Microscopía
Microscopía es el campo técnico del uso de microscopios para ver objetos y áreas de objetos que no se pueden ver a simple vista (objetos que no están dentro del rango de resolución del ojo normal). Hay tres ramas bien conocidas de la microscopía: microscopía óptica, electrónica y de sonda de barrido, junto con el campo emergente de la microscopía de rayos X.
La microscopía óptica y la microscopía electrónica implican la difracción, la reflexión o la refracción de la radiación electromagnética/haces de electrones que interactúan con la muestra y la recolección de la radiación dispersa u otra señal para crear una imagen. Este proceso puede llevarse a cabo mediante irradiación de campo amplio de la muestra (por ejemplo, microscopía de luz estándar y microscopía electrónica de transmisión) o mediante el barrido de un haz fino sobre la muestra (por ejemplo, microscopía de barrido láser confocal y microscopía electrónica de barrido). La microscopía de sonda de barrido implica la interacción de una sonda de barrido con la superficie del objeto de interés. El desarrollo de la microscopía revolucionó la biología, dio origen al campo de la histología y, por lo tanto, sigue siendo una técnica esencial en las ciencias físicas y de la vida. La microscopía de rayos X es tridimensional y no destructiva, lo que permite obtener imágenes repetidas de la misma muestra para estudios in situ o 4D, y proporciona la capacidad de "ver el interior" la muestra que se está estudiando antes de sacrificarla a técnicas de mayor resolución. Un microscopio de rayos X 3D utiliza la técnica de tomografía computarizada (microCT), rotando la muestra 360 grados y reconstruyendo las imágenes. La TC normalmente se lleva a cabo con una pantalla plana. Un microscopio de rayos X 3D emplea una variedad de objetivos, por ejemplo, de 4X a 40X, y también puede incluir un panel plano.
Historia
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El campo de la microscopía (microscopía óptica) se remonta al menos al siglo XVII. Los microscopios anteriores, las lupas de una sola lente con aumento limitado, se remontan al menos al uso generalizado de lentes en los anteojos en el siglo XIII, pero los microscopios compuestos más avanzados aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620. Los primeros practicantes de la microscopía incluyen a Galileo Galilei, quien descubrió en 1610 que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños de cerca y Cornelis Drebbel, quien pudo haber inventado el microscopio compuesto alrededor de 1620. Antonie van Leeuwenhoek desarrolló un microscopio simple de gran aumento en la década de 1670 y a menudo se lo considera el primer microscopista y microbiólogo reconocido.
Microscopía óptica
La microscopía óptica o de luz implica pasar la luz visible transmitida o reflejada por la muestra a través de una sola lente o varias lentes para permitir una vista ampliada de la muestra. La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo, reflejada en una placa fotográfica o capturada digitalmente. La lente única con sus accesorios, o el sistema de lentes y equipo de imagen, junto con el equipo de iluminación apropiado, la platina de muestra y el soporte, constituyen el microscopio de luz básico. El desarrollo más reciente es el microscopio digital, que usa una cámara CCD para enfocar la exhibición de interés. La imagen se muestra en la pantalla de una computadora, por lo que los oculares son innecesarios.
Limitaciones
Las limitaciones de la microscopía óptica estándar (microscopía de campo claro) se encuentran en tres áreas;
- La técnica sólo puede imagen oscura o refractar objetos de forma efectiva.
- Hay una resolución limitada a la difracción dependiendo de longitud de onda de incidentes; en rango visible, la resolución de microscopía óptica se limita a aproximadamente 0,2 micrometros (ver: microscopio) y el límite de magnificación práctica a ~1500x.
- La luz fuera de foco de puntos fuera del plano focal reduce la claridad de imagen.
Las células vivas en particular generalmente carecen de suficiente contraste para ser estudiadas con éxito, ya que las estructuras internas de la célula son incoloras y transparentes. La forma más común de aumentar el contraste es teñir las estructuras con tintes selectivos, pero esto a menudo implica matar y fijar la muestra. La tinción también puede introducir artefactos, que son detalles estructurales aparentes causados por el procesamiento de la muestra y, por lo tanto, no son características de la muestra. En general, estas técnicas hacen uso de las diferencias en el índice de refracción de las estructuras celulares. La microscopía de campo claro es comparable a mirar a través de una ventana de vidrio: uno no ve el vidrio sino simplemente la suciedad en el vidrio. Hay una diferencia, ya que el vidrio es un material más denso, y esto crea una diferencia en la fase de la luz que lo atraviesa. El ojo humano no es sensible a esta diferencia de fase, pero se han ideado soluciones ópticas inteligentes para cambiar esta diferencia de fase en una diferencia de amplitud (intensidad de la luz).
Técnicas
Para mejorar el contraste de la muestra o resaltar estructuras en una muestra, se deben utilizar técnicas especiales. Hay disponible una gran selección de técnicas de microscopía para aumentar el contraste o etiquetar una muestra.
- Cuatro ejemplos de técnicas de transilluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel de tejido. 1.559 μm/pixel.
Iluminación de campo brillante, contraste de muestra viene de la absorción de luz en la muestra
Iluminación de luz poliarizada cruzada, contraste de muestra viene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra
Iluminación de campo oscuro, contraste de muestra viene de luz dispersa por la muestra
Iluminación de contraste de fase, contraste de muestra proviene de interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de luz a través de la muestra
Campo brillante
La microscopía de campo claro es la más simple de todas las técnicas de microscopía de luz. La iluminación de la muestra se realiza mediante luz blanca transmitida, es decir, iluminada desde abajo y observada desde arriba. Las limitaciones incluyen el bajo contraste de la mayoría de las muestras biológicas y la baja resolución aparente debido a la borrosidad del material desenfocado. La simplicidad de la técnica y la mínima preparación de muestras requerida son ventajas significativas.
Iluminación oblicua
El uso de iluminación oblicua (desde un lado) le da a la imagen una apariencia tridimensional y puede resaltar características que de otro modo serían invisibles. Una técnica más reciente basada en este método es el contraste de modulación de Hoffmann, un sistema que se encuentra en los microscopios invertidos para su uso en cultivos celulares. La iluminación oblicua mejora el contraste incluso en muestras claras; sin embargo, debido a que la luz entra fuera del eje, la posición de un objeto parecerá cambiar a medida que se cambia el enfoque. Esta limitación hace que técnicas como el corte óptico o la medición precisa en el eje z sean imposibles.
Campo oscuro
La microscopía de campo oscuro es una técnica para mejorar el contraste de muestras transparentes y sin teñir. La iluminación de campo oscuro utiliza una fuente de luz cuidadosamente alineada para minimizar la cantidad de luz transmitida directamente (no dispersada) que ingresa al plano de la imagen, recolectando solo la luz dispersada por la muestra. El campo oscuro puede mejorar drásticamente el contraste de la imagen, especialmente de objetos transparentes, mientras que requiere poca configuración de equipo o preparación de muestras. Sin embargo, la técnica adolece de baja intensidad de luz en la imagen final de muchas muestras biológicas y sigue viéndose afectada por la baja resolución aparente.
Iluminación Rheinberg es una variante de la iluminación de campo oscuro en la que se insertan filtros de colores transparentes justo antes del condensador para que los rayos de luz en la apertura alta tengan un color diferente al de la apertura baja (es decir, el el fondo de la muestra puede ser azul mientras que el objeto aparece rojo autoluminoso). Son posibles otras combinaciones de colores, pero su eficacia es bastante variable.
Tinción de dispersión
La tinción por dispersión es una técnica óptica que da como resultado una imagen coloreada de un objeto incoloro. Esta es una técnica de tinción óptica y no requiere tinciones ni tintes para producir un efecto de color. Hay cinco configuraciones de microscopio diferentes que se utilizan en la técnica más amplia de tinción por dispersión. Incluyen la línea de Becke de campo claro, la oblicua, el campo oscuro, el contraste de fase y la tinción de dispersión de parada objetiva.
Contraste de fase
- En microscopía electrónica: Imágenes de contraste de fase
Técnicas más sofisticadas mostrarán diferencias proporcionales en la densidad óptica. El contraste de fase es una técnica ampliamente utilizada que muestra las diferencias en el índice de refracción como diferencia en el contraste. Fue desarrollado por el físico holandés Frits Zernike en la década de 1930 (por lo que recibió el Premio Nobel en 1953). El núcleo de una célula, por ejemplo, aparecerá oscuro contra el citoplasma circundante. El contraste es excelente; sin embargo, no es para usar con objetos gruesos. Con frecuencia, se forma un halo incluso alrededor de objetos pequeños, lo que oscurece los detalles. El sistema consta de un anillo circular en el condensador, que produce un cono de luz. Este cono se superpone a un anillo de tamaño similar dentro del objetivo de fase. Cada objetivo tiene un anillo de tamaño diferente, por lo que para cada objetivo se debe elegir otra configuración de condensador. El anillo en el objetivo tiene propiedades ópticas especiales: en primer lugar, reduce la intensidad de la luz directa, pero lo que es más importante, crea una diferencia de fase artificial de aproximadamente un cuarto de longitud de onda. A medida que cambian las propiedades físicas de esta luz directa, se produce una interferencia con la luz difractada, lo que da como resultado la imagen de contraste de fase. Una desventaja de la microscopía de contraste de fase es la formación de halo (anillo de luz de halo).
Contraste de interferencia diferencial
Superior y mucho más caro es el uso de contraste de interferencia. Las diferencias en la densidad óptica se mostrarán como diferencias en el relieve. Un núcleo dentro de una célula en realidad aparecerá como un glóbulo en el sistema de contraste de interferencia diferencial más utilizado según Georges Nomarski. Sin embargo, hay que tener en cuenta que se trata de un efecto óptico, y el relieve no se parece necesariamente a la forma real. El contraste es muy bueno y la apertura del condensador se puede usar completamente abierta, lo que reduce la profundidad de campo y maximiza la resolución.
El sistema consta de un prisma especial (prisma de Nomarski, prisma de Wollaston) en el condensador que divide la luz en un haz ordinario y otro extraordinario. La diferencia espacial entre los dos haces es mínima (inferior a la resolución máxima del objetivo). Después de atravesar la muestra, los haces se reúnen mediante un prisma similar en el objetivo.
En una muestra homogénea, no hay diferencia entre los dos haces y no se genera contraste. Sin embargo, cerca de un límite refractivo (digamos un núcleo dentro del citoplasma), la diferencia entre el haz ordinario y el extraordinario generará un relieve en la imagen. El contraste de interferencia diferencial requiere una fuente de luz polarizada para funcionar; se deben colocar dos filtros polarizadores en la trayectoria de la luz, uno debajo del condensador (el polarizador) y el otro encima del objetivo (el analizador).
Nota: En los casos en que el diseño óptico de un microscopio produce una separación lateral apreciable de los dos haces tenemos el caso de la microscopía de interferencia clásica, que no da como resultado imágenes en relieve, pero que sin embargo puede usarse para la determinación cuantitativa de espesores de masa de objetos microscópicos.
Reflejo de interferencia
Una técnica adicional que utiliza interferencia es la microscopía de reflexión de interferencia (también conocida como contraste de interferencia reflejada o RIC). Se basa en la adhesión celular al portaobjetos para producir una señal de interferencia. Si no hay una celda unida al vidrio, no habrá interferencia.
La microscopía de reflexión de interferencia se puede obtener utilizando los mismos elementos utilizados por DIC, pero sin los prismas. Además, la luz que se detecta se refleja y no se transmite como cuando se emplea DIC.
Fluorescencia
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Cuando ciertos compuestos se iluminan con luz de alta energía, emiten luz de menor frecuencia. Este efecto se conoce como fluorescencia. A menudo, las muestras muestran su imagen de autofluorescencia característica, basada en su composición química.
Este método es de vital importancia en las ciencias biológicas modernas, ya que puede ser extremadamente sensible y permitir la detección de moléculas individuales. Se pueden usar muchos tintes fluorescentes para teñir estructuras o compuestos químicos. Un método poderoso es la combinación de anticuerpos acoplados a un fluoróforo como en la inmunotinción. Ejemplos de fluoróforos de uso común son la fluoresceína o la rodamina.
Los anticuerpos se pueden personalizar para un compuesto químico. Por ejemplo, una estrategia de uso frecuente es la producción artificial de proteínas, basada en el código genético (ADN). Estas proteínas pueden luego usarse para inmunizar conejos, formando anticuerpos que se unen a la proteína. Luego, los anticuerpos se acoplan químicamente a un fluoróforo y se usan para rastrear las proteínas en las células bajo estudio.
Se han desarrollado proteínas fluorescentes de gran eficacia, como la proteína verde fluorescente (GFP), utilizando la técnica de fusión génica de biología molecular, un proceso que vincula la expresión del compuesto fluorescente con la de la proteína diana. Esta proteína fluorescente combinada es, en general, no tóxica para el organismo y rara vez interfiere con la función de la proteína en estudio. Las células u organismos modificados genéticamente expresan directamente las proteínas marcadas con fluorescencia, lo que permite el estudio de la función de la proteína original in vivo.
El crecimiento de los cristales de proteína da como resultado tanto cristales de proteína como de sal. Ambos son incoloros y microscópicos. La recuperación de los cristales de proteína requiere formación de imágenes que se puede realizar mediante la fluorescencia intrínseca de la proteína o mediante el uso de microscopía de transmisión. Ambos métodos requieren un microscopio ultravioleta ya que la proteína absorbe la luz a 280 nm. La proteína también emitirá fluorescencia a aproximadamente 353 nm cuando se excite con luz de 280 nm.
Dado que la emisión de fluorescencia difiere en la longitud de onda (color) de la luz de excitación, una imagen fluorescente ideal muestra solo la estructura de interés que se marcó con el tinte fluorescente. Esta alta especificidad condujo al uso generalizado de la microscopía de luz fluorescente en la investigación biomédica. Se pueden usar diferentes tintes fluorescentes para teñir diferentes estructuras biológicas, que luego se pueden detectar simultáneamente, sin dejar de ser específicos debido al color individual del tinte.
Para impedir que la luz de excitación llegue al observador o al detector, se necesitan juegos de filtros de alta calidad. Por lo general, consisten en un filtro de excitación que selecciona el rango de longitudes de onda de excitación, un espejo dicroico y un filtro de emisión que bloquea la luz de excitación. La mayoría de los microscopios de fluorescencia funcionan en modo Epi-iluminación (iluminación y detección desde un lado de la muestra) para disminuir aún más la cantidad de luz de excitación que ingresa al detector.
Véase también: microscopio de fluorescencia de reflexión interna total neurociencia
Confocales
La microscopía de escaneo láser confocal utiliza un rayo láser enfocado (por ejemplo, 488 nm) que se escanea a través de la muestra para excitar la fluorescencia punto por punto. La luz emitida se dirige a través de un orificio para evitar que la luz desenfocada llegue al detector, generalmente un tubo fotomultiplicador. La imagen se construye en una computadora, trazando las intensidades de fluorescencia medidas según la posición del láser de excitación. En comparación con la iluminación de muestra completa, la microscopía confocal proporciona una resolución lateral ligeramente superior y mejora significativamente el corte óptico (resolución axial). Por lo tanto, la microscopía confocal se usa comúnmente donde la estructura 3D es importante.
Una subclase de microscopios confocales son los microscopios de disco giratorio que pueden escanear múltiples puntos simultáneamente en la muestra. Un disco correspondiente con agujeros de alfiler rechaza la luz desenfocada. El detector de luz en un microscopio de disco giratorio es una cámara digital, típicamente EM-CCD o sCMOS.
Microscopía de dos fotones
Un microscopio de dos fotones también es un microscopio de escaneo láser, pero en lugar de luz láser UV, azul o verde, se usa un láser infrarrojo pulsado para la excitación. Solo en el diminuto foco del láser la intensidad es lo suficientemente alta como para generar fluorescencia mediante la excitación de dos fotones, lo que significa que no se genera fluorescencia desenfocada y no se necesita un orificio para limpiar la imagen. Esto permite obtener imágenes profundas en el tejido disperso, donde un microscopio confocal no podría recolectar fotones de manera eficiente. Los microscopios de dos fotones con detección de campo amplio se utilizan con frecuencia para la obtención de imágenes funcionales, p. imágenes de calcio, en tejido cerebral. Son comercializados como microscopios multifotónicos por varias empresas, aunque las ventajas de utilizar la excitación de 3 fotones en lugar de la de 2 fotones son marginales.
Microscopía de iluminación de un solo plano y microscopía de fluorescencia de lámina de luz
Usando un plano de luz formado al enfocar la luz a través de una lente cilíndrica en un ángulo estrecho o escaneando una línea de luz en un plano perpendicular al eje del objetivo, se pueden tomar secciones ópticas de alta resolución. La iluminación de un solo plano, o iluminación de lámina de luz, también se logra utilizando técnicas de formación de haz que incorporan expansores de haz de múltiples prismas. Las imágenes son capturadas por CCD. Estas variantes permiten una captura de imágenes muy rápida y con una alta relación señal/ruido.
Microscopía multifotónica de campo amplio
La microscopía multifotónica de campo amplio se refiere a una técnica de imagen óptica no lineal en la que se ilumina una gran área del objeto y se captura la imagen sin necesidad de escanear. Se requieren intensidades altas para inducir procesos ópticos no lineales como la fluorescencia de dos fotones o la generación de segundo armónico. En los microscopios multifotónicos de barrido, las altas intensidades se logran enfocando la luz con precisión, y la imagen se obtiene mediante el barrido del haz. En la microscopía multifotónica de campo amplio, las intensidades altas se logran mejor utilizando una fuente de láser pulsado ópticamente amplificada para lograr un campo de visión amplio (~100 µm). La imagen en este caso se obtiene como un solo cuadro con una cámara CCD sin necesidad de escanear, lo que hace que la técnica sea particularmente útil para visualizar procesos dinámicos simultáneamente en el objeto de interés. Con la microscopía multifotónica de campo amplio, la velocidad de fotogramas se puede aumentar hasta 1000 veces en comparación con la microscopía de barrido multifotónica. Sin embargo, al dispersar el tejido, la calidad de la imagen se degrada rápidamente al aumentar la profundidad.
Desconvolución
La microscopía de fluorescencia es una técnica poderosa para mostrar estructuras marcadas específicamente dentro de un entorno complejo y proporcionar información tridimensional de estructuras biológicas. Sin embargo, esta información se ve borrosa por el hecho de que, tras la iluminación, todas las estructuras marcadas con fluorescencia emiten luz, independientemente de si están enfocadas o no. Por lo tanto, una imagen de una determinada estructura siempre se ve borrosa por la contribución de la luz de las estructuras que están fuera de foco. Este fenómeno da como resultado una pérdida de contraste, especialmente cuando se utilizan objetivos con un alto poder de resolución, típicamente objetivos de inmersión en aceite con una gran apertura numérica.
Sin embargo, la borrosidad no es causada por procesos aleatorios, como la dispersión de la luz, sino que puede definirse bien por las propiedades ópticas de la formación de la imagen en el sistema de imágenes del microscopio. Si uno considera una pequeña fuente de luz fluorescente (esencialmente un punto brillante), la luz que proviene de este punto se dispersa más desde nuestra perspectiva a medida que el punto se vuelve más desenfocado. En condiciones ideales, esto produce un "reloj de arena" forma de esta fuente puntual en la tercera dimensión (axial). Esta forma se denomina función de dispersión de puntos (PSF) del sistema de imágenes del microscopio. Dado que cualquier imagen de fluorescencia se compone de una gran cantidad de pequeñas fuentes de luz fluorescente, se dice que la imagen está "convolucionada por la función de dispersión de puntos". A la derecha se muestra la PSF modelada matemáticamente de un sistema de imágenes pulsadas por láser de terahercios.
La salida de un sistema de imágenes se puede describir mediante la ecuación:
s()x,Sí.)=PSF()x,Sí.)Alternativa Alternativa o()x,Sí.)+n{displaystyle s(x,y)=PSF(x,y)*o(x,y)+n}
Donde n es el ruido aditivo. Conocer esta función de dispersión puntual significa que es posible revertir este proceso hasta cierto punto mediante métodos basados en computadora comúnmente conocidos como microscopía de deconvolución. Hay varios algoritmos disponibles para la deconvolución 2D o 3D. Se pueden clasificar aproximadamente en métodos no restaurativos y reparadores. Si bien los métodos no restaurativos pueden mejorar el contraste al eliminar la luz desenfocada de los planos focales, solo los métodos restaurativos pueden reasignar la luz a su lugar de origen adecuado. El procesamiento de imágenes fluorescentes de esta manera puede ser una ventaja sobre la adquisición directa de imágenes sin luz desenfocada, como las imágenes de microscopía confocal, porque las señales de luz eliminadas de otro modo se convierten en información útil. Para la deconvolución 3D, normalmente se proporciona una serie de imágenes tomadas desde diferentes planos focales (llamada pila Z) más el conocimiento del PSF, que se puede derivar experimental o teóricamente a partir del conocimiento de todos los parámetros contribuyentes del microscopio.
Técnicas de subdifracción
En los últimos tiempos se han desarrollado multitud de técnicas de microscopía de superresolución que eluden el límite de difracción.
Esto se logra principalmente mediante la obtención de imágenes de una muestra lo suficientemente estática varias veces y la modificación de la luz de excitación o la observación de cambios estocásticos en la imagen. Los métodos de desconvolución descritos en la sección anterior, que eliminan el desenfoque inducido por PSF y asignan un valor matemáticamente 'correcto' origen de la luz, aunque con una comprensión ligeramente diferente de lo que significa el valor de un píxel. Suponiendo que la mayor parte del tiempo, un solo fluoróforo contribuye a una sola mancha en una sola imagen tomada, las manchas en las imágenes se pueden reemplazar con su posición calculada, mejorando enormemente la resolución hasta muy por debajo del límite de difracción.
Para realizar tal suposición, el conocimiento y el control químico de la fotofísica de fluoróforos es el núcleo de estas técnicas, mediante las cuales se obtienen resoluciones de ~20 nanómetros.
Microscopía amplificada codificada en el tiempo en serie
La microscopía amplificada codificada en el tiempo en serie (STEAM, por sus siglas en inglés) es un método de imagen que proporciona una velocidad de obturación y una velocidad de fotogramas ultrarrápidas mediante el uso de amplificación de imagen óptica para sortear el compromiso fundamental entre sensibilidad y velocidad, y un fotodetector de un solo píxel para eliminar la necesidad de una matriz de detectores y limitaciones de tiempo de lectura El método es al menos 1000 veces más rápido que las cámaras CCD y CMOS de última generación. En consecuencia, es potencialmente útil para aplicaciones científicas, industriales y biomédicas que requieren altas tasas de adquisición de imágenes, incluido el diagnóstico en tiempo real y la evaluación de ondas de choque, microfluidos, MEMS y cirugía láser.
Extensiones
La mayoría de los instrumentos modernos brindan soluciones simples para la microfotografía y la grabación electrónica de imágenes. Sin embargo, tales capacidades no siempre están presentes y el microscopista más experimentado puede preferir una imagen dibujada a mano a una fotografía. Esto se debe a que un microscopista con conocimiento del tema puede convertir con precisión una imagen tridimensional en un dibujo bidimensional preciso. Sin embargo, en una fotografía u otro sistema de captura de imágenes, solo un plano delgado está siempre bien enfocado.
La creación de micrografías precisas requiere una técnica microscópica con un ocular monocular. Es esencial que ambos ojos estén abiertos y que el ojo que no está observando por el microscopio se concentre en una hoja de papel en el banco al lado del microscopio. Con práctica, y sin mover la cabeza ni los ojos, es posible trazar con precisión las formas observadas al "ver" la punta del lápiz en la imagen microscópica.
Siempre es menos cansado observar con el microscopio enfocado para que la imagen se vea al infinito y con los dos ojos abiertos en todo momento.
Otras mejoras
Microspectroscopia:espectroscopia con un microscopio
Radiografía
Como la resolución depende de la longitud de onda de la luz. La microscopía electrónica se ha desarrollado desde la década de 1930 y utiliza haces de electrones en lugar de luz. Debido a que la longitud de onda del haz de electrones es mucho más pequeña, la resolución es mucho mayor.
Aunque es menos común, la microscopía de rayos X también se ha desarrollado desde finales de la década de 1940. La resolución de la microscopía de rayos X se encuentra entre la microscopía óptica y la microscopía electrónica.
Microscopía electrónica
Hasta la invención de la microscopía de subdifracción, la longitud de onda de la luz limitaba la resolución de la microscopía tradicional a alrededor de 0,2 micrómetros. Para obtener una resolución más alta, en los microscopios electrónicos se utiliza un haz de electrones con una longitud de onda mucho más pequeña.
- La microscopía electrones de transmisión (TEM) es bastante similar al microscopio ligero compuesto, enviando un haz de electrones a través de una rebanada muy fina del espécimen. El límite de resolución en 2005 era de alrededor de 0,05 nanometro y no ha aumentado apreciablemente desde entonces.
- La microscopía de electrones escaneados (SEM) visualiza detalles sobre las superficies de los especímenes y da una vista 3D muy agradable. Da resultados como los del microscopio de luz estéreo. La mejor resolución para SEM en 2011 fue 0.4 nanometro.
Los microscopios electrónicos equipados para espectroscopia de rayos X pueden proporcionar análisis elementales cualitativos y cuantitativos. Este tipo de microscopio electrónico, también conocido como microscopio electrónico analítico, puede ser una herramienta muy poderosa para la investigación de nanomateriales.
Microscopía de sonda de barrido
Esta es una técnica de subdifracción. Ejemplos de microscopios de sonda de barrido son el microscopio de fuerza atómica (AFM), el microscopio de túnel de barrido, el microscopio de fuerza fotónica y el microscopio de seguimiento de recurrencia. Todos estos métodos utilizan el contacto físico de una punta de sonda sólida para escanear la superficie de un objeto, que se supone que es casi plano.
Fuerza ultrasónica
La microscopía de fuerza ultrasónica (UFM) se ha desarrollado para mejorar los detalles y el contraste de la imagen en imágenes "planas" áreas de interés donde las imágenes AFM tienen un contraste limitado. La combinación de AFM-UFM permite generar una imagen microscópica acústica de campo cercano. La punta AFM se utiliza para detectar las ondas ultrasónicas y supera la limitación de longitud de onda que se produce en la microscopía acústica. Al usar los cambios elásticos debajo de la punta AFM, se puede generar una imagen con mucho más detalle que la topografía AFM.
La microscopía de fuerza ultrasónica permite el mapeo local de la elasticidad en la microscopía de fuerza atómica mediante la aplicación de vibración ultrasónica al voladizo o muestra. Para analizar los resultados de la microscopía de fuerza ultrasónica de forma cuantitativa, se realiza una medición de la curva fuerza-distancia con vibración ultrasónica aplicada a la base del voladizo, y los resultados se comparan con un modelo de la dinámica del voladizo y la interacción punta-muestra basada en la técnica de diferencias finitas.
Microscopía ultravioleta
Los microscopios ultravioleta tienen dos propósitos principales. El primero es utilizar la longitud de onda más corta de la energía electromagnética ultravioleta para mejorar la resolución de la imagen más allá del límite de difracción de los microscopios ópticos estándar. Esta técnica se utiliza para la inspección no destructiva de dispositivos con características muy pequeñas, como las que se encuentran en los semiconductores modernos. La segunda aplicación de los microscopios UV es la mejora del contraste, en la que se mejora la respuesta de las muestras individuales, en relación con su entorno, debido a la interacción de la luz con las moléculas dentro de la propia muestra. Un ejemplo está en el crecimiento de cristales de proteína. Los cristales de proteína se forman en soluciones salinas. Como los cristales de sal y proteína se forman en el proceso de crecimiento, y ambos son comúnmente transparentes para el ojo humano, no se pueden diferenciar con un microscopio óptico estándar. Como el triptófano de la proteína absorbe la luz a 280 nm, las imágenes con un microscopio UV con filtros de paso de banda de 280 nm simplifican la diferenciación entre los dos tipos de cristales. Los cristales de proteína aparecen oscuros mientras que los cristales de sal son transparentes.
Microscopía infrarroja
El término microscopía infrarroja se refiere a la microscopía realizada en longitudes de onda infrarrojas. En la configuración típica del instrumento, un espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) se combina con un microscopio óptico y un detector infrarrojo. El detector de infrarrojos puede ser un detector de un solo punto, una matriz lineal o una matriz de plano focal 2D. FTIR proporciona la capacidad de realizar análisis químicos a través de espectroscopia infrarroja y el microscopio y el detector puntual o de matriz permiten que este análisis químico se resuelva espacialmente, es decir, se realice en diferentes regiones de la muestra. Como tal, la técnica también se denomina microespectroscopia infrarroja. Una arquitectura alternativa llamada Laser Direct Infrared Imaging (LDIR) implica la combinación de una fuente de luz infrarroja sintonizable y un detector de punto único en un objetivo volador. Esta técnica se utiliza con frecuencia para la obtención de imágenes químicas infrarrojas, donde el contraste de la imagen está determinado por la respuesta de regiones de muestra individuales a longitudes de onda IR particulares seleccionadas por el usuario, generalmente bandas de absorción IR específicas y resonancias moleculares asociadas. Una limitación clave de la microespectroscopia infrarroja convencional es que la resolución espacial está limitada por la difracción. En concreto, la resolución espacial se limita a una cifra relacionada con la longitud de onda de la luz. Para microscopios IR prácticos, la resolución espacial está limitada a 1-3 veces la longitud de onda, según la técnica específica y el instrumento utilizado. Para longitudes de onda de IR medio, esto establece un límite de resolución espacial práctico de ~3-30 μm.
También existen versiones IR de microscopía de subdifracción. Estos incluyen microscopio óptico de barrido de campo cercano IR (NSOM), microespectroscopía fototérmica y espectroscopía infrarroja basada en microscopio de fuerza atómica (AFM-IR), así como microscopía óptica de barrido de campo cercano de tipo dispersión (s-SNOM) & nano-FTIR que proporciona resolución espacial a nanoescala en longitudes de onda IR.
Microscopía holográfica digital
En la microscopía holográfica digital (DHM), los frentes de onda de interferencia de una fuente de luz coherente (monocromática) se registran en un sensor. La imagen es reconstruida digitalmente por una computadora a partir del holograma grabado. Además de la imagen ordinaria de campo claro, se crea una imagen de cambio de fase.
El DHM puede funcionar tanto en modo de reflexión como de transmisión. En el modo de reflexión, la imagen de cambio de fase proporciona una medida de distancia relativa y, por lo tanto, representa un mapa topográfico de la superficie reflectante. En el modo de transmisión, la imagen de cambio de fase proporciona una medición cuantitativa sin etiquetas del espesor óptico de la muestra. Las imágenes de cambio de fase de células biológicas son muy similares a las imágenes de células teñidas y han sido analizadas con éxito por software de análisis de alto contenido.
Una característica única de DHM es la capacidad de ajustar el enfoque después de grabar la imagen, ya que el holograma graba todos los planos de enfoque simultáneamente. Esta función permite obtener imágenes de partículas en movimiento en un volumen o escanear rápidamente una superficie. Otra característica atractiva es la capacidad de DHM para usar ópticas de bajo costo mediante la corrección de aberraciones ópticas por software.
Patología digital (microscopía virtual)
La patología digital es un entorno de información basado en imágenes activado por tecnología informática que permite la gestión de la información generada a partir de un portaobjetos digital. La patología digital está habilitada en parte por la microscopía virtual, que es la práctica de convertir portaobjetos de vidrio en portaobjetos digitales que se pueden ver, administrar y analizar.
Microscopía láser
La microscopía láser es un campo en rápido crecimiento que utiliza fuentes de iluminación láser en diversas formas de microscopía. Por ejemplo, la microscopía láser centrada en aplicaciones biológicas utiliza láseres de pulso ultracorto, en una serie de técnicas etiquetadas como microscopía no lineal, microscopía de saturación y microscopía de excitación de dos fotones.
Los láseres de rayos X de laboratorio de pulso corto y alta intensidad han estado en desarrollo durante varios años. Cuando esta tecnología llegue a buen término, será posible obtener imágenes tridimensionales ampliadas de estructuras biológicas elementales en estado vivo en un instante definido con precisión. Para un contraste óptimo entre el agua y la proteína y para la mejor sensibilidad y resolución, el láser debe sintonizarse cerca de la línea de nitrógeno a unos 0,3 nanómetros. La resolución estará limitada principalmente por la expansión hidrodinámica que se produce mientras se registra el número necesario de fotones. Así, mientras el espécimen es destruido por la exposición, su configuración puede ser capturada antes de que explote.
Los científicos han estado trabajando en diseños prácticos y prototipos de microscopios holográficos de rayos X, a pesar del prolongado desarrollo del láser apropiado.
Microscopía fotoacústica
Técnica de microscopía que se basa en el efecto fotoacústico, es decir, la generación de (ultra)sonido causado por la absorción de luz. Un rayo láser enfocado y de intensidad modulada se escanea en forma de trama sobre una muestra. El (ultra)sonido generado se detecta mediante un transductor de ultrasonidos. Comúnmente se emplean transductores ultrasónicos piezoeléctricos.
El contraste de imagen está relacionado con el coeficiente de absorción de la muestra α α {displaystyle alpha }. Esto contrasta con la microscopía de campo brillante o oscuro, donde el contraste de imagen se debe a la transmisión o dispersión. En principio, el contraste de la microscopía de fluorescencia es proporcional a la absorción de la muestra también. Sin embargo, en la microscopía de fluorescencia el rendimiento cuántico de fluorescencia .. fl{displaystyle eta _{fl} necesita ser desigual a cero para detectar una señal. En la microscopía fotoacústica, sin embargo, cada sustancia absorbente da una señal fotoacústica PA{displaystyle PA que es proporcional a
PA∝ ∝ α α Alternativa Alternativa .. Alternativa Alternativa ()()1− − .. fl)Alternativa Alternativa Eg+()Elaser− − Eg)){displaystyle PApropto alpha *Gamma *(1-eta _{fl})*E_{g}+(E_{laser}-E_{g})}
Aquí. .. {displaystyle "Gamma" es el coeficiente Grüneisen, Elaser{displaystyle E_{laser} es la energía foton del láser y Eg{displaystyle E_{g} es la energía de la brecha de banda de la muestra. Por lo tanto, la microscopía fotoacústica parece adecuada como técnica complementaria a la microscopía de fluorescencia, ya que un rendimiento cuántico de alta fluorescencia conduce a señales de fluorescencia alta y un rendimiento cuántico de baja fluorescencia conduce a señales fotoacústicas altas.
Despreciando los efectos no lineales, la resolución lateral dx está limitada por el límite de difracción de Abbe:
dx=λ λ /()2Alternativa Alternativa NA){displaystyle dx=lambda /(2*NA)}
Donde λ λ {displaystyle lambda } es la longitud de onda del láser de excitación y NA es la abertura numérica de la lente objetiva. El límite de difracción de la Abadía sostiene si el frente de onda entrante es paralelo. En realidad, sin embargo, el perfil de haz láser es Gaussian. Por lo tanto, para calcular la resolución alcanzable, las fórmulas para las vigas gausianas truncadas tienen que ser utilizadas.
Microscopía amateur
Microscopía amateur es la investigación y observación de especímenes biológicos y no biológicos con fines recreativos. Los coleccionistas de minerales, insectos, conchas marinas y plantas pueden usar microscopios como herramientas para descubrir características que les ayuden a clasificar los artículos que recolectan. Otros aficionados pueden estar interesados en observar la vida que se encuentra en el agua del estanque y de otras muestras. Los microscopios también pueden resultar útiles para la evaluación de la calidad del agua para las personas que tienen un acuario doméstico. La documentación fotográfica y el dibujo de las imágenes microscópicas son placeres adicionales. Hay concursos de microfotografías artísticas. Los participantes de este pasatiempo pueden usar portaobjetos microscópicos preparados comercialmente o preparar sus propios portaobjetos.
Si bien la microscopía es una herramienta central en la documentación de especímenes biológicos, a menudo es insuficiente para justificar la descripción de una nueva especie basada únicamente en investigaciones microscópicas. A menudo, las pruebas genéticas y bioquímicas son necesarias para confirmar el descubrimiento de una nueva especie. Un laboratorio y acceso a la literatura académica es una necesidad. Hay, sin embargo, una ventaja que los aficionados tienen sobre los profesionales: tiempo para explorar su entorno. A menudo, los aficionados avanzados se unen a los profesionales para validar sus hallazgos y posiblemente describir nuevas especies.
A fines del siglo XIX, la microscopía amateur se convirtió en un pasatiempo popular en los Estados Unidos y Europa. Varios 'aficionados profesionales' los filántropos les pagaban por sus viajes de muestreo y exploraciones microscópicas, para mantenerlos entretenidos el domingo por la tarde (por ejemplo, el especialista en diatomeas A. Grunow, siendo pagado por (entre otros) un industrial belga). El profesor John Phin publicó "Consejos prácticos sobre la selección y el uso del microscopio (segunda edición, 1878)," y también fue editor del "American Journal of Microscopy."
Ejemplos de imágenes de microscopía amateur:
"Abeja de casa" Mouth 100X
Rice Stem cs 400X
Rabbit Testis 100X
Fern Prothallium 400X
Aplicación en ciencia forense
La microscopía tiene aplicaciones en las ciencias forenses. El microscopio puede detectar, resolver y generar imágenes de los elementos de evidencia más pequeños, a menudo sin alteración ni destrucción. El microscopio se utiliza para identificar y comparar fibras, pelos, suelos y polvo... etc.
En marcas de tinta, manchas de sangre o balas, no se requiere tratamiento de muestra y la evidencia se muestra directamente del examen microscópico. Para rastros de materia particular, la preparación de la muestra debe hacerse antes de que ocurra el examen microscópico.
Los microscopios de luz son los más utilizados en medicina forense, utilizan fotones para formar imágenes, los microscopios que son más aplicables para examinar muestras forenses son los siguientes:
1. El microscopio compuesto
2. El microscopio de comparación
3. El microscopio estereoscópico
4. El microscopio polarizador
5. El microespectrofotómetro
Esta diversidad de tipos de microscopios en aplicaciones forenses proviene principalmente de sus rangos de magnificación, que son (1- 1200X), (50-30,000X) y (500- 250,000X) para la microscopía óptica, SEM y TEM respectivamente.
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