. A menudo se utiliza un adhesivo eléctricamente conductor para este propósito.

Desventajas

Los microscopios electrónicos son costosos de construir y mantener, pero los costos de capital y funcionamiento de los sistemas de microscopios ópticos confocales ahora se superponen con los de los microscopios electrónicos básicos. Los microscopios diseñados para lograr altas resoluciones deben alojarse en edificios estables (a veces subterráneos) con servicios especiales como sistemas de cancelación de campos magnéticos.

En gran parte, las muestras deben verse en el vacío, ya que las moléculas que forman el aire dispersarían los electrones. Una excepción es la microscopía electrónica de fase líquida que utiliza una celda líquida cerrada o una cámara ambiental, por ejemplo, en el microscopio electrónico de barrido ambiental, que permite ver muestras hidratadas a baja presión (hasta 20 Torr o 2,7 kPa). ambiente húmedo. También se han desarrollado varias técnicas para la microscopía electrónica in situ de muestras gaseosas.

Los microscopios electrónicos de barrido que funcionan en el modo convencional de alto vacío suelen obtener imágenes de muestras conductoras; por lo tanto, los materiales no conductores requieren un revestimiento conductor (aleación de oro/paladio, carbono, osmio, etc.). El modo de bajo voltaje de los microscopios modernos hace posible la observación de muestras no conductoras sin recubrimiento. Los materiales no conductores también se pueden visualizar mediante un microscopio electrónico de barrido de presión variable (o ambiental).

Las muestras pequeñas y estables, como los nanotubos de carbono, las frustulas de diatomeas y los pequeños cristales minerales (fibras de asbesto, por ejemplo), no requieren ningún tratamiento especial antes de ser examinadas en el microscopio electrónico. Las muestras de materiales hidratados, incluidos casi todos los especímenes biológicos, deben prepararse de varias maneras para estabilizarlos, reducir su grosor (secciones ultrafinas) y aumentar su contraste óptico de electrones (tinción). Estos procesos pueden dar lugar a artefactos, pero normalmente se pueden identificar comparando los resultados obtenidos mediante el uso de métodos de preparación de muestras radicalmente diferentes. Desde la década de 1980, los científicos también han utilizado cada vez más el análisis de muestras vitrificadas y criofijadas, lo que confirma aún más la validez de esta técnica.

Aplicaciones

Almacenamiento de datos y semiconductoresEdita el circuitoAnálisis de defectosAnalisis fallidoBiología y ciencias de la vidaCriobiologíaMicroscopía crioelectrónicaMicroscopía electrónica de diagnósticoInvestigación de medicamentos (por ejemplo, antibióticos)tomografía electrónicaAnálisis de partículasDetección de partículaslocalización de proteínasbiología estructuralImágenes de tejidosToxicologíaVirología (p. ej., monitorización de la carga viral)

Investigación de materialesPruebas y caracterización de dispositivosExperimentos de materiales dinámicosDeposición inducida por haz de electronesCaracterización in situCualificación de materialesInvestigación médicaNanometrologíaNanoprototiposIndustriaQuímica/PetroquímicaFabricación de escritura de haz directoCiencia de los Alimentosmedicina forenseFractografíaMicro-caracterizaciónMinería (análisis de liberación de minerales)Control de calidad farmacéutico