Microscopía de campo claro

La microscopía de campo claro (BF) es la más simple de todas las técnicas de iluminación de microscopía óptica. La iluminación de la muestra se transmite (es decir, se ilumina desde abajo y se observa desde arriba) con luz blanca, y el contraste en la muestra se produce por la atenuación de la luz transmitida en áreas densas de la muestra. La microscopía de campo claro es la más simple de una serie de técnicas utilizadas para la iluminación de muestras en microscopios ópticos, y su simplicidad la convierte en una técnica popular. La apariencia típica de una imagen de microscopía de campo claro es una muestra oscura sobre un fondo brillante, de ahí el nombre.

La trayectoria de la luz de un microscopio de campo claro es extremadamente simple, no se requieren componentes adicionales más allá de la configuración normal del microscopio óptico. Por lo tanto, la trayectoria de la luz consta de:

• una fuente de luz de transilluminación, comúnmente una lámpara de halógeno en el soporte del microscopio;
• un lente condensador, que enfoca la luz de la fuente de luz sobre la muestra;
• un objetivo, que recoge luz de la muestra y aumenta la imagen;
• oculares y/o una cámara para ver la imagen de la muestra.

La microscopía de campo claro puede utilizar iluminación crítica o de Köhler para iluminar la muestra.

La microscopía de campo claro suele tener un bajo contraste con la mayoría de las muestras biológicas, ya que pocas absorben la luz en gran medida. A menudo se requiere tinción para aumentar el contraste, lo que impide su uso en células vivas en muchas situaciones. La iluminación de campo claro es útil para muestras que tienen un color intrínseco, por ejemplo, las mitocondrias que se encuentran en las células.

• Comparación de técnicas de transilluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel de tejido (1.559 μm/pixel)
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  Iluminación de campo brillante, contraste de muestra proviene de la absorción de luz en la muestra
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  Iluminación de luz poliarizada cruzada, contraste de muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra
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  Iluminación de campo oscuro, contraste de muestra viene de la luz dispersa por la muestra
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  Iluminación de contraste de fase, contraste de muestra proviene de interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de luz a través de la muestra

La microscopía de campo claro es una técnica estándar de microscopía óptica y, por lo tanto, el aumento está limitado por el poder de resolución posible con la longitud de onda de la luz visible.

• Simplicidad de configuración con sólo el equipo básico requerido.
• Las células vivas se pueden ver con microscopios de campo brillante.

• Muy bajo contraste de la mayoría de las muestras biológicas;
• El límite práctico para la magnificación con un microscopio ligero es alrededor de 1300X. Aunque las magnificaciones superiores son posibles, resulta cada vez más difícil mantener la claridad de la imagen a medida que aumenta la aumento;
• Baja resolución óptica aparente debido al desenfoque de material fuera de foco;
• Las muestras que son naturalmente incoloras y transparentes no se pueden ver bien, por ejemplo, muchos tipos de células mamíferas. Estas muestras a menudo tienen que ser manchadas antes de ver. Las muestras que tienen su propio color se pueden ver sin preparación, por ejemplo, la observación de la transmisión citoplasmática en las células de Chara.

• Reducir o aumentar la cantidad de la fuente de luz por el diafragma iris.
• Uso de un objetivo de inmersión de aceite y un aceite de inmersión especial colocado en una cubierta de vidrio sobre el espécimen. El aceite de inmersión tiene la misma refracción que el vidrio y mejora la resolución del espécimen observado.
• Uso de métodos que contienen muestras para su uso en microbiología, como manchas simples (metileno azul, safranina, violeta de cristal) y manchas diferenciales (manchas negativas, manchas de flagelo, manchas de endospore).
• Uso de un filtro coloreado (generalmente azul) o polarizador en la fuente de luz para resaltar las características no visibles bajo la luz blanca. El uso de filtros es especialmente útil con muestras minerales.

1. Advanced Light Microscopy vol. 1 Principios y propiedades básicas de Maksymilian Pluta, Elsevier (1988)
2. Advanced Light Microscopy vol. 2 Especializados Métodos de Maksymilian Pluta, Elsevier (1989)
3. Introducción a la microscopía de la luz por S. Bradbury, B. Bracegirdle, BIOS Scientific Publishers (1998)
4. Microbiología: Principios y Exploraciones de Jacquelyn G. Black, John Wiley & Sons, Inc. (2005)
5. Microscopia y Literatura de Imágenes