Microscopio de transmisión por electrones
microscopía electrónica de transmisión (TEM) es una técnica de microscopía en la que un haz de electrones se transmite a través de una muestra para formar una imagen. La muestra suele ser una sección ultrafina de menos de 100 nm de espesor o una suspensión en una rejilla. Se forma una imagen a partir de la interacción de los electrones con la muestra a medida que el haz se transmite a través de la muestra. Luego, la imagen se amplía y se enfoca en un dispositivo de imagen, como una pantalla fluorescente, una capa de película fotográfica o un sensor como un centelleador conectado a un dispositivo de carga acoplada.
Los microscopios electrónicos de transmisión son capaces de generar imágenes a una resolución significativamente mayor que los microscopios ópticos, debido a la menor longitud de onda de los electrones de De Broglie. Esto permite que el instrumento capture detalles finos, incluso tan pequeños como una sola columna de átomos, que es miles de veces más pequeño que un objeto resoluble visto en un microscopio óptico. La microscopía electrónica de transmisión es un método analítico importante en las ciencias físicas, químicas y biológicas. Los TEM encuentran aplicación en la investigación del cáncer, la virología y la ciencia de los materiales, así como en la investigación de la contaminación, la nanotecnología y los semiconductores, pero también en otros campos como la paleontología y la palinología.
Los instrumentos TEM tienen varios modos de funcionamiento que incluyen imágenes convencionales, imágenes TEM de barrido (STEM), difracción, espectroscopia y combinaciones de estos. Incluso dentro de las imágenes convencionales, existen muchas formas fundamentalmente diferentes de producir contraste, denominadas "mecanismos de contraste de imagen". El contraste puede surgir de las diferencias de posición a posición en el grosor o la densidad ("contraste de masa-grosor"), número atómico ("contraste Z", en referencia a la abreviatura común Z para atómico número), estructura cristalina u orientación ("contraste cristalográfico" o "contraste de difracción"), los ligeros cambios de fase de la mecánica cuántica que los átomos individuales producen en los electrones que pasan a través de ellos ("contraste de fase"), la energía perdida por los electrones al atravesar la muestra ("imágenes de espectro") y más. Cada mecanismo le brinda al usuario un tipo diferente de información, dependiendo no solo del mecanismo de contraste, sino también de cómo se usa el microscopio: la configuración de las lentes, las aperturas y los detectores. Lo que esto significa es que un TEM es capaz de devolver una variedad extraordinaria de información de resolución atómica y nanométrica, en casos ideales, revelando no solo dónde están todos los átomos, sino también qué tipos de átomos son y cómo están unidos entre sí. Por esta razón, TEM se considera una herramienta esencial para la nanociencia tanto en el campo biológico como en el de materiales.
El primer TEM fue demostrado por Max Knoll y Ernst Ruska en 1931, y este grupo desarrolló el primer TEM con una resolución mayor que la de la luz en 1933 y el primer TEM comercial en 1939. En 1986, Ruska recibió el Premio Nobel en física para el desarrollo de la microscopía electrónica de transmisión.
Historia
Desarrollo inicial
En 1873, Ernst Abbe propuso que la capacidad de resolver los detalles de un objeto estaba limitada aproximadamente por la longitud de onda de la luz utilizada en las imágenes o unos pocos cientos de nanómetros para los microscopios de luz visible. Los desarrollos en microscopios ultravioleta (UV), liderados por Köhler y Rohr, aumentaron el poder de resolución en un factor de dos. Sin embargo, esto requería costosas ópticas de cuarzo, debido a la absorción de UV por el vidrio. Se creía que no era posible obtener una imagen con información submicrométrica debido a esta restricción de longitud de onda.
En 1858, Plücker observó la desviación de los "rayos catódicos" (electrones) por campos magnéticos. Este efecto fue utilizado por Ferdinand Braun en 1897 para construir dispositivos de medición de osciloscopio de rayos catódicos (CRO) simples. En 1891, Riecke notó que los rayos catódicos podían enfocarse mediante campos magnéticos, lo que permitía diseños de lentes electromagnéticos simples. En 1926, Hans Busch publicó un trabajo que ampliaba esta teoría y demostró que la ecuación del fabricante de lentes podía, con las suposiciones apropiadas, aplicarse a los electrones.
En 1928, en la Universidad Técnica de Berlín, Adolf Matthias, profesor de tecnología de alto voltaje e instalaciones eléctricas, nombró a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores para avanzar en el diseño de CRO. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, incluidos Ernst Ruska y Bodo von Borries. El equipo de investigación trabajó en el diseño de lentes y la colocación de columnas CRO, para optimizar los parámetros para construir mejores CRO y fabricar componentes ópticos de electrones para generar imágenes de bajo aumento (casi 1:1). En 1931, el grupo generó con éxito imágenes ampliadas de rejillas de malla colocadas sobre la apertura del ánodo. El dispositivo usó dos lentes magnéticas para lograr mayores aumentos, posiblemente creando el primer microscopio electrónico. En ese mismo año, Reinhold Rudenberg, director científico de la empresa Siemens, patentó un microscopio electrónico de lente electrostática.
Mejorar la resolución
En ese momento, se entendía que los electrones eran partículas cargadas de materia; la naturaleza ondulatoria de los electrones no se comprendió por completo hasta la tesis doctoral de Louis de Broglie en 1924. El grupo de investigación de Knoll desconocía esta publicación hasta 1932, cuando se dieron cuenta de que la longitud de onda de los electrones de De Broglie era de muchos órdenes de magnitud. más pequeño que el de la luz, lo que teóricamente permite obtener imágenes a escalas atómicas. (Incluso para electrones con una energía cinética de solo 1 voltio, la longitud de onda ya es tan corta como 1,23 nm). En abril de 1932, Ruska sugirió la construcción de un nuevo microscopio electrónico para obtener imágenes directas de las muestras insertadas en el microscopio, en lugar de una malla simple. cuadrículas o imágenes de aberturas. Con este dispositivo se logró una difracción satisfactoria y una imagen normal de una lámina de aluminio. Sin embargo, el aumento alcanzable fue menor que con el microscopio óptico. En septiembre de 1933 se lograron aumentos superiores a los disponibles con un microscopio óptico con imágenes de fibras de algodón adquiridas rápidamente antes de ser dañadas por el haz de electrones.
En ese momento, había aumentado el interés por el microscopio electrónico, con otros grupos, como el de Paul Anderson y Kenneth Fitzsimmons de la Universidad Estatal de Washington y el de Albert Prebus y James Hillier de la Universidad de Toronto, quienes construyeron el primer TEM en América del Norte en 1935 y 1938, respectivamente, avanzando continuamente en el diseño de TEM.
La investigación continuó en el microscopio electrónico en Siemens en 1936, donde el objetivo de la investigación era el desarrollo y la mejora de las propiedades de imágenes TEM, particularmente con respecto a las muestras biológicas. En ese momento, se estaban fabricando microscopios electrónicos para grupos específicos, como el "EM1" dispositivo utilizado en el Laboratorio Nacional de Física del Reino Unido. En 1939, se instaló el primer microscopio electrónico comercial en el departamento de Física de IG Farben-Werke. El trabajo adicional en el microscopio electrónico se vio obstaculizado por la destrucción de un nuevo laboratorio construido en Siemens por un ataque aéreo, así como por la muerte de dos de los investigadores, Heinz Müller y Friedrick Krause durante la Segunda Guerra Mundial.
Más investigación
Después de la Segunda Guerra Mundial, Ruska reanudó su trabajo en Siemens, donde continuó desarrollando el microscopio electrónico, produciendo el primer microscopio con un aumento de 100k. La estructura fundamental de este diseño de microscopio, con óptica de preparación de haz de múltiples etapas, todavía se usa en los microscopios modernos. La comunidad mundial de microscopía electrónica avanzó con la fabricación de microscopios electrónicos en Manchester, Reino Unido, EE. UU. (RCA), Alemania (Siemens) y Japón (JEOL). La primera conferencia internacional en microscopía electrónica fue en Delft en 1949, con más de cien asistentes. Las conferencias posteriores incluyeron la "Primera" conferencia internacional en París, 1950 y luego en Londres en 1954.
Con el desarrollo de TEM, la técnica asociada de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) se volvió a investigar y permaneció sin desarrollar hasta la década de 1970, con Albert Crewe en la Universidad de Chicago desarrollando la pistola de emisión de campo y agregando un objetivo de alta calidad. lente para crear el STEM moderno. Usando este diseño, Crewe demostró la capacidad de obtener imágenes de átomos utilizando imágenes anulares de campo oscuro. Crewe y sus colaboradores de la Universidad de Chicago desarrollaron la fuente de emisión de electrones de campo frío y construyeron un STEM capaz de visualizar átomos pesados individuales en sustratos de carbono delgados.
Antecedentes
Electrones
Teóricamente, la resolución máxima, d, que se puede obtener con un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de los fotones (λ) y la apertura numérica NA de el sistema.
- d=λ λ 2npecado α α .. λ λ 2NA{displaystyle d={frac {fnMicrosoft} }{2nsin alpha }approx {frac {lambda }{2,{textrm {}}}
donde n es el índice de refracción del medio en el que está trabajando la lente y α es el semiángulo máximo del cono de luz que puede entrar en la lente (ver apertura numérica). Los científicos de principios del siglo XX teorizaron formas de eludir las limitaciones de la longitud de onda relativamente grande de la luz visible (longitudes de onda de 400 a 700 nanómetros) mediante el uso de electrones. Como toda la materia, los electrones tienen propiedades tanto de onda como de partícula (onda de materia), y sus propiedades ondulatorias significan que un haz de electrones puede enfocarse y difractarse como la luz. La longitud de onda de los electrones está relacionada con su energía cinética a través de la ecuación de De Broglie, que dice que la longitud de onda es inversamente proporcional al momento. Teniendo en cuenta los efectos relativistas (como en un TEM, la velocidad de un electrón es una fracción sustancial de la velocidad de la luz, c), la longitud de onda es
- λ λ e=h2m0E()1+E2m0c2){displaystyle lambda {fnMicroc {fnMicroc}}}}}
donde, h es la constante de Planck, m0 es la masa en reposo de un electrón y E es la energía cinética del electrón acelerado.
Fuente de electrones
Desde arriba hacia abajo, el TEM consta de una fuente de emisión o cátodo, que puede ser un filamento de tungsteno, un monocristal de hexaboruro de lantano (LaB6) o un cañón de emisión de campo. La pistola está conectada a una fuente de alto voltaje (típicamente ~ 100-300 kV) y emite electrones ya sea por emisión de electrones de campo o termoiónica en el vacío. En el caso de una fuente termoiónica, la fuente de electrones se monta en un cilindro de Wehnelt para proporcionar un enfoque preliminar de los electrones emitidos en un haz y al mismo tiempo estabilizar la corriente mediante un circuito de retroalimentación pasiva. En cambio, una fuente de emisión de campo utiliza electrodos electrostáticos llamados extractor, supresor y lente de pistola, con diferentes voltajes en cada uno, para controlar la forma y la intensidad del campo eléctrico cerca de la punta afilada. La combinación del cátodo y estos primeros elementos de lentes electrostáticas se denomina colectivamente "cañón de electrones". Después de que sale de la pistola, el haz normalmente se acelera hasta que alcanza su voltaje final y entra en la siguiente parte del microscopio: el sistema de lentes del condensador. Estas lentes superiores del TEM luego enfocan aún más el haz de electrones al tamaño y ubicación deseados en la muestra.
La manipulación del haz de electrones se realiza mediante dos efectos físicos. La interacción de los electrones con un campo magnético hará que los electrones se muevan de acuerdo con la regla de la mano izquierda, lo que permitirá que los electroimanes manipulen el haz de electrones. Además, los campos electrostáticos pueden hacer que los electrones se desvíen en un ángulo constante. El acoplamiento de dos desviaciones en direcciones opuestas con un pequeño espacio intermedio permite la formación de un cambio en la trayectoria del haz, lo que permite el desplazamiento del haz.
Óptica
Las lentes de un TEM son lo que le da su flexibilidad de modos operativos y la capacidad de enfocar haces hasta la escala atómica y ampliarlos para obtener una imagen. Una lente generalmente está hecha de una bobina de solenoide casi rodeada de materiales ferromagnéticos diseñados para concentrar el campo magnético de la bobina en una forma precisa y confinada. Cuando un electrón entra y sale de este campo magnético, gira en espiral alrededor de las líneas curvas del campo magnético de una manera que actúa de manera muy similar a como lo hace una lente de vidrio ordinaria para la luz: es una lente convergente. Pero, a diferencia de una lente de vidrio, una lente magnética puede cambiar muy fácilmente su poder de enfoque ajustando la corriente que pasa a través de las bobinas.
Las aperturas son igualmente importantes para las lentes. Estos son agujeros circulares en tiras delgadas de metal pesado. Algunos tienen un tamaño y una posición fijos y desempeñan funciones importantes para limitar la generación de rayos X y mejorar el rendimiento del vacío. Otros se pueden cambiar libremente entre varios tamaños diferentes y se pueden ajustar sus posiciones. Las aperturas variables después de la muestra permiten al usuario seleccionar el rango de posiciones espaciales o ángulos de dispersión de electrones que se utilizarán en la formación de una imagen o un patrón de difracción.
El sistema óptico-electrónico también incluye deflectores y estigmatizadores, generalmente hechos de pequeños electroimanes. Los deflectores permiten controlar de forma independiente la posición y el ángulo del haz en la posición de la muestra y también aseguran que los haces permanezcan cerca de los centros de baja aberración de cada lente en las pilas de lentes. Los estigmatizadores compensan las imperfecciones y aberraciones leves que causan astigmatismo: una lente que tiene una fuerza focal diferente en diferentes direcciones.
Por lo general, un TEM consta de tres etapas de lentes. Las etapas son las lentes del condensador, las lentes del objetivo y las lentes del proyector. Las lentes del condensador son responsables de la formación del haz primario, mientras que las lentes del objetivo enfocan el haz que atraviesa la muestra (en el modo de exploración STEM, también hay lentes del objetivo sobre la muestra para hacer que el haz de electrones incidente sea convergente). Las lentes del proyector se utilizan para expandir el haz sobre la pantalla de fósforo u otro dispositivo de imagen, como una película. La ampliación del TEM se debe a la relación de las distancias entre la muestra y la lente del objetivo' plano de la imagen Las configuraciones ópticas de TEM difieren significativamente con la implementación, ya que los fabricantes usan configuraciones de lentes personalizadas, como en instrumentos con corrección de aberración esférica, o TEM que usan filtrado de energía para corregir la aberración cromática electrónica.
Reciprocidad
El teorema de reciprocidad óptica, o principio de reciprocidad de Helmholtz, generalmente es válido para electrones dispersos elásticamente, como suele ser el caso en condiciones operativas estándar de TEM. El teorema establece que la amplitud de onda en algún punto B como resultado de la fuente puntual de electrones A sería la misma que la amplitud en A debido a una fuente puntual equivalente ubicada en B. En pocas palabras, la función de onda para electrones enfocados a través de cualquier serie de componentes ópticos que incluyen solo campos escalares (es decir, no magnéticos) serán exactamente equivalentes si la fuente de electrones y el punto de observación se invierten. R
La reciprocidad se utiliza para comprender la microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) en el contexto familiar de TEM y para obtener e interpretar imágenes mediante STEM.
Display y detectores
Los factores clave al considerar la detección de electrones incluyen la eficiencia cuántica de detección (DQE), la función de dispersión de puntos (PSF), la función de transferencia de modulación (MTF), el tamaño de píxel y el tamaño de matriz, el ruido, la velocidad de lectura de datos y la dureza de la radiación.
Los sistemas de imágenes en un TEM consisten en una pantalla de fósforo, que puede estar hecha de sulfuro de zinc en partículas finas (10-100 μm), para que el operador las observe directamente, y un sistema de grabación de imágenes, como una película fotográfica, una pantalla YAG dopada. CCD acoplados u otro detector digital. Por lo general, estos dispositivos se pueden quitar o insertar en la trayectoria del haz según sea necesario. (La película fotográfica ya no se usa). El primer informe sobre el uso de un detector de dispositivo acoplado por carga (CCD) para TEM fue en 1982, pero la tecnología no encontró un uso generalizado hasta finales de la década de 1990 o principios de la de 2000. Los sensores monolíticos de píxeles activos (MAPS) también se utilizaron en TEM. Los detectores CMOS, que son más rápidos y más resistentes al daño por radiación que los CCD, se han utilizado para TEM desde 2005. A principios de la década de 2010, un mayor desarrollo de la tecnología CMOS permitió la detección de recuentos de electrones individuales ("modo de conteo";). Estos detectores de electrones directos están disponibles en Gatan, FEI, Quantum Detectors y Direct Electron.
Componentes
Un TEM se compone de varios componentes, que incluyen un sistema de vacío en el que viajan los electrones, una fuente de emisión de electrones para generar la corriente de electrones, una serie de lentes electromagnéticos y placas electrostáticas. Los dos últimos permiten al operador guiar y manipular el haz según sea necesario. También se requiere un dispositivo que permita la inserción, el movimiento dentro y la extracción de especímenes de la trayectoria del haz. Los dispositivos de imagen se utilizan posteriormente para crear una imagen de los electrones que salen del sistema.
Sistema de vacío
Para aumentar el camino libre medio de la interacción electrón-gas, se evacua un TEM estándar a presiones bajas, típicamente del orden de 10−4 Pa. La necesidad de esto es doble: primero, el tener en cuenta la diferencia de voltaje entre el cátodo y la tierra sin generar un arco y, en segundo lugar, reducir la frecuencia de colisión de electrones con átomos de gas a niveles insignificantes; este efecto se caracteriza por el camino libre medio. Los componentes de TEM, como los soportes de muestras y los cartuchos de película, deben insertarse o reemplazarse de forma rutinaria, lo que requiere un sistema con la capacidad de volver a evacuar periódicamente. Como tal, los TEM están equipados con múltiples sistemas de bombeo y esclusas de aire y no están sellados al vacío de forma permanente.
El sistema de vacío para evacuar un TEM a un nivel de presión de funcionamiento consta de varias etapas. Inicialmente, se logra un vacío bajo o mínimo con una bomba de paletas rotativas o bombas de diafragma que establecen una presión suficientemente baja para permitir el funcionamiento de una bomba turbomolecular o de difusión que establece el alto nivel de vacío necesario para las operaciones. Para permitir que la bomba de bajo vacío no requiera un funcionamiento continuo, mientras que las bombas turbomoleculares funcionan continuamente, el lado de vacío de una bomba de baja presión puede conectarse a cámaras que alojan los gases de escape de la bomba turbomolecular. Las secciones del TEM se pueden aislar mediante el uso de aberturas limitadoras de presión para permitir diferentes niveles de vacío en áreas específicas, como un vacío mayor de 10−4 a 10−7 Pa o superior en el cañón de electrones en TEM de alta resolución o de emisión de campo.
Los TEM de alto voltaje requieren vacíos ultraaltos en el rango de 10−7 a 10−9 Pa para evitar la generación de un arco eléctrico, particularmente en el cátodo TEM. Como tal, para los TEM de mayor voltaje puede operar un tercer sistema de vacío, con la pistola aislada de la cámara principal ya sea por válvulas de compuerta o una abertura de bombeo diferencial: un pequeño orificio que evita la difusión de moléculas de gas en el área de la pistola de vacío superior más rápido de lo que lo hacen. puede ser bombeado. Para estas presiones muy bajas, se utiliza una bomba de iones o un material getter.
Un vacío deficiente en un TEM puede causar varios problemas que van desde la deposición de gas dentro del TEM sobre la muestra mientras se observa en un proceso conocido como deposición inducida por haz de electrones hasta daños más graves en el cátodo causados por descargas eléctricas. El uso de una trampa fría para adsorber los gases sublimados en las proximidades de la muestra elimina en gran medida los problemas de vacío causados por la sublimación de la muestra.
Etapa de muestra
Los diseños de platina de muestras TEM incluyen cámaras de aire para permitir la inserción del portamuestras en el vacío con una pérdida mínima de vacío en otras áreas del microscopio. Los portamuestras sostienen un tamaño estándar de cuadrícula de muestra o una muestra autoportante. Los tamaños de rejilla TEM estándar tienen un diámetro de 3,05 mm, con un grosor y un tamaño de malla que van desde unos pocos hasta 100 μm. La muestra se coloca en el área de la malla que tiene un diámetro de aproximadamente 2,5 mm. Los materiales de rejilla habituales son cobre, molibdeno, oro o platino. Esta cuadrícula se coloca en el portamuestras, que se empareja con la platina de la muestra. Existe una amplia variedad de diseños de escenarios y soportes, según el tipo de experimento que se realice. Además de las cuadrículas de 3,05 mm, a veces, aunque rara vez, se utilizan cuadrículas de 2,3 mm. Estas rejillas se usaron particularmente en las ciencias minerales donde se puede requerir un alto grado de inclinación y donde el material de muestra puede ser extremadamente raro. Las muestras transparentes a los electrones tienen un grosor generalmente inferior a 100 nm, pero este valor depende del voltaje de aceleración.
Una vez insertada en un TEM, la muestra debe manipularse para ubicar la región de interés para el haz, como en la difracción de grano único, en una orientación específica. Para adaptarse a esto, la plataforma TEM permite el movimiento de la muestra en el plano XY, el ajuste de altura Z y, por lo general, una sola dirección de inclinación paralela al eje de los soportes de entrada lateral. La rotación de muestras puede estar disponible en soportes y etapas de difracción especializados. Algunos TEM modernos brindan la capacidad de dos ángulos de movimiento de inclinación ortogonal con diseños de portamuestras especializados llamados portamuestras de doble inclinación. Algunos diseños de escenarios, como los de entrada superior o de inserción vertical que alguna vez fueron comunes para los estudios TEM de alta resolución, pueden simplemente tener disponible la traducción X-Y. Los criterios de diseño de las etapas de TEM son complejos, debido a los requisitos simultáneos de restricciones mecánicas y electronópticas, y hay modelos especializados disponibles para diferentes métodos.
Se requiere una etapa TEM para tener la capacidad de sostener una muestra y ser manipulada para llevar la región de interés a la trayectoria del haz de electrones. Dado que el TEM puede funcionar en una amplia gama de aumentos, la platina debe ser al mismo tiempo muy resistente a la deriva mecánica, con requisitos de deriva tan bajos como unos pocos nm/minuto mientras puede moverse varios μm/minuto, con una precisión de reposicionamiento del orden de nanómetros. Los diseños anteriores de TEM lograban esto con un conjunto complejo de dispositivos mecánicos de reducción, lo que permitía al operador controlar con precisión el movimiento del escenario mediante varias varillas giratorias. Los dispositivos modernos pueden usar diseños de escenarios eléctricos, usando engranajes de tornillo junto con motores paso a paso, proporcionando al operador una entrada de escenario basada en computadora, como un joystick o trackball.
Existen dos diseños principales para escenarios en un TEM, la versión de entrada lateral y la de entrada superior. Cada diseño debe acomodar el soporte correspondiente para permitir la inserción de la muestra sin dañar la delicada óptica TEM ni permitir que el gas ingrese a los sistemas TEM bajo vacío.
El más común es el soporte de entrada lateral, donde la muestra se coloca cerca de la punta de una varilla larga de metal (latón o acero inoxidable), con la muestra colocada plana en un pequeño orificio. A lo largo de la varilla hay varios anillos de vacío de polímero para permitir la formación de un sello de vacío de calidad suficiente, cuando se inserta en la platina. Por lo tanto, la platina está diseñada para acomodar la barra, colocando la muestra entre o cerca de la lente del objetivo, dependiendo del diseño del objetivo. Cuando se inserta en el escenario, el soporte de entrada lateral tiene su punta contenida dentro del vacío TEM, y la base se presenta a la atmósfera, la esclusa de aire formada por los anillos de vacío.
Los procedimientos de inserción para soportes de TEM de entrada lateral suelen implicar la rotación de la muestra para activar microinterruptores que inician la evacuación de la esclusa de aire antes de que la muestra se inserte en la columna de TEM.
El segundo diseño es el soporte de entrada superior que consta de un cartucho de varios cm de largo con un orificio perforado en el eje del cartucho. La muestra se carga en el orificio, posiblemente usando un pequeño anillo roscado para mantener la muestra en su lugar. Este cartucho se inserta en una esclusa de aire con el orificio perpendicular al eje óptico TEM. Cuando está sellada, la esclusa de aire se manipula para empujar el cartucho de manera que el cartucho caiga en su lugar, donde el orificio del orificio se alinea con el eje del haz, de modo que el haz se desplace por el orificio del cartucho y entre en la muestra. Por lo general, estos diseños no se pueden inclinar sin bloquear la trayectoria del haz o interferir con la lente del objetivo.
Pistola de electrones
El cañón de electrones está formado por varios componentes: el filamento, un circuito de polarización, una tapa Wehnelt y un ánodo de extracción. Al conectar el filamento a la fuente de alimentación del componente negativo, los electrones pueden ser "bombeados" desde el cañón de electrones hasta la placa del ánodo y la columna TEM, completando así el circuito. El cañón está diseñado para crear un haz de electrones que sale del ensamblaje en un ángulo determinado, conocido como semiángulo de divergencia del cañón, α. Al construir el cilindro de Wehnelt de tal manera que tenga una carga negativa más alta que el propio filamento, los electrones que salen del filamento de manera divergente son, bajo una operación adecuada, forzados a un patrón convergente cuyo tamaño mínimo es el diámetro de cruce de la pistola.
La densidad de corriente de emisión termoiónica, J, se puede relacionar con la función de trabajo del material emisor a través de la ley de Richardson
- J=AT2exp ()− − CCPR CCPR kT),{displaystyle J=AT^{2}exp left({frac {-fnMicrosoft Sans Serif}
donde A es la constante de Richardson, Φ es la función de trabajo y T es la temperatura del material.
Esta ecuación muestra que para lograr suficiente densidad de corriente es necesario calentar el emisor, teniendo cuidado de no causar daño por la aplicación de calor excesivo. Por esta razón, se requieren materiales con un punto de fusión alto, como el tungsteno, o aquellos con una función de trabajo baja (LaB6) para el filamento de la pistola. Además, tanto el hexaboruro de lantano como las fuentes termoiónicas de tungsteno deben calentarse para lograr la emisión termoiónica, esto se puede lograr mediante el uso de una pequeña tira resistiva. Para evitar el choque térmico, a menudo se impone un retraso en la aplicación de corriente a la punta, para evitar que los gradientes térmicos dañen el filamento, el retraso suele ser de unos segundos para LaB6 y significativamente menor para tungsteno.
Lente de electrones
Las lentes electrónicas están diseñadas para actuar de forma similar a una lente óptica, enfocando electrones paralelos a una distancia focal constante. Las lentes de electrones pueden funcionar electrostática o magnéticamente. La mayoría de las lentes de electrones para TEM utilizan bobinas electromagnéticas para generar una lente convexa. El campo producido por la lente debe ser radialmente simétrico, ya que la desviación de la simetría radial de la lente magnética provoca aberraciones como el astigmatismo y empeora la aberración esférica y cromática. Las lentes de electrones se fabrican con aleaciones de hierro, hierro-cobalto o níquel-cobalto, como permalloy. Estos se seleccionan por sus propiedades magnéticas, como saturación magnética, histéresis y permeabilidad.
Los componentes incluyen el yugo, la bobina magnética, los polos, la pieza polar y el circuito de control externo. La pieza polar debe fabricarse de manera muy simétrica, ya que proporciona las condiciones de contorno para el campo magnético que forma la lente. Las imperfecciones en la fabricación de la pieza polar pueden inducir severas distorsiones en la simetría del campo magnético, lo que induce distorsiones que finalmente limitarán las lentes. capacidad de reproducir el plano del objeto. Las dimensiones exactas del espacio, el diámetro interno y la conicidad de la pieza polar, así como el diseño general de la lente, a menudo se obtienen mediante un análisis de elementos finitos del campo magnético, considerando las limitaciones térmicas y eléctricas del diseño.
Las bobinas que producen el campo magnético se encuentran dentro del yugo de la lente. Las bobinas pueden contener una corriente variable, pero generalmente usan voltajes altos y, por lo tanto, requieren un aislamiento significativo para evitar cortocircuitos en los componentes de la lente. Se colocan distribuidores térmicos para asegurar la extracción del calor generado por la energía perdida por resistencia de los devanados de la bobina. Los devanados pueden enfriarse con agua, utilizando un suministro de agua fría para facilitar la eliminación del alto trabajo térmico.
Aberturas
Las aberturas son placas metálicas anulares, a través de las cuales se pueden excluir los electrones que están más allá de una distancia fija del eje óptico. Estos consisten en un pequeño disco metálico que es lo suficientemente grueso para evitar que los electrones pasen a través del disco, al tiempo que permite los electrones axiales. Este permiso de electrones centrales en un TEM provoca dos efectos simultáneamente: en primer lugar, las aperturas disminuyen la intensidad del haz a medida que los electrones se filtran del haz, lo que puede ser deseable en el caso de muestras sensibles al haz. En segundo lugar, este filtrado elimina los electrones que se dispersan en ángulos altos, lo que puede deberse a procesos no deseados, como la aberración cromática o esférica, o debido a la difracción de la interacción dentro de la muestra.
Las aperturas son aperturas fijas dentro de la columna, como en la lente del condensador, o son aperturas móviles, que pueden insertarse o retirarse de la trayectoria del haz, o moverse en el plano perpendicular a la trayectoria del haz. Los conjuntos de apertura son dispositivos mecánicos que permiten la selección de diferentes tamaños de apertura, que el operador puede utilizar para equilibrar la intensidad y el efecto de filtrado de la apertura. Los conjuntos de apertura suelen estar equipados con micrómetros para mover la apertura, necesarios durante la calibración óptica.
Métodos de imagen
Los métodos de generación de imágenes en TEM utilizan la información contenida en las ondas de electrones que salen de la muestra para formar una imagen. Las lentes del proyector permiten el posicionamiento correcto de esta distribución de ondas de electrones en el sistema de visualización. La intensidad observada, I, de la imagen, suponiendo una calidad suficientemente alta del dispositivo de imagen, se puede aproximar como proporcional al valor absoluto al cuadrado promediado en el tiempo de la amplitud de las funciones de onda de electrones, donde la onda que forma el haz de salida se denota por Ψ.
- I()x)=kt1− − t0∫ ∫ t0t1Ψ Ψ Ψ Ψ Alternativa Alternativa dt{displaystyle I(x)={frac {k}{t_{1}-t_{0}}int ¿Qué? Psi Psi ^{mathrm {},dt}
Diferentes métodos de obtención de imágenes, por lo tanto, intentan modificar las ondas de electrones que salen de la muestra de una manera que proporcione información sobre la muestra o el haz mismo. De la ecuación anterior, se puede deducir que la imagen observada depende no solo de la amplitud del haz, sino también de la fase de los electrones, aunque los efectos de fase a menudo pueden ignorarse a aumentos más bajos. Las imágenes de mayor resolución requieren muestras más delgadas y energías más altas de los electrones incidentes, lo que significa que ya no se puede considerar que la muestra absorba electrones (es decir, a través del efecto de la ley de Beer). En cambio, la muestra se puede modelar como un objeto que no cambia la amplitud de la función de onda del electrón entrante, sino que modifica la fase de la onda entrante; en este modelo, la muestra se conoce como un objeto de fase pura. Para especímenes suficientemente delgados, los efectos de fase dominan la imagen, lo que complica el análisis de las intensidades observadas. Para mejorar el contraste de la imagen, el TEM se puede operar con un ligero desenfoque para mejorar el contraste, debido a la convolución de la función de transferencia de contraste del TEM, que normalmente disminuiría el contraste si la muestra no fuera un objeto de fase débil.
La figura de la derecha muestra los dos modos de operación básicos de TEM: modos de imagen y difracción. En ambos casos, la muestra se ilumina con el haz paralelo, formado por la conformación del haz de electrones con el sistema de lentes condensadoras y apertura condensadora. Después de la interacción con la muestra, en la superficie de salida de la muestra existen dos tipos de electrones: no dispersos (que corresponderán al haz central brillante en el patrón de difracción) y electrones dispersos (que cambian sus trayectorias debido a la interacción con el material).
En el modo de imagen, la apertura del objetivo se inserta en un plano focal posterior (BFP) de la lente del objetivo (donde se forman los puntos de difracción). Si usa la apertura del objetivo para seleccionar solo el haz central, los electrones transmitidos pasan a través de la apertura mientras que todos los demás están bloqueados y se obtiene una imagen de campo brillante (imagen BF). Si permitimos la señal de un haz difractado, se recibe una imagen de campo oscuro (imagen DF). La señal seleccionada se amplía y se proyecta en una pantalla (o en una cámara) con la ayuda de lentes intermedias y de proyector. Se obtiene así una imagen de la muestra.
En el modo de difracción, se puede utilizar una apertura de área seleccionada para determinar con mayor precisión el área de la muestra desde la que se mostrará la señal. Cambiando la fuerza de la corriente a la lente intermedia, el patrón de difracción se proyecta en una pantalla. La difracción es una herramienta muy poderosa para hacer una reconstrucción celular y determinar la orientación del cristal.
Formación de contraste
El contraste entre dos áreas adyacentes en una imagen TEM se puede definir como la diferencia en las densidades de electrones en el plano de la imagen. Debido a la dispersión del haz incidente por la muestra, la amplitud y la fase de la onda de electrones cambian, lo que resulta en contraste de amplitud y contraste de fase , correspondientemente. La mayoría de las imágenes tienen ambos componentes de contraste.
Amplitud-contraste se obtiene debido a la eliminación de algunos electrones antes del plano de la imagen. Durante su interacción con la muestra, algunos de los electrones se perderán debido a la absorción, o debido a la dispersión en ángulos muy altos más allá de la limitación física del microscopio, o serán bloqueados por la apertura del objetivo. Si bien las dos primeras pérdidas se deben a la construcción del espécimen y del microscopio, el operador puede utilizar la apertura del objetivo para mejorar el contraste.
La figura de la derecha muestra una imagen TEM (a) y el patrón de difracción correspondiente (b) de una película policristalina de platino tomada sin una apertura de objetivo. Para mejorar el contraste en la imagen TEM, se debe reducir el número de haces dispersos visibles en el patrón de difracción. Esto se puede hacer seleccionando un área determinada en el plano focal posterior, como solo el haz central o un haz difractado específico (ángulo), o combinaciones de dichos haces. Al seleccionar intencionalmente una apertura del objetivo que solo permite que el haz no difractado pase más allá del plano focal posterior (y hacia el plano de la imagen): se crea una imagen de campo brillante (BF) (c), mientras que si el haz central, no difractado, el haz difractado está bloqueado: se pueden obtener imágenes de campo oscuro (DF) como las que se muestran en (d-e). Las imágenes DF (d-e) se obtuvieron seleccionando los haces difractados indicados en el patrón de difracción con círculos (b) utilizando una apertura en el plano focal posterior. Los granos cuyos electrones se dispersan en estos puntos de difracción aparecen más brillantes. Más detalles sobre la formación del contraste de difracción se dan más adelante.
Hay dos tipos de contraste de amplitud: contraste de masa-espesor y difracción. Primero, consideremos el contraste masa-espesor. Cuando el haz ilumina dos áreas vecinas con baja masa (o espesor) y alta masa (o espesor), la región más pesada dispersa electrones en ángulos mayores. Estos electrones fuertemente dispersos son bloqueados en el modo BF TEM por la apertura del objetivo. Como resultado, las regiones más pesadas aparecen más oscuras en las imágenes BF (tienen una intensidad baja). El contraste masa-espesor es más importante para los materiales amorfos no cristalinos.
El contraste de difracción ocurre debido a una orientación cristalográfica específica de un grano. En tal caso, el cristal está orientado de manera que existe una alta probabilidad de difracción. El contraste de difracción proporciona información sobre la orientación de los cristales en una muestra policristalina, así como otra información como los defectos. Tenga en cuenta que en caso de que exista contraste de difracción, el contraste no puede interpretarse como debido a variaciones de masa o espesor.
Contraste de difracción
Las muestras pueden exhibir un contraste de difracción, por lo que el haz de electrones experimenta una difracción que, en el caso de una muestra cristalina, dispersa los electrones en ubicaciones discretas en el plano focal posterior. Mediante la colocación de aperturas en el plano focal posterior, es decir, la apertura del objetivo, se pueden seleccionar (o excluir) los vectores reticulares recíprocos deseados, por lo que solo se proyectarán partes de la muestra que hacen que los electrones se dispersen hacia los reflejos seleccionados. en el aparato de imagen.
Si los reflejos que se seleccionan no incluyen el haz no disperso (que aparecerá en el punto focal de la lente), entonces la imagen aparecerá oscura donde no haya dispersión de muestra al pico seleccionado, como tal región sin un espécimen aparecerá oscuro. Esto se conoce como una imagen de campo oscuro.
Los TEM modernos a menudo están equipados con portamuestras que permiten al usuario inclinar la muestra en un rango de ángulos para obtener condiciones de difracción específicas, y las aberturas colocadas sobre la muestra permiten al usuario seleccionar electrones que de otro modo se difractarían en una dirección particular de entrar en el espécimen.
Las aplicaciones de este método incluyen la identificación de defectos de red en cristales. Al seleccionar cuidadosamente la orientación de la muestra, es posible no solo determinar la posición de los defectos sino también determinar el tipo de defecto presente. Si la muestra está orientada de modo que un plano en particular esté ligeramente inclinado hacia el ángulo de difracción más fuerte (conocido como el ángulo de Bragg), cualquier distorsión del plano del cristal que incline localmente el plano hacia el ángulo de Bragg producirá variaciones de contraste particularmente fuertes. Sin embargo, los defectos que producen solo desplazamiento de átomos que no inclinan el cristal hacia el ángulo de Bragg (es decir, desplazamientos paralelos al plano del cristal) producirán un contraste más débil.
Contraste de fase
La estructura cristalina también se puede investigar mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM), también conocida como contraste de fase. Cuando se usa una fuente de emisión de campo y una muestra de espesor uniforme, las imágenes se forman debido a las diferencias en la fase de las ondas de electrones, que es causada por la interacción de la muestra. La formación de la imagen viene dada por el módulo complejo de los haces de electrones entrantes. Como tal, la imagen no solo depende de la cantidad de electrones que golpean la pantalla, lo que hace que la interpretación directa de las imágenes de contraste de fase sea un poco más compleja. Sin embargo, este efecto se puede utilizar con ventaja, ya que se puede manipular para proporcionar más información sobre la muestra, como en técnicas de recuperación de fase compleja.
Difracción
Como se indicó anteriormente, al ajustar las lentes magnéticas de modo que el plano focal posterior de la lente en lugar del plano de imagen se coloque en el aparato de imagen, se puede generar un patrón de difracción. Para muestras cristalinas delgadas, esto produce una imagen que consiste en un patrón de puntos en el caso de un solo cristal, o una serie de anillos en el caso de un material sólido policristalino o amorfo. Para la caja de un solo cristal, el patrón de difracción depende de la orientación de la muestra y de la estructura de la muestra iluminada por el haz de electrones. Esta imagen proporciona al investigador información sobre las simetrías del grupo espacial en el cristal y la orientación del cristal en la trayectoria del haz. Esto normalmente se hace sin usar ninguna información excepto la posición en la que aparecen los puntos de difracción y las simetrías de la imagen observada.
Los patrones de difracción pueden tener un amplio rango dinámico y, para muestras cristalinas, pueden tener intensidades mayores que las que puede registrar CCD. Como tal, los TEM aún pueden estar equipados con cartuchos de película con el fin de obtener estas imágenes, ya que la película es un detector de un solo uso.
El análisis de los patrones de difracción más allá de la posición del punto puede ser complejo, ya que la imagen es sensible a una serie de factores, como el grosor y la orientación de la muestra, el desenfoque de la lente del objetivo y la aberración esférica y cromática. Aunque es posible la interpretación cuantitativa del contraste que se muestra en las imágenes de red, es intrínsecamente complicada y puede requerir una simulación y un análisis por computadora extensos, como el análisis de múltiples cortes de electrones.
También es posible un comportamiento más complejo en el plano de difracción, con fenómenos como las líneas de Kikuchi que surgen de la difracción múltiple dentro de la red cristalina. En la difracción de electrones de haz convergente (CBED), donde se produce un frente de onda de electrones no paralelo, es decir, convergente, al concentrar el haz de electrones en una sonda fina en la superficie de la muestra, la interacción del haz convergente puede proporcionar información más allá de los datos estructurales, como la muestra. espesor.
Espectroscopia de pérdida de energía de electrones (EELS)
Usando la técnica avanzada de espectroscopía de pérdida de energía de electrones (EELS), para TEM debidamente equipados, los electrones se pueden separar en un espectro basado en su velocidad (que está estrechamente relacionada con su energía cinética y, por lo tanto, la pérdida de energía del haz de energía).), utilizando dispositivos basados en sectores magnéticos conocidos como espectrómetros EEL. Estos dispositivos permiten la selección de valores de energía particulares, que pueden asociarse con la forma en que el electrón ha interactuado con la muestra. Por ejemplo, diferentes elementos en una muestra dan como resultado diferentes energías de electrones en el haz después de la muestra. Esto normalmente da como resultado una aberración cromática; sin embargo, este efecto puede, por ejemplo, usarse para generar una imagen que proporcione información sobre la composición elemental, basada en la transición atómica durante la interacción electrón-electrón.
Los espectrómetros EELS a menudo se pueden operar tanto en modo espectroscópico como de imagen, lo que permite el aislamiento o el rechazo de haces dispersados elásticamente. Como para muchas imágenes, la dispersión inelástica incluirá información que puede no ser de interés para el investigador, lo que reduce las señales observables de interés, las imágenes EELS se pueden usar para mejorar el contraste en las imágenes observadas, incluido el campo brillante y la difracción, al rechazar los componentes no deseados.
Imágenes tridimensionales
Como los portamuestras de TEM normalmente permiten la rotación de una muestra en un ángulo deseado, se pueden obtener múltiples vistas de la misma muestra girando el ángulo de la muestra a lo largo de un eje perpendicular al haz. Al tomar múltiples imágenes de una sola muestra TEM en diferentes ángulos, generalmente en incrementos de 1°, se obtiene un conjunto de imágenes conocido como "serie de inclinación" se puede recoger Esta metodología fue propuesta en la década de 1970 por Walter Hoppe. En condiciones de contraste puramente de absorción, este conjunto de imágenes se puede utilizar para construir una representación tridimensional de la muestra.
La reconstrucción se logra mediante un proceso de dos pasos: las primeras imágenes se alinean para tener en cuenta los errores en el posicionamiento de una muestra; tales errores pueden ocurrir debido a la vibración o la deriva mecánica. Los métodos de alineación utilizan algoritmos de registro de imágenes, como los métodos de autocorrelación para corregir estos errores. En segundo lugar, utilizando un algoritmo de reconstrucción, como una retroproyección filtrada, los segmentos de imagen alineados se pueden transformar a partir de un conjunto de imágenes bidimensionales, Ij(x, y), a una sola imagen tridimensional, I'j(x, y, z). Esta imagen tridimensional es de particular interés cuando se requiere información morfológica; se pueden realizar más estudios utilizando algoritmos informáticos, como isosuperficies y corte de datos para analizar los datos.
Como las muestras de TEM normalmente no se pueden ver con una rotación completa de 180°, las imágenes observadas suelen tener una "falta de cuña" de datos, que al utilizar métodos de retroproyección basados en Fourier disminuye el rango de frecuencias resolubles en la reconstrucción tridimensional. Mejoras mecánicas, como inclinación multieje (dos series de inclinación del mismo espécimen realizadas en direcciones ortogonales) y tomografía cónica (en la que el espécimen primero se inclina a un ángulo fijo dado y luego se visualiza en incrementos de rotación angulares iguales a través de una rotación completa en el plano de la cuadrícula de la muestra) se puede utilizar para limitar el impacto de los datos que faltan en la morfología de la muestra observada. Mediante la molienda de haz de iones enfocados, se ha propuesto una nueva técnica que utiliza una muestra en forma de pilar y un soporte de tomografía en el eje dedicado para realizar una rotación de 180° de la muestra dentro de la pieza polar de la lente del objetivo en TEM. Usando tales arreglos, es posible la tomografía electrónica cuantitativa sin la cuña faltante. Además, existen técnicas numéricas que pueden mejorar los datos recopilados.
Todos los métodos mencionados anteriormente implican el registro de series de inclinación de un campo de muestra determinado. Esto inevitablemente da como resultado la suma de una alta dosis de electrones reactivos a través de la muestra y la consiguiente destrucción de detalles finos durante el registro. Por lo tanto, la técnica de imágenes de dosis baja (dosis mínima) se aplica regularmente para mitigar este efecto. La formación de imágenes de dosis baja se realiza desviando la iluminación y las regiones de formación de imágenes simultáneamente lejos del eje óptico para obtener imágenes de una región adyacente al área que se va a registrar (la región de dosis alta). Esta área se mantiene centrada durante la inclinación y se vuelve a enfocar antes de grabar. Durante la grabación, las desviaciones se eliminan para que el área de interés quede expuesta al haz de electrones solo durante el tiempo requerido para la formación de imágenes. Una mejora de esta técnica (para objetos que descansan sobre una película de sustrato inclinada) es tener dos regiones simétricas fuera del eje para enfocar, seguidas de establecer el enfoque en el promedio de los dos valores de enfoque de dosis alta antes de registrar el área de interés de dosis baja..
Las variantes no tomográficas de este método, conocidas como análisis de una sola partícula, usan imágenes de múltiples (con suerte) objetos idénticos en diferentes orientaciones para producir los datos de imagen necesarios para la reconstrucción tridimensional. Si los objetos no tienen orientaciones preferidas significativas, este método no sufre de la cuña (o cono) de datos faltantes que acompaña a los métodos tomográficos ni incurre en una dosis de radiación excesiva, sin embargo, asume que los diferentes objetos fotografiados pueden tratarse como si el Los datos 3D generados a partir de ellos surgieron de un solo objeto estable.
Preparación de muestras
La preparación de muestras en TEM puede ser un procedimiento complejo. Las muestras de TEM deben tener menos de 100 nanómetros de espesor para un TEM convencional. A diferencia de la radiación de rayos X o de neutrones, los electrones del haz interactúan rápidamente con la muestra, un efecto que aumenta aproximadamente con el cuadrado del número atómico (Z2). Las muestras de alta calidad tendrán un grosor comparable al camino libre medio de los electrones que viajan a través de las muestras, que puede ser de solo unas pocas decenas de nanómetros. La preparación de especímenes TEM es específica para el material bajo análisis y el tipo de información que se obtendrá del espécimen.
Los materiales que tienen dimensiones lo suficientemente pequeñas para ser transparentes a los electrones, como sustancias en polvo, organismos pequeños, virus o nanotubos, se pueden preparar rápidamente depositando una muestra diluida que contiene el espécimen en películas sobre rejillas de soporte. Las muestras biológicas se pueden incrustar en resina para resistir el alto vacío en la cámara de muestra y permitir cortar el tejido en secciones delgadas transparentes a los electrones. La muestra biológica se puede teñir con un material de tinción negativo como acetato de uranilo para bacterias y virus o, en el caso de secciones incrustadas, la muestra se puede teñir con metales pesados, incluido el tetróxido de osmio. Alternativamente, las muestras se pueden mantener a temperaturas de nitrógeno líquido después de incrustarlas en hielo vítreo. En la ciencia de los materiales y la metalurgia, las muestras generalmente pueden soportar el alto vacío, pero aún así deben prepararse como una lámina delgada o grabarse para que una parte de la muestra sea lo suficientemente delgada como para que penetre el haz. Las restricciones sobre el grosor del material pueden estar limitadas por la sección transversal de dispersión de los átomos que componen el material.
Seccionamiento de tejido
El tejido biológico a menudo se incrusta en un bloque de resina y luego se diluye a menos de 100 nm en un ultramicrótomo. El bloque de resina se fractura cuando pasa sobre el filo de un cuchillo de vidrio o de diamante. Este método se utiliza para obtener muestras delgadas y mínimamente deformadas que permiten la observación de la ultraestructura del tejido. Las muestras inorgánicas, como el aluminio, también se pueden incrustar en resinas y seccionarse ultradelgadamente de esta manera, utilizando vidrio recubierto, zafiro o cuchillos de diamante de ángulo más grande. Para evitar la acumulación de carga en la superficie de la muestra cuando se visualiza en el TEM, las muestras de tejido deben recubrirse con una capa delgada de material conductor, como el carbono.
Tinción de muestras
Las muestras TEM de tejidos biológicos necesitan tinciones de alto número atómico para mejorar el contraste. La mancha absorbe los electrones del haz o dispersa parte del haz de electrones que, de lo contrario, se proyecta sobre el sistema de formación de imágenes. Se pueden usar compuestos de metales pesados como osmio, plomo, uranio u oro (en el marcaje con inmunooro) antes de la observación TEM para depositar selectivamente átomos densos en electrones en o sobre la muestra en la región celular o proteica deseada. Este proceso requiere una comprensión de cómo los metales pesados se unen a estructuras celulares y tejidos biológicos específicos.
Fresado mecánico
El pulido mecánico también se usa para preparar muestras para obtener imágenes en el TEM. El pulido debe realizarse con una alta calidad, para garantizar un espesor de muestra constante en toda la región de interés. Se puede usar un compuesto de pulido de nitruro de boro cúbico o de diamante en las etapas finales del pulido para eliminar cualquier rasguño que pueda causar fluctuaciones de contraste debido a la variación del grosor de la muestra. Incluso después de una molienda mecánica cuidadosa, es posible que se requieran métodos finos adicionales, como el grabado iónico, para realizar la etapa final de adelgazamiento.
Grabado químico
Ciertas muestras se pueden preparar mediante grabado químico, en particular las muestras metálicas. Estas muestras se diluyen con un grabador químico, como un ácido, para preparar la muestra para la observación TEM. Los dispositivos para controlar el proceso de dilución pueden permitir que el operador controle el voltaje o la corriente que pasa a través de la muestra y pueden incluir sistemas para detectar cuándo la muestra se ha diluido a un nivel suficiente de transparencia óptica.
Grabado iónico
El grabado iónico es un proceso de pulverización catódica que puede eliminar cantidades muy finas de material. Se utiliza para realizar un pulido de acabado de muestras pulidas por otros medios. El grabado iónico utiliza un gas inerte que pasa a través de un campo eléctrico para generar una corriente de plasma que se dirige a la superficie de la muestra. Las energías de aceleración de gases como el argón suelen ser de unos pocos kilovoltios. La muestra se puede rotar para promover un pulido uniforme de la superficie de la muestra. La tasa de pulverización catódica de tales métodos es del orden de decenas de micrómetros por hora, lo que limita el método a un pulido extremadamente fino.
Recientemente se ha demostrado que el grabado iónico con gas argón es capaz de limar estructuras de pilas MTJ en una capa específica que luego se resuelve atómicamente. Las imágenes TEM tomadas en vista de planta en lugar de sección transversal revelan que la capa de MgO dentro de MTJ contiene una gran cantidad de límites de grano que pueden estar disminuyendo las propiedades de los dispositivos.
Molienda de iones (FIB)
Más recientemente, se han utilizado métodos de haz de iones enfocados para preparar muestras. FIB es una técnica relativamente nueva para preparar muestras delgadas para el examen TEM a partir de muestras más grandes. Debido a que FIB se puede usar para micromecanizar muestras con mucha precisión, es posible fresar membranas muy delgadas de un área específica de interés en una muestra, como un semiconductor o un metal. A diferencia de la pulverización catódica de iones de gas inerte, FIB utiliza iones de galio significativamente más energéticos y puede alterar la composición o estructura del material a través de la implantación de galio.
Transferencia asistida por nanocables
Para una introducción mínima de tensión y flexión en las muestras de microscopía electrónica de transmisión (TEM) (láminas, películas delgadas y otras muestras mecánicas y sensibles al haz), cuando se transfieren dentro de un haz de iones enfocado (FIB), se pueden usar nanocables metálicos flexibles. unido a un micromanipulador típicamente rígido.
Las principales ventajas de este método incluyen una reducción significativa del tiempo de preparación de la muestra (soldadura y corte rápidos de nanocables con una corriente de haz baja) y la minimización de la flexión inducida por el estrés, la contaminación por Pt y el daño del haz de iones. Esta técnica es particularmente adecuada para la preparación de muestras de microscopía electrónica in situ.
Replicación
Las muestras también se pueden replicar usando una película de acetato de celulosa, la película se recubre posteriormente con un metal pesado como el platino, la película original se disuelve y la réplica se refleja en el TEM. Se utilizan variaciones de la técnica de réplica tanto para materiales como para muestras biológicas. En ciencia de materiales, un uso común es para examinar la superficie de fractura fresca de aleaciones metálicas.
Modificaciones
Las capacidades del TEM se pueden ampliar aún más con etapas y detectores adicionales, a veces incorporados en el mismo microscopio.
Escaneo de TEM
Un TEM puede transformarse en un microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM) mediante la adición de un sistema que traza un haz convergente a través de la muestra para formar la imagen, cuando se combina con detectores adecuados. Las bobinas de exploración se utilizan para desviar el haz, por ejemplo, mediante un desplazamiento electrostático del haz, donde el haz se recoge utilizando un detector de corriente como una copa de Faraday, que actúa como un contador de electrones directo. Al correlacionar el conteo de electrones con la posición del haz de exploración (conocido como 'sonda'), se puede medir el componente transmitido del haz. Los componentes no transmitidos pueden obtenerse mediante la inclinación del haz o mediante el uso de detectores anulares de campo oscuro.
Fundamentalmente, TEM y STEM están vinculados a través de la reciprocidad de Helmholtz. Un STEM es un TEM en el que la fuente de electrones y el punto de observación se han cambiado en relación con la dirección de viaje del haz de electrones. Vea los diagramas de rayos en la figura de la derecha. El instrumento STEM se basa efectivamente en la misma configuración óptica que un TEM, pero funciona cambiando la dirección de viaje de los electrones (o invirtiendo el tiempo) durante la operación de un TEM. En lugar de usar una apertura para controlar los electrones detectados, como en TEM, un STEM usa varios detectores con ángulos de recolección que pueden ajustarse según los electrones que el usuario quiera capturar.
Microscopio electrónico de bajo voltaje
Un microscopio electrónico de bajo voltaje (LVEM) funciona con un voltaje de aceleración de electrones relativamente bajo, entre 5 y 25 kV. Algunos de estos pueden ser una combinación de SEM, TEM y STEM en un solo instrumento compacto. El bajo voltaje aumenta el contraste de la imagen, lo que es especialmente importante para las muestras biológicas. Este aumento en el contraste reduce significativamente, o incluso elimina, la necesidad de teñir. Las resoluciones de unos pocos nm son posibles en los modos TEM, SEM y STEM. La baja energía del haz de electrones significa que los imanes permanentes se pueden usar como lentes y, por lo tanto, se puede usar una columna en miniatura que no requiere enfriamiento.
Crio-TEM
La microscopía electrónica de transmisión criogénica (Cryo-TEM) utiliza un TEM con un portamuestras capaz de mantener la muestra a temperaturas de nitrógeno líquido o helio líquido. Esto permite obtener imágenes de especímenes preparados en hielo vítreo, la técnica de preparación preferida para obtener imágenes de moléculas individuales o conjuntos macromoleculares, obtener imágenes de interfaces de electrolito sólido vitrificado e imágenes de materiales que son volátiles en alto vacío a temperatura ambiente, como el azufre.
TEM ambiental/in situ
Los experimentos in situ también se pueden realizar en TEM utilizando cámaras de muestras con bombeo diferencial o soportes especializados. Los tipos de experimentos in situ incluyen el estudio de nanomateriales, especímenes biológicos, reacciones químicas de moléculas, microscopía electrónica de fase líquida y pruebas de deformación de materiales.
TEM in situ de alta temperatura
Muchas transformaciones de fase ocurren durante el calentamiento. Además, el engrosamiento y el crecimiento del grano, junto con otros procesos relacionados con la difusión, ocurren más rápidamente a temperaturas elevadas, donde se mejora la cinética, lo que permite la observación de fenómenos relacionados bajo microscopía electrónica de transmisión dentro de escalas de tiempo razonables. Esto también permite la observación de fenómenos que ocurren a temperaturas elevadas y desaparecen o no se conservan uniformemente en muestras ex situ.
El TEM de alta temperatura presenta varios desafíos adicionales que deben abordarse en la mecánica de los soportes de alta temperatura, incluidos, entre otros, la corrección de deriva, la medición de temperatura y la resolución espacial reducida a expensas de soportes más complejos.
La desviación de la muestra en el TEM es linealmente proporcional a la diferencia de temperatura entre la habitación y el soporte. Con temperaturas tan altas como 1500C en los soportes modernos, las muestras pueden experimentar una deriva y un desplazamiento vertical (abultamiento) significativos, lo que requiere ajustes continuos de enfoque o etapa, lo que induce pérdida de resolución y deriva mecánica. Laboratorios y fabricantes individuales han desarrollado software junto con sistemas de enfriamiento avanzados para corregir la deriva térmica en función de la temperatura prevista en la cámara de muestras. Estos sistemas suelen tardar entre 30 minutos y muchas horas en estabilizarse. Si bien se ha logrado un progreso significativo, no se ha realizado ningún accesorio TEM universal para tener en cuenta la deriva a temperaturas elevadas.
Un desafío adicional para muchos de estos soportes especializados es conocer la temperatura de la muestra local. Muchos soportes de alta temperatura utilizan un filamento de tungsteno para calentar localmente la muestra. La ambigüedad en la temperatura en los calentadores de horno (alambre W) con termopares surge del contacto térmico entre el horno y la rejilla TEM; complicado por los gradientes de temperatura a lo largo de la muestra causados por la variación de la conductividad térmica con diferentes muestras y materiales de rejilla. Con diferentes soportes, tanto comerciales como fabricados en laboratorio, se encuentran disponibles diferentes métodos para crear la calibración de temperatura. Los fabricantes como Gatan utilizan la pirometría IR para medir los gradientes de temperatura en toda su muestra. Un método aún mejor para calibrar es la espectroscopia Raman, que mide la temperatura local del polvo de Si en ventanas transparentes a los electrones y calibra cuantitativamente la pirometría IR. Estas medidas tienen una precisión garantizada dentro del 5%. Los laboratorios de investigación también han realizado sus propias calibraciones en soportes comerciales. Los investigadores del NIST utilizaron la espectroscopia Raman para mapear el perfil de temperatura de una muestra en una cuadrícula TEM y lograr mediciones muy precisas para mejorar su investigación. De manera similar, un grupo de investigación en Alemania utilizó la difracción de rayos X para medir ligeros cambios en el espacio de la red causados por cambios en la temperatura para calcular la temperatura exacta en el soporte. Este proceso requirió una calibración cuidadosa y una óptica TEM exacta. Otros ejemplos incluyen el uso de EELS para medir la temperatura local usando el cambio de densidad del gas y los cambios de resistividad.
La resolución óptima en un TEM se logra cuando las aberraciones esféricas se corrigen con lentes de objetivo. Sin embargo, debido a la geometría de la mayoría de los TEM, la inserción de grandes soportes in situ requiere que el usuario comprometa la lente del objetivo y soporte las aberraciones esféricas. Por lo tanto, existe un compromiso entre el ancho del espacio entre la pieza polar y la resolución espacial por debajo de 0,1 nm. Los grupos de investigación de varias instituciones han tratado de superar las aberraciones esféricas mediante el uso de monocromadores para lograr una resolución de 0,05 nm con un espacio entre piezas polares de 5 mm.
TEM mecánica in situ
(feminine)La alta resolución de TEM permite monitorear la muestra en cuestión en una escala de longitud que va desde cientos de nanómetros hasta varios angstroms. Esto permite la visualización de deformaciones tanto elásticas como plásticas a través de campos de deformación, así como el movimiento de defectos cristalográficos, como distorsiones de red y movimiento de dislocación. Al observar simultáneamente los fenómenos de deformación y medir la respuesta mecánica in situ, es posible conectar la información de las pruebas nanomecánicas con modelos que describen tanto la sutileza como la complejidad de cómo los materiales responden al estrés y la tensión. Las propiedades del material y la precisión de los datos obtenidos de tales pruebas nanomecánicas están determinadas en gran medida por el soporte de deformación mecánica que se utiliza. Los soportes de deformación actuales tienen la capacidad de realizar pruebas de tracción, nanoindentación, pruebas de compresión, pruebas de corte y pruebas de flexión en materiales.
Soportes mecánicos clásicos
Uno de los pioneros de los soportes clásicos fue el Dr. Heinz G.F. Wilsdorf, quien realizó una prueba de tracción dentro de un TEM en 1958. En un experimento típico, las muestras de TEM transparentes a los electrones se cortan a la forma y se pegan a una rejilla deformable. Los avances en micromanipuladores también han permitido la prueba de tracción de nanocables y películas delgadas. La rejilla deformable se une al soporte de tracción clásico que estira la muestra utilizando un eje largo y rígido unido a una caja de engranajes helicoidales accionada por un motor eléctrico ubicado en una carcasa fuera del TEM. Normalmente, las velocidades de deformación oscilan entre 10 nm/s y 10 μm/s. Los soportes hechos a medida que amplían la actuación de tensión simple han permitido realizar pruebas de flexión con un soporte de flexión y pruebas de cizallamiento con un soporte de muestras de cizalla. Las propiedades típicas de las muestras medidas en estos experimentos son el límite elástico, el módulo elástico, el módulo de corte, la resistencia a la tracción, la resistencia a la flexión y la resistencia al corte. Para estudiar las propiedades mecánicas dependientes de la temperatura de las muestras de TEM, el soporte se puede enfriar a través de un dedo frío conectado a un depósito de nitrógeno líquido. Para experimentos de alta temperatura, la muestra TEM también se puede calentar a través de un horno miniaturizado o un láser que normalmente puede alcanzar los 1000 °C.
Soportes de nano-indentación
Los soportes de nanoindentación realizan una prueba de dureza en el material en cuestión presionando una punta dura en una superficie plana pulida y midiendo la fuerza aplicada y el desplazamiento resultante en la muestra TEM a través de un cambio en la capacitancia entre una referencia y un móvil. placa electrostática adherida a la punta. Las propiedades típicas de las muestras medidas son la dureza y el módulo elástico. Aunque la nanoindentación era posible desde principios de la década de 1980, su investigación con un TEM se informó por primera vez en 2001, cuando se investigó una muestra de aluminio depositada en una cuña de silicio. Para los experimentos de nanoindentación, las muestras de TEM suelen tener forma de cuñas utilizando un pulidor de trípode, una ventana de barra en H o un micronanopilar que utiliza un haz de iones enfocado para crear suficiente espacio para presionar una punta en la ubicación transparente de electrones deseada. Las puntas del indentador suelen ser de tipo punzón plano, piramidal o en forma de cuña alargadas en la dirección z. Las puntas piramidales ofrecen una alta precisión del orden de 10 nm, pero sufren el deslizamiento de la muestra, mientras que los indentadores de cuña tienen una mayor contracción para evitar el deslizamiento, pero requieren un análisis de elementos finitos para modelar la tensión transmitida, ya que la gran área de contacto con la muestra TEM hace que esto sea casi una compresión. prueba.
Sistemas microelectromecánicos (MEM)
Los soportes basados en microsistemas electromecánicos (MEM) brindan una plataforma económica y personalizable para realizar pruebas mecánicas en muestras que antes eran difíciles de trabajar, como micropilares, nanocables y películas delgadas. Los MEM pasivos se utilizan como dispositivos simples de empujar para tirar para pruebas mecánicas in situ. Por lo general, se usa un soporte de nanoindentación para aplicar una fuerza de empuje en el sitio de la indentación. Usando una geometría de brazos, esta fuerza de empuje se traduce en una fuerza de tracción en un par de almohadillas de tracción a las que se une la muestra. Por lo tanto, una compresión aplicada en el exterior de los MEM se traduce en una tensión en el espacio central donde se encuentra la muestra TEM. Vale la pena señalar que la curva fuerza-desplazamiento resultante debe corregirse realizando la misma prueba en MEM vacíos sin la muestra de TEM para tener en cuenta la rigidez de los MEM vacíos. Las dimensiones y la rigidez de los MEM se pueden modificar para realizar pruebas de tracción en muestras de diferentes tamaños con diferentes cargas. Para suavizar el proceso de actuación, se han desarrollado MEM activos con actuadores y sensores integrados. Estos dispositivos funcionan aplicando un estrés usando energía eléctrica y midiendo la tensión usando variaciones de capacitancia. También se han desarrollado MEM accionados electrostáticamente para adaptarse a fuerzas aplicadas muy bajas en el rango de 1 a 100 nN.
Gran parte de la investigación actual se centra en el desarrollo de portamuestras que puedan realizar pruebas mecánicas mientras crean un estímulo ambiental, como cambios de temperatura, velocidades de deformación variables y diferentes entornos de gas. Además, la aparición de detectores de alta resolución permite monitorear el movimiento de las dislocaciones y las interacciones con otros defectos y empujar los límites de las mediciones de tensión subnanométricas. Las mediciones TEM mecánicas in situ se combinan de forma rutinaria con otras mediciones TEM estándar, como EELS y XEDS, para lograr una comprensión integral de la estructura y las propiedades de la muestra.
TEM corregido por aberración
Los TEM de investigación modernos pueden incluir correctores de aberraciones para reducir la cantidad de distorsión en la imagen. También se pueden utilizar monocromadores de haz incidente que reducen la dispersión de energía del haz de electrones incidente a menos de 0,15 eV. Los principales fabricantes de TEM con corrección de aberraciones incluyen JEOL, Hitachi High-technologies, FEI Company y NION.
TEM ultrarrápido y dinámico
Es posible alcanzar una resolución temporal mucho mayor que la velocidad de lectura de los detectores de electrones con el uso de electrones pulsados. Los pulsos se pueden producir modificando la fuente de electrones para permitir la fotoemisión activada por láser o mediante la instalación de un supresor de haz ultrarrápido. Este enfoque se denomina microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida cuando se utiliza iluminación estroboscópica de sonda de bomba: se forma una imagen mediante la acumulación de muchos pulsos de electrones ultracortos (normalmente de cientos de femtosegundos) con un retraso de tiempo fijo entre la llegada del pulso de electrones y la excitación de la muestra. Por otro lado, el uso de pulsos de electrones únicos o de una secuencia corta con un número suficiente de electrones para formar una imagen de cada pulso se denomina microscopía electrónica de transmisión dinámica. La resolución temporal de hasta cientos de femtosegundos y la resolución espacial comparable a la disponible con una fuente de emisión de campo Schottky es posible en TEM ultrarrápido, pero la técnica solo puede generar imágenes de procesos reversibles que pueden activarse reproduciblemente millones de veces. Dynamic TEM puede resolver procesos irreversibles hasta decenas de nanosegundos y decenas de nanómetros.
La técnica fue pionera a principios de la década de 2000 en laboratorios de Alemania (Universidad Técnica de Berlín) y de EE. UU. (Caltech y Laboratorio Nacional Lawrence Livermore ). Ultrafast TEM y Dynamic TEM han hecho posible la investigación en tiempo real de numerosos fenómenos físicos y químicos a nanoescala.
Una variante interesante de la técnica de microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida es la microscopía electrónica de campo cercano inducida por fotones (PINEM). Este último se basa en el acoplamiento inelástico entre electrones y fotones en presencia de una superficie o una nanoestructura. Este método permite investigar campos electromagnéticos a nanoescala que varían en el tiempo en un microscopio electrónico, así como dar forma dinámica a las propiedades de onda del haz de electrones.
Limitaciones
Hay una serie de inconvenientes en la técnica TEM. Muchos materiales requieren una preparación extensa de la muestra para producir una muestra lo suficientemente delgada como para ser transparente a los electrones, lo que hace que el análisis TEM sea un proceso relativamente lento con un bajo rendimiento de muestras. La estructura de la muestra también puede cambiar durante el proceso de preparación. Además, el campo de visión es relativamente pequeño, lo que plantea la posibilidad de que la región analizada no sea característica de toda la muestra. Existe la posibilidad de que la muestra resulte dañada por el haz de electrones, especialmente en el caso de materiales biológicos.
Límites de resolución
El límite de resolución que se puede obtener en un TEM se puede describir de varias maneras y, por lo general, se lo conoce como el límite de información del microscopio. Un valor comúnmente utilizado es un valor de corte de la función de transferencia de contraste, una función que generalmente se cotiza en el dominio de la frecuencia para definir la reproducción de frecuencias espaciales de objetos en el plano del objeto por la óptica del microscopio. Una frecuencia de corte, qmax, para la función de transferencia se puede aproximar con la siguiente ecuación, donde Cs es el coeficiente de aberración esférica y λ es la longitud de onda del electrón:
- qmax=10,677()Csλ λ 3)1/4.{displaystyle q_{max }={frac {1}{0.67(C_{s}lambda ^{3})^{1/4}}}}
Para un microscopio de 200 kV, con aberraciones esféricas parcialmente corregidas ("al tercer orden") y un valor Cs de 1 µm, un valor de corte teórico podría ser 1/qmax = 42 pm. El mismo microscopio sin corrector tendría Cs = 0,5 mm y, por lo tanto, un límite de 200 pm. Las aberraciones esféricas se suprimen al tercer o quinto orden en la "aberración corregida" microscopios Sin embargo, su resolución está limitada por la geometría de la fuente de electrones y el brillo y las aberraciones cromáticas en el sistema de lentes del objetivo.
La representación en el dominio de la frecuencia de la función de transferencia de contraste a menudo puede tener una naturaleza oscilatoria, que se puede ajustar ajustando el valor focal de la lente del objetivo. Esta naturaleza oscilatoria implica que el microscopio refleja fielmente algunas frecuencias espaciales, mientras que otras se suprimen. Al combinar múltiples imágenes con diferentes frecuencias espaciales, el uso de técnicas como la reconstrucción de series focales se puede utilizar para mejorar la resolución del TEM de manera limitada. La función de transferencia de contraste puede, hasta cierto punto, aproximarse experimentalmente a través de técnicas como imágenes transformadas de Fourier de material amorfo, como el carbono amorfo.
Más recientemente, los avances en el diseño del corrector de aberraciones han podido reducir las aberraciones esféricas y lograr una resolución inferior a 0,5 Ångströms (50 pm) con aumentos superiores a 50 millones de veces. La resolución mejorada permite obtener imágenes de átomos más ligeros que dispersan los electrones de manera menos eficiente, como los átomos de litio en los materiales de las baterías de litio. La capacidad de determinar la posición de los átomos dentro de los materiales ha convertido al HRTEM en una herramienta indispensable para la investigación y el desarrollo de nanotecnología en muchos campos, incluida la catálisis heterogénea y el desarrollo de dispositivos semiconductores para electrónica y fotónica.
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