Microscopio de fuerza atómica

La microscopía de fuerza atómica (AFM) o microscopía de fuerza de barrido (SFM) es un tipo de microscopía de sonda de barrido (SPM) de muy alta resolución, con una resolución demostrada del orden de fracciones de un nanómetro, más de 1000 veces mejor que la difracción óptica límite.

Visión general

La microscopía de fuerza atómica (AFM) es un tipo de microscopía de sonda de barrido (SPM), con una resolución demostrada del orden de fracciones de un nanómetro, más de 1000 veces mejor que el límite de difracción óptica. La información se recopila "sintiendo" o "tocando" la superficie con una sonda mecánica. Los elementos piezoeléctricos que facilitan movimientos pequeños pero exactos y precisos en el comando (electrónico) permiten un escaneo preciso. A pesar del nombre, el microscopio de fuerza atómica no utiliza la fuerza nuclear.

Habilidades

El AFM tiene tres habilidades principales: medición de fuerza, imágenes topográficas y manipulación.

En la medición de fuerza, los AFM se pueden utilizar para medir las fuerzas entre la sonda y la muestra en función de su separación mutua. Esto se puede aplicar para realizar espectroscopia de fuerza, para medir las propiedades mecánicas de la muestra, como el módulo de Young de la muestra, una medida de rigidez.

Para obtener imágenes, la reacción de la sonda a las fuerzas que la muestra le impone se puede utilizar para formar una imagen de la forma tridimensional (topografía) de una superficie de muestra a alta resolución. Esto se logra escaneando en forma de trama la posición de la muestra con respecto a la punta y registrando la altura de la sonda que corresponde a una interacción constante entre la sonda y la muestra (consulte § Imagen topográfica para obtener más información). La topografía de la superficie se muestra comúnmente como un diagrama de pseudocolor.

Aunque la publicación inicial sobre microscopía de fuerza atómica de Binnig, Quate y Gerber en 1986 especulaba sobre la posibilidad de lograr una resolución atómica, era necesario superar profundos desafíos experimentales antes de demostrar en 1993 la resolución atómica de defectos y bordes escalonados en condiciones ambientales (líquidas). por Ohnesorge y Binnig. La verdadera resolución atómica de la superficie de silicio 7x7 (las imágenes atómicas de esta superficie obtenidas por STM habían convencido a la comunidad científica de la espectacular resolución espacial de la microscopía de túnel de barrido) tuvo que esperar un poco más antes de que Giessibl la mostrara.

En la manipulación, las fuerzas entre la punta y la muestra también se pueden usar para cambiar las propiedades de la muestra de forma controlada. Ejemplos de esto incluyen la manipulación atómica, la litografía con sonda de exploración y la estimulación local de las células.

Simultáneamente con la adquisición de imágenes topográficas, otras propiedades de la muestra pueden medirse localmente y mostrarse como una imagen, a menudo con una resolución similarmente alta. Ejemplos de tales propiedades son propiedades mecánicas como la rigidez o la fuerza de adhesión y propiedades eléctricas como la conductividad o el potencial superficial. De hecho, la mayoría de las técnicas de SPM son extensiones de AFM que utilizan esta modalidad.

Otras tecnologías de microscopía

La principal diferencia entre la microscopía de fuerza atómica y las tecnologías de la competencia, como la microscopía óptica y la microscopía electrónica, es que AFM no utiliza lentes ni haces de irradiación. Por lo tanto, no sufre una limitación en la resolución espacial debido a la difracción y la aberración, y no es necesario preparar un espacio para guiar el haz (creando un vacío) y teñir la muestra.

Hay varios tipos de microscopía de barrido, incluida la microscopía de sonda de barrido (que incluye AFM, microscopía de túnel de barrido (STM) y microscopio óptico de barrido de campo cercano (SNOM/NSOM), microscopía STED (STED) y microscopía electrónica de barrido y AFM electroquímico, EC -AFM). Aunque SNOM y STED utilizan luz visible, infrarroja o incluso de terahercios para iluminar la muestra, su resolución no está limitada por el límite de difracción.

Configuración

La figura 3 muestra un AFM, que normalmente consta de las siguientes características. Los números entre paréntesis corresponden a las características numeradas en la Fig. 3. Las direcciones de las coordenadas están definidas por el sistema de coordenadas (0).

El pequeño voladizo con forma de resorte (1) es llevado por el soporte (2). Opcionalmente, un elemento piezoeléctrico (típicamente hecho de un material cerámico) (3) hace oscilar el voladizo (1). La punta afilada (4) se fija al extremo libre del voladizo (1). El detector (5) registra la deflexión y el movimiento del voladizo (1). La muestra (6) se monta en la plataforma de muestra (8). Un accionamiento xyz (7) permite desplazar la muestra (6) y la plataforma de muestra (8) en las direcciones x, y y z con respecto al vértice de la punta (4). Aunque la Fig. 3 muestra el accionamiento acoplado a la muestra, el accionamiento también se puede acoplar a la punta, o se pueden acoplar accionamientos independientes a ambos, ya que es el desplazamiento relativo de la muestra y la punta lo que debe controlarse. Los controladores y el trazador no se muestran en la Fig. 3.

Según la configuración descrita anteriormente, la interacción entre la punta y la muestra, que puede ser un fenómeno a escala atómica, se traduce en cambios del movimiento del voladizo, que es un fenómeno a macroescala. Se pueden usar varios aspectos diferentes del movimiento del voladizo para cuantificar la interacción entre la punta y la muestra, más comúnmente el valor de la desviación, la amplitud de una oscilación impuesta del voladizo o el cambio en la frecuencia de resonancia del voladizo (consulte la sección Modos de imagen).

Detector

El detector (5) de AFM mide la deflexión (desplazamiento con respecto a la posición de equilibrio) del voladizo y la convierte en una señal eléctrica. La intensidad de esta señal será proporcional al desplazamiento del voladizo.

Se pueden utilizar varios métodos de detección, por ejemplo, interferometría, palancas ópticas, el método piezoeléctrico y detectores basados ​​en STM (consulte la sección "Medición de deflexión en voladizo AFM").

Formación de imagen

Esta sección se aplica específicamente a las imágenes en modo § Contacto. Para otros modos de imagen, el proceso es similar, excepto que la "desviación" debe reemplazarse por la variable de retroalimentación apropiada.

Cuando se usa el AFM para obtener imágenes de una muestra, la punta se pone en contacto con la muestra y la muestra se escanea en forma de trama a lo largo de una cuadrícula x-y (fig. 4). Más comúnmente, se emplea un circuito de retroalimentación electrónico para mantener constante la fuerza de la muestra de la sonda durante el escaneo. Este circuito de retroalimentación tiene la desviación del voladizo como entrada y su salida controla la distancia a lo largo del eje z entre el soporte de la sonda (2 en la fig. 3) y el soporte de la muestra (8 en la fig. 3). Siempre que la punta permanezca en contacto con la muestra y la muestra se escanee en el plano x–y, las variaciones de altura en la muestra cambiarán la deflexión del voladizo. Luego, la retroalimentación ajusta la altura del soporte de la sonda para que la deflexión se restablezca a un valor definido por el usuario (el punto de ajuste). Un circuito de retroalimentación correctamente ajustado ajusta la separación entre la muestra y el soporte de forma continua durante el movimiento de exploración, de modo que la desviación permanece aproximadamente constante. En esta situación, la salida de retroalimentación iguala la topografía de la superficie de la muestra con un pequeño error.

Históricamente, se ha utilizado un método de operación diferente, en el que la distancia de soporte de la sonda de muestra se mantiene constante y no está controlada por una retroalimentación (mecanismo servo). En este modo, generalmente denominado "modo de altura constante", la desviación del voladizo se registra como una función de la posición x–y de la muestra. Siempre que la punta esté en contacto con la muestra, la desviación corresponde a la topografía de la superficie. Este método ahora se usa con menos frecuencia porque las fuerzas entre la punta y la muestra no están controladas, lo que puede generar fuerzas lo suficientemente altas como para dañar la punta o la muestra.Sin embargo, es una práctica común registrar la desviación incluso cuando se escanea en "modo de fuerza constante", con retroalimentación. Esto revela el pequeño error de seguimiento de los comentarios y, a veces, puede revelar características que los comentarios no pudieron ajustar.

Las señales AFM, como la altura de la muestra o la desviación del voladizo, se registran en una computadora durante el escaneo x-y. Se trazan en una imagen de pseudocolor, en la que cada píxel representa una posición x-y en la muestra y el color representa la señal registrada.

Historia

El AFM fue inventado por científicos de IBM en 1985. El precursor del AFM, el microscopio de efecto túnel (STM), fue desarrollado por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer a principios de la década de 1980 en IBM Research – Zúrich, un desarrollo que les valió el Premio Nobel de 1986. Premio de Física. Binnig inventó el microscopio de fuerza atómica y la primera implementación experimental fue realizada por Binnig, Quate y Gerber en 1986.

El primer microscopio de fuerza atómica disponible en el mercado se introdujo en 1989. El AFM es una de las principales herramientas para obtener imágenes, medir y manipular la materia a nanoescala.

Aplicaciones

El AFM se ha aplicado a problemas en una amplia gama de disciplinas de las ciencias naturales, incluida la física del estado sólido, la ciencia y la tecnología de semiconductores, la ingeniería molecular, la química y la física de polímeros, la química de superficies, la biología molecular, la biología celular y la medicina.

Las aplicaciones en el campo de la física del estado sólido incluyen (a) la identificación de átomos en una superficie, (b) la evaluación de las interacciones entre un átomo específico y sus átomos vecinos, y (c) el estudio de los cambios en las propiedades físicas que surgen de los cambios en un arreglo atómico a través de la manipulación atómica.

En biología molecular, AFM se puede utilizar para estudiar la estructura y las propiedades mecánicas de los complejos y ensamblajes de proteínas. Por ejemplo, AFM se ha utilizado para obtener imágenes de microtúbulos y medir su rigidez.

En biología celular, AFM se puede utilizar para intentar distinguir las células cancerosas y las células normales en función de la dureza de las células, y para evaluar las interacciones entre una célula específica y sus células vecinas en un sistema de cultivo competitivo. AFM también se puede usar para sangrar células, para estudiar cómo regulan la rigidez o la forma de la membrana o pared celular.

En algunas variaciones, los potenciales eléctricos también se pueden escanear utilizando voladizos conductores. En versiones más avanzadas, las corrientes pueden pasar a través de la punta para probar la conductividad eléctrica o el transporte de la superficie subyacente, pero esta es una tarea desafiante con pocos grupos de investigación que reportan datos consistentes (a partir de 2004).

Principios

El AFM consta de un voladizo con una punta afilada (sonda) en su extremo que se utiliza para escanear la superficie de la muestra. El voladizo es típicamente de silicio o nitruro de silicio con un radio de curvatura en la punta del orden de nanómetros. Cuando la punta se acerca a la superficie de una muestra, las fuerzas entre la punta y la muestra conducen a una desviación del voladizo de acuerdo con la ley de Hooke.Según la situación, las fuerzas que se miden en AFM incluyen la fuerza de contacto mecánica, las fuerzas de van der Waals, las fuerzas capilares, los enlaces químicos, las fuerzas electrostáticas, las fuerzas magnéticas (ver microscopio de fuerza magnética, MFM), las fuerzas de Casimir, las fuerzas de solvatación, etc. con fuerza, se pueden medir simultáneamente cantidades adicionales mediante el uso de tipos especializados de sondas (consulte microscopía térmica de barrido, microscopía de expansión de Joule de barrido, microespectroscopía fototérmica, etc.).

El AFM se puede operar en varios modos, dependiendo de la aplicación. En general, los posibles modos de formación de imágenes se dividen en modos estáticos (también llamados de contacto) y una variedad de modos dinámicos (sin contacto o "tapping") en los que el voladizo vibra u oscila a una frecuencia dada.

Modos de imagen

El funcionamiento del AFM suele describirse como uno de tres modos, según la naturaleza del movimiento de la punta: modo de contacto, también llamado modo estático (a diferencia de los otros dos modos, que se denominan modos dinámicos); modo de tapping, también llamado contacto intermitente, modo AC o modo vibratorio, o, después del mecanismo de detección, modulación de amplitud AFM; y modo sin contacto, o, nuevamente después del mecanismo de detección, modulación de frecuencia AFM.

A pesar de la nomenclatura, el contacto repulsivo puede ocurrir o evitarse tanto en el AFM de modulación de amplitud como en el AFM de modulación de frecuencia, según la configuración.

Modo de contacto

En el modo de contacto, la punta se "arrastra" a través de la superficie de la muestra y los contornos de la superficie se miden usando la deflexión del voladizo directamente o, más comúnmente, usando la señal de retroalimentación requerida para mantener el voladizo en una posición constante.. Debido a que la medición de una señal estática es propensa al ruido y la deriva, se utilizan voladizos de baja rigidez (es decir, voladizos con una constante de resorte baja, k) para lograr una señal de deflexión lo suficientemente grande mientras se mantiene baja la fuerza de interacción. Cerca de la superficie de la muestra, las fuerzas de atracción pueden ser bastante fuertes, lo que hace que la punta se "enganche" a la superficie. Por lo tanto, el modo de contacto AFM casi siempre se realiza a una profundidad donde la fuerza general es repulsiva, es decir, en "contacto" firme con la superficie sólida.

Modo de toque

En condiciones ambientales, la mayoría de las muestras desarrollan una capa de menisco líquido. Debido a esto, mantener la punta de la sonda lo suficientemente cerca de la muestra para que las fuerzas de corto alcance sean detectables mientras se evita que la punta se adhiera a la superficie presenta un problema importante para el modo de contacto en condiciones ambientales. El modo de contacto dinámico (también llamado contacto intermitente, modo AC o modo tapping) se desarrolló para evitar este problema. Hoy en día, el modo de tapping es el modo AFM más utilizado cuando se opera en condiciones ambientales o en líquidos.

En modo tapping, el voladizo es impulsado para oscilar hacia arriba y hacia abajo en o cerca de su frecuencia de resonancia. Esta oscilación se logra comúnmente con un pequeño elemento piezoeléctrico en el soporte del voladizo, pero otras posibilidades incluyen un campo magnético de CA (con voladizos magnéticos), voladizos piezoeléctricos o calentamiento periódico con un rayo láser modulado. La amplitud de esta oscilación suele variar desde varios nm hasta 200 nm. En el modo de golpeteo, la frecuencia y la amplitud de la señal de conducción se mantienen constantes, lo que lleva a una amplitud constante de la oscilación en voladizo siempre que no haya deriva ni interacción con la superficie. La interacción de las fuerzas que actúan sobre el voladizo cuando la punta se acerca a la superficie, las fuerzas de van der Waals, las interacciones dipolo-dipolo, las fuerzas electrostáticas, etc. causan la amplitud del voladizo. s la oscilación cambia (generalmente disminuye) a medida que la punta se acerca a la muestra. Esta amplitud se utiliza como parámetro que entra en el servo electrónico que controla la altura del voladizo sobre la muestra. El servo ajusta la altura para mantener una amplitud de oscilación del voladizo establecida a medida que el voladizo se escanea sobre la muestra. APor lo tanto, la imagen de tapping AFM se produce al generar imágenes de la fuerza de los contactos intermitentes de la punta con la superficie de la muestra.

Aunque las fuerzas máximas aplicadas durante la parte de contacto de la oscilación pueden ser mucho más altas que las que se usan normalmente en el modo de contacto, el modo de golpeteo generalmente reduce el daño causado a la superficie y la punta en comparación con la cantidad que se hace en el modo de contacto. Esto puede explicarse por la corta duración de la fuerza aplicada y porque las fuerzas laterales entre la punta y la muestra son significativamente menores en el modo de golpeteo que en el modo de contacto. Las imágenes en modo tapping son lo suficientemente suaves incluso para la visualización de bicapas lipídicas soportadas o moléculas de polímero individuales adsorbidas (por ejemplo, cadenas de polielectrolitos sintéticos de 0,4 nm de espesor) en medio líquido. Con los parámetros de escaneo adecuados, la conformación de moléculas individuales puede permanecer sin cambios durante horas, e incluso se pueden obtener imágenes de motores moleculares individuales mientras se mueven.

Cuando se opera en modo tapping, también se puede registrar la fase de oscilación del voladizo con respecto a la señal de conducción. Este canal de señal contiene información sobre la energía disipada por el voladizo en cada ciclo de oscilación. Las muestras que contienen regiones de rigidez variable o con diferentes propiedades de adhesión pueden dar un contraste en este canal que no es visible en la imagen topográfica. Sin embargo, la extracción de las propiedades del material de la muestra de forma cuantitativa a partir de imágenes de fase no suele ser factible.

Modo sin contacto

En el modo de microscopía de fuerza atómica sin contacto, la punta del voladizo no hace contacto con la superficie de la muestra. En cambio, el voladizo oscila en su frecuencia resonante (modulación de frecuencia) o justo por encima (modulación de amplitud), donde la amplitud de la oscilación suele ser de unos pocos nanómetros (<10 nm) hasta unos pocos picómetros.Las fuerzas de van der Waals, que son más intensas entre 1 nm y 10 nm por encima de la superficie, o cualquier otra fuerza de largo alcance que se extienda por encima de la superficie, actúa para disminuir la frecuencia de resonancia del voladizo. Esta disminución en la frecuencia resonante combinada con el sistema de bucle de retroalimentación mantiene una amplitud o frecuencia de oscilación constante al ajustar la distancia promedio entre la punta y la muestra. La medición de la distancia de la punta a la muestra en cada punto de datos (x,y) permite que el software de escaneo construya una imagen topográfica de la superficie de la muestra.

El modo sin contacto AFM no sufre los efectos de degradación de la punta o la muestra que a veces se observan después de realizar numerosas exploraciones con AFM de contacto. Esto hace que el AFM sin contacto sea preferible al AFM con contacto para medir muestras blandas, por ejemplo, muestras biológicas y películas orgánicas delgadas. En el caso de muestras rígidas, las imágenes con y sin contacto pueden tener el mismo aspecto. Sin embargo, si unas pocas monocapas de fluido adsorbido se encuentran sobre la superficie de una muestra rígida, las imágenes pueden verse bastante diferentes. Un AFM que funciona en modo de contacto penetrará la capa de líquido para obtener imágenes de la superficie subyacente, mientras que en modo sin contacto, un AFM oscilará sobre la capa de fluido adsorbido para obtener imágenes tanto del líquido como de la superficie.

Los esquemas para el funcionamiento en modo dinámico incluyen la modulación de frecuencia en la que se utiliza un bucle de bloqueo de fase para realizar un seguimiento de la frecuencia de resonancia del voladizo y la modulación de amplitud más común con un bucle servo para mantener la excitación del voladizo en una amplitud definida. En la modulación de frecuencia, los cambios en la frecuencia de oscilación brindan información sobre las interacciones punta-muestra. La frecuencia se puede medir con una sensibilidad muy alta y, por lo tanto, el modo de modulación de frecuencia permite el uso de voladizos muy rígidos. Los voladizos rígidos brindan estabilidad muy cerca de la superficie y, como resultado, esta técnica fue la primera técnica AFM que proporcionó una resolución atómica real en condiciones de vacío ultraalto.

En la modulación de amplitud, los cambios en la amplitud o fase de oscilación proporcionan la señal de retroalimentación para la formación de imágenes. En la modulación de amplitud, los cambios en la fase de oscilación se pueden usar para discriminar entre diferentes tipos de materiales en la superficie. La modulación de amplitud puede funcionar en régimen sin contacto o con contacto intermitente. En el modo de contacto dinámico, el voladizo oscila de manera que se modula la distancia de separación entre la punta del voladizo y la superficie de la muestra.

La modulación de amplitud también se ha utilizado en el régimen sin contacto para generar imágenes con resolución atómica mediante el uso de voladizos muy rígidos y amplitudes pequeñas en un entorno de vacío ultraalto.

Imagen topográfica

La formación de imágenes es un método de trazado que produce un mapeo de colores al cambiar la posición x–y de la punta mientras se escanea y registra la variable medida, es decir, la intensidad de la señal de control, en cada coordenada x–y. El mapa de colores muestra el valor medido correspondiente a cada coordenada. La imagen expresa la intensidad de un valor como un matiz. Normalmente, la correspondencia entre la intensidad de un valor y un tono se muestra como una escala de colores en las notas explicativas que acompañan a la imagen.

¿Cuál es la imagen topográfica del microscopio de fuerza atómica?

El modo de operación de formación de imágenes del AFM generalmente se clasifica en dos grupos desde el punto de vista de si utiliza el bucle de retroalimentación z (no se muestra) para mantener la distancia entre la punta y la muestra para mantener la intensidad de la señal exportada por el detector. El primero (usando el bucle z-Feedback), se dice que es el " modo XX constante " (XX es algo que se mantiene en el bucle z-Feedback).

El modo de formación de imágenes topográficas se basa en el " modo XX constante" mencionado anteriormente, el bucle de retroalimentación z controla la distancia relativa entre la sonda y la muestra mediante la emisión de señales de control para mantener constante la frecuencia, la vibración y la fase, que normalmente corresponde al movimiento del voladizo. (por ejemplo, se aplica voltaje al elemento piezoeléctrico Z y mueve la muestra hacia arriba y hacia abajo hacia la dirección Z.

Los detalles se explicarán en el caso de que especialmente el "modo df constante" (FM-AFM) entre AFM como una instancia en la siguiente sección.

Imagen topográfica de FM-AFM

Cuando la distancia entre la sonda y la muestra se lleva al rango en el que se puede detectar la fuerza atómica, mientras se excita un voladizo en su frecuencia propia natural (f ₀), la frecuencia de resonancia f del voladizo puede cambiar de su frecuencia de resonancia original. En otras palabras, en el rango donde se puede detectar la fuerza atómica, también se observará un cambio de frecuencia (df = f – f ₀). Cuando la distancia entre la sonda y la muestra está en la región sin contacto, el cambio de frecuencia aumenta en dirección negativa a medida que la distancia entre la sonda y la muestra se hace más pequeña.

Cuando la muestra tiene concavidad y convexidad, la distancia entre el vértice de la punta y la muestra varía de acuerdo con la concavidad y la convexidad acompañada de un escaneo de la muestra en la dirección x–y (sin regulación de altura en la dirección z). Como resultado, surge el cambio de frecuencia. La imagen en la que los valores de la frecuencia obtenidos mediante un barrido de trama a lo largo de la dirección x-y de la superficie de la muestra se representan frente a la coordinación x-y de cada punto de medición se denomina imagen de altura constante.

Por otro lado, el df puede mantenerse constante moviendo la sonda hacia arriba y hacia abajo (Ver (3) de la FIG.5) en la dirección z usando una retroalimentación negativa (usando un bucle de retroalimentación z) mientras la exploración de trama del superficie de la muestra a lo largo de la dirección x–y. La imagen en la que se trazan las cantidades de retroalimentación negativa (la distancia de movimiento de la sonda hacia arriba y hacia abajo en la dirección z) contra la coordinación x–y de cada punto de medición es una imagen topográfica. En otras palabras, la imagen topográfica es una traza de la punta de la sonda regulada para que el df sea constante y también puede considerarse como un gráfico de una superficie de altura constante del df.

Por lo tanto, la imagen topográfica del AFM no es la morfología superficial exacta en sí misma, sino la imagen influenciada por el orden de enlace entre la sonda y la muestra; sin embargo, se considera que la imagen topográfica del AFM refleja la forma geográfica del superficie más que la imagen topográfica de un microscopio de túnel de barrido.

Espectroscopia de fuerza

Además de la obtención de imágenes, AFM se puede utilizar para la espectroscopia de fuerza, la medición directa de las fuerzas de interacción punta-muestra en función del espacio entre la punta y la muestra. El resultado de esta medida se denomina curva fuerza-distancia. Para este método, la punta del AFM se extiende hacia la superficie y se retrae de ella mientras se controla la desviación del voladizo en función del desplazamiento piezoeléctrico. Estas medidas se han utilizado para medir contactos a nanoescala, enlaces atómicos, fuerzas de Van der Waals y fuerzas de Casimir, fuerzas de disolución en líquidos y fuerzas de ruptura y estiramiento de moléculas individuales. AFM también se ha utilizado para medir, en un entorno acuoso, la fuerza de dispersión debida al polímero adsorbido en el sustrato.Las fuerzas del orden de unos pocos piconewtons ahora se pueden medir de forma rutinaria con una resolución de distancia vertical mejor que 0,1 nanómetros. La espectroscopia de fuerza se puede realizar con modos estáticos o dinámicos. En los modos dinámicos, la información sobre la vibración del voladizo se monitorea además de la deflexión estática.

Los problemas con la técnica incluyen la falta de medición directa de la separación punta-muestra y la necesidad común de voladizos de baja rigidez, que tienden a "quebrarse" en la superficie. Estos problemas no son insuperables. Se ha desarrollado un AFM que mide directamente la separación punta-muestra. El encaje a presión se puede reducir midiendo en líquidos o usando voladizos más rígidos, pero en este último caso se necesita un sensor de deflexión más sensible. Al aplicar un pequeño difuminado en la punta, también se puede medir la rigidez (gradiente de fuerza) de la unión.

Aplicaciones biológicas y otras

La espectroscopia de fuerza se utiliza en biofísica para medir las propiedades mecánicas de la materia viva (como tejidos o células) o detectar estructuras de diferente rigidez enterradas en la mayor parte de la muestra utilizando la tomografía de rigidez. Otra aplicación fue medir las fuerzas de interacción entre, por un lado, un material adherido a la punta del voladizo y, por otro lado, la superficie de partículas libres u ocupadas por el mismo material. A partir de la curva de distribución de la fuerza de adhesión, se ha derivado un valor medio de las fuerzas. Permitió realizar una cartografía de la superficie de las partículas, cubiertas o no por el material. AFM también se ha utilizado para proteínas que se despliegan mecánicamente. En tales experimentos, los análisis de las fuerzas medias de despliegue con el modelo apropiadoconduce a la obtención de la información sobre la tasa de desdoblamiento y los parámetros del perfil de energía libre de la proteína.

Identificación de átomos superficiales individuales

El AFM se puede utilizar para obtener imágenes y manipular átomos y estructuras en una variedad de superficies. El átomo en el vértice de la punta "siente" átomos individuales en la superficie subyacente cuando forma enlaces químicos incipientes con cada átomo. Debido a que estas interacciones químicas alteran sutilmente la frecuencia de vibración de la punta, pueden detectarse y mapearse. Este principio se utilizó para distinguir entre átomos de silicio, estaño y plomo en una superficie de aleación, comparando estas "huellas dactilares atómicas" con los valores obtenidos de las simulaciones de la teoría funcional de la densidad (DFT).

El truco consiste en medir primero estas fuerzas con precisión para cada tipo de átomo esperado en la muestra y luego compararlas con las fuerzas dadas por las simulaciones DFT. El equipo descubrió que la punta interactuaba con más fuerza con los átomos de silicio y un 24 % y un 41 % menos con los átomos de estaño y plomo, respectivamente. Por lo tanto, cada tipo diferente de átomo se puede identificar en la matriz a medida que la punta se mueve por la superficie.

Investigacion

Una sonda AFM tiene una punta afilada en el extremo de oscilación libre de un voladizo que sobresale de un soporte. Las dimensiones del voladizo están en la escala de micrómetros. El radio de la punta suele estar en la escala de unos pocos nanómetros a unas pocas decenas de nanómetros. (Existen sondas especializadas con radios finales mucho más grandes, por ejemplo, sondas para indentación de materiales blandos). El soporte en voladizo, también llamado chip de soporte, a menudo de 1,6 mm por 3,4 mm de tamaño, permite al operador sostener el conjunto de sonda/voladizo AFM con pinzas y colóquelo en los clips de soporte correspondientes en el cabezal de exploración del microscopio de fuerza atómica.

Este dispositivo se denomina más comúnmente "sonda AFM", pero otros nombres incluyen "punta AFM" y "voladizo" (empleando el nombre de una sola parte como el nombre de todo el dispositivo). Una sonda AFM es un tipo particular de sonda SPM (microscopía de sonda de barrido).

Las sondas AFM se fabrican con tecnología MEMS. La mayoría de las sondas AFM utilizadas están hechas de silicio (Si), pero también se utilizan vidrio de borosilicato y nitruro de silicio. Las sondas AFM se consideran consumibles, ya que a menudo se reemplazan cuando el vértice de la punta se desafila o se contamina, o cuando se rompe el voladizo. Pueden costar desde un par de decenas de dólares hasta cientos de dólares por voladizo para las combinaciones más especializadas de voladizo/sonda.

Solo la punta se acerca mucho a la superficie del objeto bajo investigación, el voladizo se desvía por la interacción entre la punta y la superficie, que es lo que el AFM está diseñado para medir. Se puede hacer un mapa espacial de la interacción midiendo la desviación en muchos puntos en una superficie 2D.

Se pueden detectar varios tipos de interacción. Dependiendo de la interacción bajo investigación, la superficie de la punta de la sonda AFM debe modificarse con un recubrimiento. Entre los recubrimientos utilizados se encuentran el oro, para la unión covalente de moléculas biológicas y la detección de su interacción con una superficie, el diamante para aumentar la resistencia al desgaste y los recubrimientos magnéticos para detectar las propiedades magnéticas de la superficie investigada. Existe otra solución para lograr imágenes magnéticas de alta resolución: tener la sonda equipada con un microSQUID. Las puntas AFM se fabrican con micromecanizado de silicio y el posicionamiento preciso del bucle microSQUID se realiza mediante litografía por haz de electrones.La unión adicional de un punto cuántico al ápice de la punta de una sonda conductora permite obtener imágenes de potencial superficial con microscopía de puntos cuánticos de barrido de alta resolución lateral.

La superficie de los voladizos también se puede modificar. Estos recubrimientos se aplican principalmente para aumentar la reflectancia del voladizo y mejorar la señal de deflexión.

Fuerzas en función de la geometría de la punta

Las fuerzas entre la punta y la muestra dependen en gran medida de la geometría de la punta. Se aprovecharon varios estudios en los últimos años para escribir las fuerzas en función de los parámetros de la punta.

Entre las diferentes fuerzas entre la punta y la muestra, las fuerzas del menisco del agua son muy interesantes, tanto en aire como en medio líquido. Se deben considerar otras fuerzas, como la fuerza de Coulomb, las fuerzas de van der Waals, las interacciones de doble capa, las fuerzas de solvatación, las fuerzas de hidratación y las hidrofóbicas.

Menisco de agua

Las fuerzas del menisco del agua son muy interesantes para las mediciones de AFM en el aire. Debido a la humedad ambiental, se forma una fina capa de agua entre la punta y la muestra durante las mediciones del aire. La fuerza capilar resultante da lugar a una fuerte fuerza de atracción que tira de la punta hacia la superficie. De hecho, la fuerza de adhesión medida entre la punta y la muestra en el aire ambiente de humedad finita suele estar dominada por las fuerzas capilares. Como consecuencia, es difícil sacar la punta de la superficie. Para muestras blandas que incluyen muchos polímeros y, en particular, materiales biológicos, la fuerte fuerza capilar adhesiva da lugar a la degradación y destrucción de la muestra al obtener imágenes en modo de contacto. Históricamente, estos problemas fueron una motivación importante para el desarrollo de imágenes dinámicas en el aire (por ejemplo, "modo tapping"). Durante la obtención de imágenes en modo tapping en el aire, todavía se forman puentes capilares. Sin embargo, para condiciones de imagen adecuadas, los puentes capilares se forman y se rompen en cada ciclo de oscilación del voladizo normal a la superficie, como se puede deducir de un análisis de las curvas de amplitud y fase frente a distancia del voladizo.Como consecuencia, las fuerzas de corte destructivas se reducen en gran medida y se pueden investigar muestras blandas.

Para cuantificar la fuerza capilar de equilibrio es necesario partir de la ecuación de Laplace para la presión:

donde γ _L, es la energía superficial y r ₀ y r ₁ se definen en la figura.

La presión se aplica sobre un área de

donde d, θ y h se definen en la figura.

La fuerza que une las dos superficies es

La misma fórmula también podría calcularse en función de la humedad relativa.

Gao calculó fórmulas para diferentes geometrías de punta. Como ejemplo, la fuerza disminuye un 20% para una punta cónica con respecto a una punta esférica.

Cuando se calculan estas fuerzas, se debe hacer una diferencia entre la situación húmedo sobre seco y la situación húmedo sobre húmedo.

Para una punta esférica, la fuerza es:para seco sobre mojado,por mojado sobre mojado,

donde θ es el ángulo de contacto de la esfera seca y φ es el ángulo sumergido, como se muestra en la figura

Para una punta cónica, la fórmula se convierte en:para seco sobre mojadomojado sobre mojado

donde δ es el ángulo del semicono y r 0 _yh son parámetros del perfil del menisco.

Medición de deflexión en voladizo AFM

Medición de la desviación del haz

El método más común para las mediciones de deflexión en voladizo es el método de deflexión de viga. En este método, la luz láser de un diodo de estado sólido se refleja en la parte posterior del voladizo y es recolectada por un detector sensible a la posición (PSD) que consta de dos fotodiodos muy próximos entre sí, cuya señal de salida es recolectada por un amplificador diferencial. El desplazamiento angular del voladizo da como resultado que un fotodiodo recoja más luz que el otro fotodiodo, produciendo una señal de salida (la diferencia entre las señales del fotodiodo normalizada por su suma), que es proporcional a la desviación del voladizo. La sensibilidad del método de deflexión del haz es muy alta y un ruido de fondo del orden de 10 fm Hzse puede obtener de forma rutinaria en un sistema bien diseñado. Aunque este método a veces se denomina método de "palanca óptica", la señal no se amplifica si la trayectoria del haz se hace más larga. Una trayectoria de haz más larga aumenta el movimiento del punto reflejado en los fotodiodos, pero también amplía el punto en la misma cantidad debido a la difracción, de modo que la misma cantidad de potencia óptica se mueve de un fotodiodo al otro. La "palanca óptica" (señal de salida del detector dividida por la desviación del voladizo) es inversamente proporcional a la apertura numérica de la óptica de enfoque del haz, siempre que el punto del láser enfocado sea lo suficientemente pequeño como para caer completamente sobre el voladizo. También es inversamente proporcional a la longitud del voladizo.

La relativa popularidad del método de desviación del haz puede explicarse por su alta sensibilidad y operación simple, y por el hecho de que los voladizos no requieren contactos eléctricos u otros tratamientos especiales y, por lo tanto, pueden fabricarse de manera relativamente económica con puntas afiladas integradas.

Otros métodos de medición de deflexión

Existen muchos otros métodos para medir la desviación del haz.

• Detección piezoeléctrica: los voladizos hechos de cuarzo (como la configuración qPlus) u otros materiales piezoeléctricos pueden detectar directamente la desviación como una señal eléctrica. Con este método se han detectado oscilaciones en voladizo de hasta 22:00 h.
• Vibrometría láser Doppler: se puede usar un vibrómetro láser Doppler para producir mediciones de deflexión muy precisas para un voladizo oscilante (por lo tanto, solo se usa en modo sin contacto). Este método es costoso y solo lo utilizan relativamente pocos grupos.
• Microscopio de túnel de barrido (STM): el primer microscopio atómico utilizó un STM completo con su propio mecanismo de retroalimentación para medir la desviación. Este método es muy difícil de implementar y reacciona lentamente a los cambios de deflexión en comparación con los métodos modernos.
• Interferometría óptica: la interferometría óptica se puede utilizar para medir la desviación del voladizo. Debido a las desviaciones a escala nanométrica medidas en AFM, el interferómetro está funcionando en el régimen de subfranjas, por lo que cualquier desviación en la potencia del láser o la longitud de onda tiene efectos importantes en la medición. Por estas razones, las mediciones del interferómetro óptico deben realizarse con mucho cuidado (por ejemplo, utilizando fluidos de adaptación de índices entre las uniones de fibra óptica), con láseres muy estables. Por estas razones, rara vez se utiliza la interferometría óptica.
• Detección capacitiva: los voladizos revestidos de metal pueden formar un condensador con otro contacto ubicado detrás del voladizo. La desviación cambia la distancia entre los contactos y se puede medir como un cambio en la capacitancia.
• Detección piezorresistiva: los voladizos se pueden fabricar con elementos piezorresistivos que actúan como un medidor de tensión. Usando un puente de Wheatstone, se puede medir la tensión en el voladizo AFM debido a la deflexión. Esto no se usa comúnmente en aplicaciones de vacío, ya que la detección piezorresistiva disipa energía del sistema que afecta a Q de resonancia.

Escáneres piezoeléctricos

Los escáneres AFM están hechos de material piezoeléctrico, que se expande y contrae proporcionalmente al voltaje aplicado. Que se alarguen o se contraigan depende de la polaridad del voltaje aplicado. Tradicionalmente, la punta o la muestra se monta en un "trípode" de tres cristales piezoeléctricos, cada uno de los cuales es responsable de escanear en las direcciones x, y y z. En 1986, el mismo año en que se inventó el AFM, se desarrolló un nuevo escáner piezoeléctrico, el escáner de tubo, para su uso en STM. Los escáneres de tubo posteriores se incorporaron a los AFM. El escáner de tubo puede mover la muestra en x, y, y zdirecciones usando un solo tubo piezoeléctrico con un solo contacto interior y cuatro contactos externos. Una ventaja del escáner de tubo en comparación con el diseño de trípode original es un mejor aislamiento vibratorio, resultado de la mayor frecuencia de resonancia de la construcción de un solo elemento, en combinación con una etapa de aislamiento de baja frecuencia de resonancia. Una desventaja es que el movimiento x - y puede causar un movimiento z no deseado que da como resultado una distorsión. Otro diseño popular para los escáneres AFM es la etapa de flexión, que utiliza piezos independientes para cada eje y los acopla a través de un mecanismo de flexión.

Los escáneres se caracterizan por su sensibilidad, que es la relación entre el movimiento piezoeléctrico y el voltaje piezoeléctrico, es decir, cuánto se extiende o contrae el material piezoeléctrico por cada voltio aplicado. Debido a las diferencias de material o tamaño, la sensibilidad varía de un escáner a otro. La sensibilidad varía de forma no lineal con respecto al tamaño del escaneo. Los escáneres piezoeléctricos exhiben más sensibilidad al final que al comienzo de un escaneo. Esto hace que los escaneos hacia adelante y hacia atrás se comporten de manera diferente y muestren histéresis entre las dos direcciones de escaneo. Esto se puede corregir aplicando un voltaje no lineal a los electrodos piezoeléctricos para provocar un movimiento lineal del escáner y calibrar el escáner en consecuencia.Una desventaja de este enfoque es que requiere una recalibración porque el voltaje no lineal preciso necesario para corregir el movimiento no lineal cambiará a medida que envejezca el piezoeléctrico (ver más abajo). Este problema se puede evitar agregando un sensor lineal a la etapa de muestra oa la etapa piezoeléctrica para detectar el verdadero movimiento del piezoeléctrico. El sensor puede detectar desviaciones del movimiento ideal y aplicar correcciones a la señal del controlador piezoeléctrico para corregir el movimiento piezoeléctrico no lineal. Este diseño se conoce como AFM de "bucle cerrado". Los AFM piezoeléctricos sin sensor se denominan AFM de "bucle abierto".

La sensibilidad de los materiales piezoeléctricos disminuye exponencialmente con el tiempo. Esto hace que la mayor parte del cambio en la sensibilidad ocurra en las etapas iniciales de la vida del escáner. Los escáneres piezoeléctricos se ejecutan durante aproximadamente 48 horas antes de que se envíen desde la fábrica para que hayan pasado el punto en el que pueden tener grandes cambios en la sensibilidad. A medida que el escáner envejece, la sensibilidad cambiará menos con el tiempo y el escáner rara vez requerirá una recalibración, aunque varios manuales de fabricantes recomiendan una calibración mensual o quincenal de los AFM de bucle abierto.

Ventajas y desventajas

Ventajas

AFM tiene varias ventajas sobre el microscopio electrónico de barrido (SEM). A diferencia del microscopio electrónico, que proporciona una proyección bidimensional o una imagen bidimensional de una muestra, el AFM proporciona un perfil de superficie tridimensional. Además, las muestras vistas por AFM no requieren ningún tratamiento especial (como recubrimientos de metal/carbono) que cambiarían o dañarían irreversiblemente la muestra y, por lo general, no presentan artefactos de carga en la imagen final. Mientras que un microscopio electrónico necesita un entorno de vacío costoso para un funcionamiento adecuado, la mayoría de los modos AFM pueden funcionar perfectamente bien en el aire ambiente o incluso en un entorno líquido. Esto hace posible estudiar macromoléculas biológicas e incluso organismos vivos. En principio, AFM puede proporcionar una resolución más alta que SEM. Se ha demostrado que brinda una verdadera resolución atómica en ultra alto vacío (UHV) y, más recientemente, en entornos líquidos. El AFM de alta resolución es comparable en resolución a la microscopía de túnel de barrido y la microscopía electrónica de transmisión. AFM también se puede combinar con una variedad de técnicas de espectroscopia y microscopía óptica, como la microscopía fluorescente o la espectroscopía infrarroja, lo que da lugar a la microscopía óptica de campo cercano de barrido, nano-FTIR y amplía aún más su aplicabilidad. Los instrumentos ópticos AFM combinados se han aplicado principalmente en las ciencias biológicas, pero recientemente han atraído un gran interés en la energía fotovoltaica. AFM también se puede combinar con una variedad de técnicas de espectroscopia y microscopía óptica, como la microscopía fluorescente o la espectroscopía infrarroja, lo que da lugar a la microscopía óptica de campo cercano de barrido, nano-FTIR y amplía aún más su aplicabilidad. Los instrumentos ópticos AFM combinados se han aplicado principalmente en las ciencias biológicas, pero recientemente han atraído un gran interés en la energía fotovoltaica. AFM también se puede combinar con una variedad de técnicas de espectroscopia y microscopía óptica, como la microscopía fluorescente o la espectroscopía infrarroja, lo que da lugar a la microscopía óptica de campo cercano de barrido, nano-FTIR y amplía aún más su aplicabilidad. Los instrumentos ópticos AFM combinados se han aplicado principalmente en las ciencias biológicas, pero recientemente han atraído un gran interés en la energía fotovoltaica.e investigación de almacenamiento de energía, ciencias de polímeros, nanotecnología e incluso investigación médica.

Desventajas

Una desventaja de AFM en comparación con el microscopio electrónico de barrido (SEM) es el tamaño de imagen de barrido único. En una sola pasada, el SEM puede obtener imágenes de un área del orden de milímetros cuadrados con una profundidad de campo del orden de milímetros, mientras que el AFM solo puede obtener imágenes de un área de escaneo máxima de aproximadamente 150 × 150 micrómetros y una altura máxima del orden de 10 a 20 micrómetros. Un método para mejorar el tamaño del área escaneada para AFM es mediante el uso de sondas paralelas de una manera similar a la del almacenamiento de datos de milpiés.

La velocidad de exploración de un AFM también es una limitación. Tradicionalmente, un AFM no puede escanear imágenes tan rápido como un SEM, lo que requiere varios minutos para un escaneo típico, mientras que un SEM es capaz de escanear casi en tiempo real, aunque con una calidad relativamente baja. La velocidad de escaneo relativamente lenta durante la generación de imágenes AFM a menudo conduce a una deriva térmica en la imagen, lo que hace que el AFM sea menos adecuado para medir distancias precisas entre las características topográficas de la imagen. Sin embargo, se sugirieron varios diseños de acción rápida para aumentar la productividad del escaneo del microscopio, incluido lo que se denomina videoAFM (se obtienen imágenes de calidad razonable con videoAFM a velocidad de video: más rápido que el SEM promedio). Para eliminar las distorsiones de imagen inducidas por la deriva térmica, se han introducido varios métodos.

Las imágenes AFM también pueden verse afectadas por la no linealidad, la histéresis y la fluencia del material piezoeléctrico y la diafonía entre los ejes x, y, z que pueden requerir mejoras y filtrado de software. Dicho filtrado podría "aplanar" las características topográficas reales. Sin embargo, los AFM más nuevos utilizan software de corrección en tiempo real (por ejemplo, escaneo orientado a características) o escáneres de circuito cerrado, que prácticamente eliminan estos problemas. Algunos AFM también usan escáneres ortogonales separados (a diferencia de un solo tubo), que también sirven para eliminar parte de los problemas de diafonía.

Al igual que con cualquier otra técnica de imagen, existe la posibilidad de artefactos en la imagen, que podrían ser inducidos por una punta inadecuada, un entorno operativo deficiente o incluso por la propia muestra, como se muestra a la derecha. Estos artefactos de imagen son inevitables; sin embargo, su ocurrencia y efecto sobre los resultados se puede reducir a través de varios métodos. Los artefactos resultantes de una punta demasiado gruesa pueden ser causados, por ejemplo, por un manejo inadecuado o colisiones de facto con la muestra por escanear demasiado rápido o tener una superficie irracionalmente rugosa, lo que provoca un desgaste real de la punta.

Debido a la naturaleza de las sondas AFM, normalmente no pueden medir paredes empinadas o voladizos. Se pueden usar voladizos y AFM especialmente fabricados para modular la sonda hacia los lados, así como hacia arriba y hacia abajo (como con los modos de contacto dinámico y sin contacto) para medir paredes laterales, a costa de voladizos más costosos, menor resolución lateral y artefactos adicionales.

Otras aplicaciones en diversos campos de estudio

Los últimos esfuerzos en la integración de la nanotecnología y la investigación biológica han tenido éxito y son muy prometedores para el futuro, incluso en campos como la nanobiomecánica. Dado que las nanopartículas son un vehículo potencial para la administración de fármacos, las respuestas biológicas de las células a estas nanopartículas se exploran continuamente para optimizar su eficacia y cómo se podría mejorar su diseño. Pyrgiotakis et al. pudieron estudiar la interacción entre las células y las nanopartículas modificadas CeO ₂ y Fe ₂ O ₃ uniendo las nanopartículas modificadas a la punta del AFM.Los estudios han aprovechado AFM para obtener más información sobre el comportamiento de las células vivas en medios biológicos. La espectroscopia de fuerza atómica en tiempo real (o nanoscopia) y la espectroscopia de fuerza atómica dinámica se han utilizado para estudiar células vivas y proteínas de membrana y su comportamiento dinámico a alta resolución, en la nanoescala. La obtención de imágenes y la información sobre la topografía y las propiedades de las células también ha proporcionado información sobre los procesos y mecanismos químicos que se producen a través de la interacción célula-célula y las interacciones con otras moléculas de señalización (p. ej., ligandos). Evans y Calderwood utilizaron microscopía de fuerza de células individuales para estudiar las fuerzas de adhesión celular, la cinética de unión/fuerza de unión dinámica y su papel en procesos químicos como la señalización celular. Scheuring, Lévy y Rigaud revisaron estudios en los que AFM exploraba la estructura cristalina de las proteínas de membrana de las bacterias fotosintéticas. Alsteen et al. han utilizado nanoscopia basada en AFM para realizar un análisis en tiempo real de la interacción entre micobacterias vivas y fármacos antimicobacterianos (específicamente isoniazida, etionamida, etambutol y estreptomicina), que sirve como ejemplo del análisis más profundo de patógenos-fármacos interacciones que se pueden hacer a través de AFM.