Microsatélite (genética)

Un microsatélite es un tramo de ADN repetitivo en el que ciertos motivos de ADN (que varían en longitud de uno a seis o más pares de bases) se repiten, normalmente de 5 a 50 veces. Los microsatélites se encuentran en miles de lugares dentro del genoma de un organismo. Tienen una tasa de mutación más alta que otras áreas del ADN, lo que conduce a una gran diversidad genética. Los genetistas forenses y en genealogía genética a menudo se refieren a los microsatélites como repeticiones cortas en tándem (STR) o como repeticiones de secuencia simple (SSR) por los genetistas de plantas.

Los microsatélites y sus primos más largos, los minisatélites, juntos se clasifican como ADN VNTR (número variable de repeticiones en tándem). El nombre de ADN "satélite" se refiere a la observación temprana de que la centrifugación del ADN genómico en un tubo de ensayo separa una capa prominente de ADN a granel de las capas "satélite" de ADN repetitivo que la acompañan.

Se utilizan ampliamente para la elaboración de perfiles de ADN en el diagnóstico del cáncer, en el análisis de parentesco (especialmente las pruebas de paternidad) y en la identificación forense. También se utilizan en el análisis de ligamiento genético para localizar un gen o una mutación responsable de un rasgo o enfermedad determinada. Los microsatélites también se utilizan en genética de poblaciones para medir los niveles de parentesco entre subespecies, grupos e individuos.

Historia

Aunque el primer microsatélite fue caracterizado en 1984 en la Universidad de Leicester por Weller, Jeffreys y sus colegas como una repetición polimórfica GGAT en el gen de la mioglobina humana, el término "microsatélite" fue introducido más tarde, en 1989, por Litt y Luty. El nombre de ADN "satélite" se refiere a la observación temprana de que la centrifugación del ADN genómico en un tubo de ensayo separa una capa prominente de ADN a granel de las capas "satélite" de ADN repetitivo que la acompañan.La creciente disponibilidad de amplificación de ADN por PCR a principios de la década de 1990 desencadenó una gran cantidad de estudios que utilizan la amplificación de microsatélites como marcadores genéticos para medicina forense, pruebas de paternidad y clonación posicional para encontrar el gen subyacente a un rasgo o enfermedad. Las primeras aplicaciones destacadas incluyen la identificación mediante genotipado de microsatélites de los restos óseos de una víctima de asesinato británica de ocho años de edad (Hagelberg et al. 1991) y del médico del campo de concentración de Auschwitz, Josef Mengele, que escapó a América del Sur después de la Segunda Guerra Mundial (Hagelberg et al. 1991). Jeffreys et al. 1992).

Estructuras, ubicaciones y funciones.

Un microsatélite es un tramo de motivos de ADN repetidos en tándem (es decir, adyacentes) que varían en longitud de uno a seis o hasta diez nucleótidos (la definición exacta y la delimitación de los minisatélites más largos varía de un autor a otro), y normalmente se repiten 5– 50 veces. Por ejemplo, la secuencia TATATATATA es un microsatélite de dinucleótido y GTCGTCGTCGTCGTC es un microsatélite de trinucleótido (siendo A Adenina, G Guanina, C Citosina y T Timina). Las unidades repetidas de cuatro y cinco nucleótidos se denominan motivos de tetranucleótidos y pentanucleótidos, respectivamente. La mayoría de los eucariotas tienen microsatélites, con la notable excepción de algunas especies de levaduras. Los microsatélites se distribuyen por todo el genoma.El genoma humano, por ejemplo, contiene entre 50 000 y 100 000 microsatélites de dinucleótidos y un número menor de microsatélites de tri, tetra y pentanucleótidos. Muchos están ubicados en partes no codificantes del genoma humano y, por lo tanto, no producen proteínas, pero también pueden ubicarse en regiones reguladoras y regiones codificantes.

Los microsatélites en regiones no codificantes pueden no tener ninguna función específica y, por lo tanto, es posible que no se seleccionen; esto les permite acumular mutaciones sin obstáculos a lo largo de las generaciones y da lugar a una variabilidad que puede utilizarse con fines de identificación y huellas dactilares del ADN. Otros microsatélites están ubicados en regiones reguladoras flanqueantes o intrónicas de genes, o directamente en codones de genes; las mutaciones de microsatélites en tales casos pueden conducir a cambios fenotípicos y enfermedades, especialmente en enfermedades de expansión de tripletes como el síndrome de X frágil y la enfermedad de Huntington.

Los telómeros en los extremos de los cromosomas, que se cree que están involucrados en el envejecimiento/senescencia, consisten en ADN repetitivo, con el motivo de repetición hexanucleotídico TTAGGG en los vertebrados. Por lo tanto, se clasifican como minisatélites. De manera similar, los insectos tienen motivos repetidos más cortos en sus telómeros que podrían considerarse microsatélites.

Mecanismos de mutación y tasas de mutación.

A diferencia de las mutaciones puntuales, que afectan solo a un solo nucleótido, las mutaciones de microsatélites conducen a la ganancia o pérdida de una unidad de repetición completa y, a veces, a dos o más repeticiones simultáneamente. Por lo tanto, se espera que la tasa de mutación en los loci de microsatélites difiera de otras tasas de mutación, como las tasas de sustitución de bases. Se debate la causa real de las mutaciones en los microsatélites.

Una causa propuesta de tales cambios de longitud es el deslizamiento de la replicación, causado por los desajustes entre las hebras de ADN mientras se replican durante la meiosis. La ADN polimerasa, la enzima responsable de leer el ADN durante la replicación, puede deslizarse mientras se mueve a lo largo de la hebra molde y continuar en el nucleótido equivocado. El deslizamiento de la ADN polimerasa es más probable que ocurra cuando se replica una secuencia repetitiva (como CGCGCG). Debido a que los microsatélites consisten en secuencias tan repetitivas, la ADN polimerasa puede cometer errores a un ritmo mayor en estas regiones de secuencia. Varios estudios han encontrado evidencia de que el deslizamiento es la causa de las mutaciones de microsatélites. Por lo general, el deslizamiento en cada microsatélite ocurre aproximadamente una vez cada 1000 generaciones.Por lo tanto, los cambios de deslizamiento en el ADN repetitivo son tres órdenes de magnitud más comunes que las mutaciones puntuales en otras partes del genoma. La mayoría de los deslizamientos dan como resultado un cambio de solo una unidad repetida, y las tasas de deslizamiento varían para diferentes longitudes de alelo y tamaños de unidades repetidas, y dentro de diferentes especies. Si hay una gran diferencia de tamaño entre los alelos individuales, entonces puede haber una mayor inestabilidad durante la recombinación en la meiosis.

Otra posible causa de mutaciones de microsatélites son las mutaciones puntuales, en las que solo un nucleótido se copia incorrectamente durante la replicación. Un estudio que comparó los genomas humanos y de primates encontró que la mayoría de los cambios en el número de repeticiones en microsatélites cortos aparecen debido a mutaciones puntuales en lugar de deslizamiento.

Tasas de mutación de microsatélites

Las tasas de mutación de microsatélites varían con la posición de la base en relación con el microsatélite, el tipo de repetición y la identidad de la base. La tasa de mutación aumenta específicamente con el número de repeticiones, alcanza un máximo de seis a ocho repeticiones y luego vuelve a disminuir. El aumento de la heterocigosidad en una población también aumentará las tasas de mutación de microsatélites, especialmente cuando hay una gran diferencia de longitud entre los alelos. Esto probablemente se deba a que los cromosomas homólogos con brazos de longitudes desiguales causan inestabilidad durante la meiosis.

Se han realizado estimaciones directas de las tasas de mutación de microsatélites en numerosos organismos, desde insectos hasta humanos. En la langosta del desierto Schistocerca gregaria, la tasa de mutación de microsatélites se estimó en 2,1 x 10 por generación por locus. La tasa de mutación de microsatélites en las líneas germinales masculinas humanas es de cinco a seis veces mayor que en las líneas germinales femeninas y varía de 0 a 7 x 10 por locus por gameto por generación. En el nematodo Pristionchus pacificus, la tasa estimada de mutación de microsatélites oscila entre 8,9 × 10 y 7,5 × 10 por locus por generación.

Efectos biológicos de las mutaciones de microsatélites

Muchos microsatélites se encuentran en el ADN no codificante y son biológicamente silenciosos. Otros están ubicados en el ADN regulador o incluso codificante: las mutaciones de microsatélites en tales casos pueden conducir a cambios fenotípicos y enfermedades. Un estudio de todo el genoma estima que la variación de microsatélites contribuye entre un 10% y un 15% de la variación de la expresión génica hereditaria en humanos.

Efectos sobre las proteínas

En los mamíferos, del 20% al 40% de las proteínas contienen secuencias repetidas de aminoácidos codificados por repeticiones de secuencias cortas. La mayoría de las repeticiones de secuencias cortas dentro de las porciones del genoma que codifican proteínas tienen una unidad repetitiva de tres nucleótidos, ya que esa longitud no causará cambios de marco cuando se muta. Cada secuencia repetitiva de trinucleótidos se transcribe en una serie repetitiva del mismo aminoácido. En las levaduras, los aminoácidos repetidos más comunes son la glutamina, el ácido glutámico, la asparagina, el ácido aspártico y la serina.

Las mutaciones en estos segmentos repetitivos pueden afectar las propiedades físicas y químicas de las proteínas, con el potencial de producir cambios graduales y predecibles en la acción de las proteínas. Por ejemplo, los cambios de longitud en las regiones que se repiten en tándem en el gen Runx2 dan lugar a diferencias en la longitud facial de los perros domésticos (Canis familiaris), con una asociación entre longitudes de secuencia más largas y caras más largas. Esta asociación también se aplica a una gama más amplia de especies de Carnivora. Los cambios de longitud en los tractos de polialanina dentro del gen HoxA13 están relacionados con el síndrome mano-pie-genital, un trastorno del desarrollo en humanos.Los cambios de longitud en otras repeticiones de tripletes están relacionados con más de 40 enfermedades neurológicas en humanos, en particular enfermedades de expansión de tripletes como el síndrome de X frágil y la enfermedad de Huntington. Los cambios evolutivos por el deslizamiento de la replicación también ocurren en organismos más simples. Por ejemplo, los cambios en la longitud de los microsatélites son comunes dentro de las proteínas de la membrana de la superficie de la levadura, lo que proporciona una rápida evolución de las propiedades celulares. Específicamente, los cambios de longitud en el gen FLO1 controlan el nivel de adhesión a los sustratos. Las repeticiones de secuencias cortas también proporcionan un cambio evolutivo rápido a las proteínas de superficie en las bacterias patógenas; esto puede permitirles mantenerse al día con los cambios inmunológicos en sus huéspedes. Cambios de longitud en repeticiones de secuencia corta en un hongo (Neurospora crassa) controlan la duración de sus ciclos de reloj circadiano.

Efectos sobre la regulación génica

Los cambios de longitud de los microsatélites dentro de los promotores y otras regiones reguladoras en cis pueden cambiar la expresión génica rápidamente, entre generaciones. El genoma humano contiene muchas (>16.000) repeticiones de secuencias cortas en regiones reguladoras, que proporcionan "perillas de ajuste" en la expresión de muchos genes.

Los cambios de longitud en las SSR bacterianas pueden afectar la formación de fimbrias en Haemophilus influenzae, al alterar el espaciado de los promotores. Los microsatélites de dinucleótidos están vinculados a una abundante variación en las regiones de control reguladoras en cis en el genoma humano. Los microsatélites en las regiones de control del gen del receptor de vasopresina 1a en ratones de campo influyen en su comportamiento social y nivel de monogamia.

En el sarcoma de Ewing (un tipo de cáncer de hueso doloroso en humanos jóvenes), una mutación puntual ha creado un microsatélite GGAA extendido que se une a un factor de transcripción, que a su vez activa el gen EGR2 que impulsa el cáncer. Además, otros microsatélites GGAA pueden influir en la expresión de genes que contribuyen al resultado clínico de los pacientes con sarcoma de Ewing.

Efectos dentro de los intrones

Los microsatélites dentro de los intrones también influyen en el fenotipo, a través de medios que actualmente no se comprenden. Por ejemplo, una expansión del triplete GAA en el primer intrón del gen X25 parece interferir con la transcripción y provoca la ataxia de Friedreich. Las repeticiones en tándem en el primer intrón del gen de la asparagina sintetasa están relacionadas con la leucemia linfoblástica aguda. Un polimorfismo repetido en el cuarto intrón del gen NOS3 está relacionado con la hipertensión en una población tunecina. Las longitudes de repetición reducidas en el gen EGFR están relacionadas con los osteosarcomas.

Se sabe que una forma arcaica de empalme conservada en el pez cebra usa secuencias de microsatélites dentro del ARNm intrónico para la eliminación de intrones en ausencia de U2AF2 y otra maquinaria de empalme. Se teoriza que estas secuencias forman configuraciones de hoja de trébol altamente estables que acercan los sitios de empalme de los intrones 3 'y 5', reemplazando efectivamente el spliceosoma. Se cree que este método de empalme de ARN se separó de la evolución humana en la formación de tetrápodos y representa un artefacto de un mundo de ARN.

Efectos dentro de los transposones

Casi el 50% del genoma humano está contenido en varios tipos de elementos transponibles (también llamados transposones o "genes saltadores"), y muchos de ellos contienen ADN repetitivo. Es probable que las repeticiones de secuencias cortas en esos lugares también participen en la regulación de la expresión génica.

Aplicaciones

Los microsatélites se utilizan para evaluar las deleciones del ADN cromosómico en el diagnóstico del cáncer. Los microsatélites se utilizan ampliamente para la elaboración de perfiles de ADN, también conocidos como "huellas dactilares genéticas", de manchas delictivas (en medicina forense) y de tejidos (en pacientes trasplantados). También se usan ampliamente en análisis de parentesco (más comúnmente en pruebas de paternidad). Además, los microsatélites se utilizan para mapear ubicaciones dentro del genoma, específicamente en el análisis de ligamiento genético para ubicar un gen o una mutación responsable de un rasgo o enfermedad determinada. Como un caso especial de mapeo, pueden usarse para estudios de duplicación o eliminación de genes. Los investigadores utilizan microsatélites en genética de poblaciones y en proyectos de conservación de especies. Los genetistas de plantas han propuesto el uso de microsatélites para la selección asistida por marcadores de rasgos deseables en el fitomejoramiento.

Diagnóstico de cáncer

En las células tumorales, cuyos controles de replicación están dañados, se pueden ganar o perder microsatélites con una frecuencia especialmente alta durante cada ronda de mitosis. Por lo tanto, una línea de células tumorales podría mostrar una huella genética diferente de la del tejido huésped y, especialmente en el cáncer colorrectal, podría presentarse con pérdida de heterocigosidad. Por lo tanto, los microsatélites se han utilizado de forma rutinaria en el diagnóstico del cáncer para evaluar la progresión del tumor.

Huellas dactilares médicas y forenses

El análisis de microsatélites se hizo popular en el campo de la ciencia forense en la década de 1990. Se utiliza para la toma de huellas dactilares genéticas de personas en las que permite la identificación forense (por lo general, hacer coincidir una mancha de crimen con una víctima o un perpetrador). También se utiliza para el seguimiento de pacientes con trasplante de médula ósea.

Los microsatélites que se utilizan hoy en día para el análisis forense son todos repeticiones de tetranucleótidos o pentanucleótidos, ya que brindan un alto grado de datos sin errores y son lo suficientemente cortos como para sobrevivir a la degradación en condiciones no ideales. Incluso las secuencias repetidas más cortas tenderían a sufrir artefactos como el tartamudeo de la PCR y la amplificación preferencial, mientras que las secuencias repetidas más largas sufrirían más la degradación ambiental y se amplificarían menos por la PCR.Otra consideración forense es que se debe respetar la privacidad médica de la persona, de modo que se elijan STR forenses que no sean codificantes, que no influyan en la regulación génica y que, por lo general, no sean STR de trinucleótidos que podrían estar involucrados en enfermedades de expansión de tripletes como la enfermedad de Huntington. Los perfiles forenses de STR se almacenan en bancos de datos de ADN, como la base de datos nacional de ADN del Reino Unido (NDNAD), el CODIS estadounidense o el NCIDD australiano.

Análisis de parentesco (pruebas de paternidad)

Los microsatélites autosómicos se utilizan ampliamente para el perfil de ADN en el análisis de parentesco (más comúnmente en las pruebas de paternidad). Los Y-STR heredados del padre (microsatélites en el cromosoma Y) a menudo se usan en las pruebas de ADN genealógico.

Análisis de ligamiento genético

Durante la década de 1990 y los primeros años de este milenio, los microsatélites fueron los marcadores genéticos del caballo de batalla para los escaneos de todo el genoma para localizar cualquier gen responsable de un fenotipo o enfermedad determinada, utilizando observaciones de segregación a lo largo de generaciones de un pedigrí muestreado. Aunque el surgimiento de plataformas de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rentables y de mayor rendimiento condujo a la era del SNP para escaneos genómicos, los microsatélites siguen siendo medidas altamente informativas de variación genómica para estudios de ligamiento y asociación. Su ventaja continua radica en su mayor diversidad alélica que los SNP bialélicos, por lo que los microsatélites pueden diferenciar alelos dentro de un bloque de interés de desequilibrio de enlace definido por SNP. Por lo tanto,

Genética de poblaciones

Los microsatélites se popularizaron en la genética de poblaciones durante la década de 1990 porque, a medida que la PCR se volvió omnipresente en los laboratorios, los investigadores pudieron diseñar cebadores y amplificar conjuntos de microsatélites a bajo costo. Sus usos son muy variados. Un microsatélite con una historia evolutiva neutral lo hace aplicable para medir o inferir cuellos de botella, adaptación local, el índice de fijación alélica (_FST), tamaño de la población y flujo de genes. A medida que la secuenciación de próxima generación se vuelve más asequible, el uso de microsatélites ha disminuido, sin embargo, siguen siendo una herramienta crucial en el campo.

Fitomejoramiento

La selección asistida por marcadores o la selección asistida por marcadores (MAS, por sus siglas en inglés) es un proceso de selección indirecta en el que se selecciona un rasgo de interés en función de un marcador (variación morfológica, bioquímica o de ADN/ARN) vinculado a un rasgo de interés (p. ej., productividad, resistencia a enfermedades, estrés). tolerancia y calidad), más que en el rasgo en sí. Se ha propuesto el uso de microsatélites como tales marcadores para ayudar al fitomejoramiento.

Análisis

El ADN repetitivo no se analiza fácilmente con los métodos de secuenciación de ADN de próxima generación, que luchan con las extensiones homopoliméricas. Por lo tanto, los microsatélites normalmente se analizan mediante la amplificación por PCR convencional y la determinación del tamaño del amplicón, a veces seguidas de la secuenciación del ADN de Sanger.

En medicina forense, el análisis se realiza extrayendo ADN nuclear de las células de una muestra de interés, y luego amplificando regiones polimórficas específicas del ADN extraído por medio de la reacción en cadena de la polimerasa. Una vez amplificadas estas secuencias, se resuelven mediante electroforesis en gel o electroforesis capilar, lo que permitirá al analista determinar cuántas repeticiones hay de la secuencia de microsatélites en cuestión. Si el ADN se resolvió mediante electroforesis en gel, el ADN se puede visualizar mediante tinción con plata (baja sensibilidad, segura, económica) o con un colorante intercalado como el bromuro de etidio (bastante sensible, riesgos moderados para la salud, económico), o como la mayoría de los modernos uso de laboratorios forenses, tintes fluorescentes (altamente sensibles, seguros, caros).Los instrumentos construidos para resolver fragmentos de microsatélites mediante electroforesis capilar también utilizan colorantes fluorescentes. Los perfiles forenses se almacenan en los principales bancos de datos. La base de datos británica para la identificación de loci de microsatélites se basó originalmente en el sistema británico SGM+ que usaba 10 loci y un marcador de sexo. Los estadounidenses aumentaron este número a 13 loci. La base de datos australiana se llama NCIDD, y desde 2013 ha estado utilizando 18 marcadores básicos para el perfil de ADN.

Amplificación

Los microsatélites se pueden amplificar para su identificación mediante el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando las secuencias únicas de las regiones flanqueantes como cebadores. El ADN se desnaturaliza repetidamente a alta temperatura para separar la cadena doble, luego se enfría para permitir la hibridación de los cebadores y la extensión de las secuencias de nucleótidos a través del microsatélite. Este proceso da como resultado la producción de suficiente ADN para ser visible en geles de agarosa o poliacrilamida; solo se necesitan pequeñas cantidades de ADN para la amplificación porque de esta manera el termociclado crea un aumento exponencial en el segmento replicado. Con la abundancia de tecnología PCR, los cebadores que flanquean los loci de microsatélites son simples y rápidos de usar, pero el desarrollo de cebadores que funcionen correctamente suele ser un proceso tedioso y costoso.

Diseño de cebadores de microsatélites

Si busca marcadores de microsatélites en regiones específicas de un genoma, por ejemplo, dentro de un intrón particular, los cebadores se pueden diseñar manualmente. Esto implica buscar repeticiones de microsatélites en la secuencia de ADN genómico, lo que se puede hacer a simple vista o mediante el uso de herramientas automatizadas como el enmascarador de repetición. Una vez que se determinan los microsatélites potencialmente útiles, las secuencias flanqueantes se pueden usar para diseñar cebadores de oligonucleótidos que amplificarán la repetición específica del microsatélite en una reacción de PCR.

Los cebadores de microsatélites aleatorios se pueden desarrollar clonando segmentos aleatorios de ADN de las especies focales. Estos segmentos aleatorios se insertan en un vector de plásmido o bacteriófago, que a su vez se implanta en la bacteria Escherichia coli. Luego se desarrollan las colonias y se analizan con secuencias de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia que se hibridarán con una repetición de microsatélite, si está presente en el segmento de ADN. Si se pueden obtener clones positivos a partir de este procedimiento, se secuencia el ADN y se eligen los cebadores de PCR de las secuencias que flanquean dichas regiones para determinar un locus específico. Este proceso implica un ensayo y error significativo por parte de los investigadores, ya que se deben predecir las secuencias repetidas de microsatélites y es posible que los cebadores que se aíslan al azar no muestren un polimorfismo significativo.Los loci de microsatélites están ampliamente distribuidos por todo el genoma y pueden aislarse a partir de ADN semidegradado de muestras más antiguas, ya que todo lo que se necesita es un sustrato adecuado para la amplificación mediante PCR.

Las técnicas más recientes implican el uso de secuencias de oligonucleótidos que consisten en repeticiones complementarias a las repeticiones en el microsatélite para "enriquecer" el ADN extraído (enriquecimiento de microsatélite). La sonda de oligonucleótidos se hibrida con la repetición en el microsatélite y el complejo de sonda/microsatélite se extrae de la solución. El ADN enriquecido luego se clona normalmente, pero la proporción de éxitos ahora será mucho mayor, lo que reducirá drásticamente el tiempo requerido para desarrollar las regiones para su uso. Sin embargo, qué sondas usar puede ser un proceso de prueba y error en sí mismo.

ISSR-PCR

ISSR (por repetición de secuencia intersimple) es un término general para una región del genoma entre loci de microsatélites. Las secuencias complementarias de dos microsatélites vecinos se utilizan como cebadores de PCR; la región variable entre ellos se amplifica. La duración limitada de los ciclos de amplificación durante la PCR evita la replicación excesiva de secuencias de ADN contiguas demasiado largas, por lo que el resultado será una mezcla de una variedad de cadenas de ADN amplificadas que generalmente son cortas pero varían mucho en longitud.

Las secuencias amplificadas por ISSR-PCR se pueden utilizar para la toma de huellas dactilares de ADN. Dado que una ISSR puede ser una región conservada o no conservada, esta técnica no es útil para distinguir individuos, sino para análisis de filogeografía o tal vez para delimitar especies; la diversidad de secuencias es menor que en SSR-PCR, pero aún mayor que en las secuencias de genes reales. Además, la secuenciación de microsatélites y la secuenciación ISSR se ayudan mutuamente, ya que una produce cebadores para la otra.

Limitaciones

El ADN repetitivo no se analiza fácilmente con los métodos de secuenciación de ADN de próxima generación, que luchan con las extensiones homopoliméricas. Por lo tanto, los microsatélites normalmente se analizan mediante amplificación por PCR convencional y determinación del tamaño del amplicón. El uso de PCR significa que el análisis de longitud de microsatélites es propenso a limitaciones de PCR como cualquier otro locus de ADN amplificado por PCR. Una preocupación particular es la aparición de 'alelos nulos':

• Ocasionalmente, dentro de una muestra de individuos, como en el caso de pruebas de paternidad, una mutación en el ADN que flanquea el microsatélite puede evitar que el cebador de PCR se una y produzca un amplicón (creando un "alelo nulo" en un ensayo de gel), por lo tanto, solo un alelo se amplifica (a partir del cromosoma hermano no mutado), y el individuo puede parecer falsamente homocigoto. Esto puede causar confusión en el trabajo de casos de paternidad. Entonces puede ser necesario amplificar el microsatélite utilizando un conjunto diferente de cebadores. Los alelos nulos son causados ​​especialmente por mutaciones en la sección 3', donde comienza la extensión.
• En análisis de especies o poblaciones, por ejemplo en trabajos de conservación, los cebadores de PCR que amplifican microsatélites en un individuo o especie pueden funcionar en otras especies. Sin embargo, el riesgo de aplicar cebadores de PCR en diferentes especies es que los alelos nulos se vuelven probables, siempre que la divergencia de secuencia sea demasiado grande para que se unan los cebadores. Entonces puede parecer artificialmente que la especie tiene una diversidad reducida. Los alelos nulos en este caso a veces pueden indicarse por una frecuencia excesiva de homocigotos que causan desviaciones de las expectativas de equilibrio de Hardy-Weinberg.