Microarrays de proteínas
A proteína microarray (o proteína chip) es un método de alto rendimiento utilizado para rastrear las interacciones y actividades de las proteínas, y para determinar su función, y determinar la función a gran escala. Su principal ventaja radica en que un gran número de proteínas pueden ser rastreadas en paralelo. El chip consiste en una superficie de soporte como una diapositiva de vidrio, membrana de nitrocelulosa, cuentas o placa de microtitre, a la que está ligada una matriz de proteínas de captura. Las moléculas de sonda, típicamente etiquetadas con un tinte fluorescente, se agregan al array. Cualquier reacción entre la sonda y la proteína inmovilizada emite una señal fluorescente que es leída por un escáner láser. Las microarrayas proteínas son rápidas, automatizadas, económicas y altamente sensibles, consumiendo pequeñas cantidades de muestras y reactivos. El concepto y la metodología de los microarrayos de proteínas se introdujo primero e ilustrado en los microarrayos anticuerpos (también denominados matriz anticuerpos) en 1983 en una publicación científica y una serie de patentes. La tecnología de alto rendimiento detrás de la microarraya proteica era relativamente fácil de desarrollar, ya que se basa en la tecnología desarrollada para microarrayos de ADN, que se han convertido en los microarrayos más utilizados.
Motivación para el desarrollo
Los microarrays de proteínas se desarrollaron debido a las limitaciones del uso de microarrays de ADN para determinar los niveles de expresión génica en proteómica. La cantidad de ARNm en la célula muchas veces no refleja los niveles de expresión de las proteínas a las que corresponden. Dado que normalmente es la proteína, y no el ARNm, la que desempeña el papel funcional en la respuesta celular, se necesitaba un enfoque novedoso. Además, las modificaciones postraduccionales, que a menudo son críticas para determinar la función de las proteínas, no son visibles en los microarrays de ADN. Los microarrays de proteínas reemplazan las técnicas proteómicas tradicionales, como la electroforesis en gel 2D o la cromatografía, que consumían mucho tiempo y trabajo y no eran adecuadas para el análisis de proteínas poco abundantes.
Haciendo la matriz
Las proteínas se disponen sobre una superficie sólida, como portaobjetos de microscopio, membranas, perlas o placas de microtitulación. La función de esta superficie es proporcionar un soporte sobre el que se puedan inmovilizar las proteínas. Debe demostrar propiedades de unión máximas, manteniendo al mismo tiempo la proteína en su conformación nativa para que se conserve su capacidad de unión. Los portaobjetos de microscopio hechos de vidrio o silicio son una opción popular, ya que son compatibles con los escáneres láser y los generadores robóticos de fácil obtención que se han desarrollado para la tecnología de microarrays de ADN. Los portaobjetos de película de nitrocelulosa son ampliamente aceptados como el sustrato de mayor unión a proteínas para aplicaciones de microarrays de proteínas.
La superficie sólida elegida se cubre luego con un recubrimiento que debe cumplir las funciones simultáneas de inmovilizar la proteína, evitar su desnaturalización, orientarla en la dirección adecuada para que sus sitios de unión sean accesibles y proporcionar un ambiente hidrófilo en el que la Puede ocurrir una reacción de unión. También debe mostrar una unión no específica mínima para minimizar el ruido de fondo en los sistemas de detección. Además, debe ser compatible con diferentes sistemas de detección. Los agentes inmovilizadores incluyen capas de aluminio u oro, polímeros hidrófilos y geles de poliacrilamida, o tratamientos con aminas, aldehídos o epoxi. Se emplean tecnologías de película delgada como la deposición física de vapor (PVD) y la deposición química de vapor (CVD) para aplicar el recubrimiento a la superficie del soporte.
Un entorno acuoso es esencial en todas las etapas de fabricación y operación de la matriz para evitar la desnaturalización de proteínas. Por lo tanto, los tampones de muestra contienen un alto porcentaje de glicerol (para reducir el punto de congelación) y la humedad del entorno de fabricación se regula cuidadosamente. Los micropocillos tienen la doble ventaja de proporcionar un entorno acuoso y al mismo tiempo evitar la contaminación cruzada entre muestras.
En el tipo más común de matriz de proteínas, los robots colocan una gran cantidad de proteínas o sus ligandos sobre un soporte sólido recubierto en un patrón predefinido. Esto se conoce como impresión robótica por contacto o manchado robótico. Otro método de fabricación es la inyección de tinta, un método de gota a demanda y sin contacto para dispersar los polímeros de proteínas sobre la superficie sólida en el patrón deseado. El manchado piezoeléctrico es un método similar a la impresión por chorro de tinta. El cabezal de impresión se mueve a lo largo de la matriz y en cada punto utiliza estimulación eléctrica para enviar las moléculas de proteína a la superficie a través de pequeños chorros. Este también es un proceso sin contacto. La fotolitografía es un cuarto método para disponer las proteínas en la superficie. La luz se utiliza asociada a fotomáscaras, placas opacas con agujeros o transparencias que permiten que la luz brille siguiendo un patrón definido. Luego, una serie de tratamientos químicos permiten la deposición de la proteína en el patrón deseado sobre el material debajo de la fotomáscara.
Las moléculas de captura dispuestas en la superficie sólida pueden ser anticuerpos, antígenos, aptámeros (ligandos basados en ácido nucleico), aficuerpos (pequeñas moléculas diseñadas para imitar anticuerpos monoclonales) o proteínas de longitud completa. Las fuentes de tales proteínas incluyen sistemas de expresión basados en células para proteínas recombinantes, purificación a partir de fuentes naturales, producción in vitro mediante sistemas de traducción libres de células y métodos sintéticos para péptidos. Muchos de estos métodos pueden automatizarse para una producción de alto rendimiento, pero se debe tener cuidado de evitar condiciones de síntesis o extracción que den como resultado una proteína desnaturalizada que, dado que ya no reconoce a su compañero de unión, inutiliza la matriz.
Las proteínas son muy sensibles a los cambios en su microambiente. Esto presenta un desafío para mantener las matrices de proteínas en condiciones estables durante períodos de tiempo prolongados. Los métodos in situ, inventados y publicados por Mingyue He y Michael Taussig en 2001, implican la síntesis de proteínas en un chip cuando sea necesario, directamente a partir del ADN utilizando sistemas de expresión de proteínas libres de células. Dado que el ADN es una molécula muy estable, no se deteriora con el tiempo y, por tanto, es adecuado para el almacenamiento a largo plazo. Este enfoque también es ventajoso porque evita los laboriosos y a menudo costosos procesos de purificación de proteínas por separado y clonación de ADN, ya que las proteínas se fabrican e inmovilizan simultáneamente en un solo paso en la superficie del chip. Ejemplos de técnicas in situ son PISA (matriz de proteínas in situ), NAPPA (matriz de proteínas programables con ácido nucleico) y DAPA (matriz de ADN a matriz de proteínas).
Tipos de matrices
Hay tres tipos de microarrays de proteínas que se utilizan actualmente para estudiar las actividades bioquímicas de las proteínas.
Los microarrays analíticos también se conocen como arreglos de captura. En esta técnica, se dispone una biblioteca de anticuerpos, aptámeros o aficuerpos sobre la superficie del soporte. Se utilizan como moléculas de captura, ya que cada una se une específicamente a una proteína en particular. La matriz se sonda con una solución de proteína compleja, como un lisado celular. El análisis de las reacciones de unión resultantes utilizando diversos sistemas de detección puede proporcionar información sobre los niveles de expresión de proteínas particulares en la muestra, así como mediciones de afinidades y especificidades de unión. Este tipo de microarrays es especialmente útil para comparar la expresión de proteínas en diferentes soluciones. Por ejemplo, la respuesta de las células a un factor particular puede identificarse comparando los lisados de células tratadas con sustancias específicas o cultivadas en determinadas condiciones con los lisados de células de control. Otra aplicación es la identificación y perfilado de tejidos enfermos.
Los microarrays de proteínas de fase inversa (RPPA) implican muestras complejas, como lisados de tejido. Las células se aíslan de diversos tejidos de interés y se lisan. El lisado se dispone en la micromatriz y se sonda con anticuerpos contra la proteína diana de interés. Estos anticuerpos normalmente se detectan con ensayos quimioluminiscentes, fluorescentes o colorimétricos. Los péptidos de referencia están impresos en los portaobjetos para permitir la cuantificación de proteínas de los lisados de muestra. Los RPA permiten determinar la presencia de proteínas alteradas u otros agentes que pueden ser el resultado de una enfermedad. Específicamente, las modificaciones postraduccionales, que generalmente se alteran como resultado de una enfermedad, se pueden detectar utilizando RPA.
Microarrays de proteínas funcionales
Los microarrays de proteínas funcionales (también conocidos como conjuntos de proteínas diana) se construyen inmovilizando grandes cantidades de proteínas purificadas y se utilizan para identificar proteína-proteína, proteína-ADN, proteína-ARN, proteína-fosfolípido y proteína-molécula pequeña. interacciones, analizar la actividad enzimática y detectar anticuerpos y demostrar su especificidad. Se diferencian de las matrices analíticas en que las matrices de proteínas funcionales están compuestas de matrices que contienen proteínas funcionales o dominios proteicos de longitud completa. Estos chips de proteínas se utilizan para estudiar las actividades bioquímicas de todo el proteoma en un solo experimento.
El elemento clave en cualquier ensayo basado en microarrays de proteínas funcionales es que las proteínas dispuestas deben conservar su estructura nativa, de modo que puedan tener lugar interacciones funcionales significativas en la superficie de la matriz. Las ventajas de controlar el modo preciso de unión a la superficie mediante el uso de una etiqueta de afinidad adecuada son que las proteínas inmovilizadas tendrán una orientación homogénea, lo que dará como resultado una mayor actividad específica y una mayor relación señal-ruido en los ensayos, con menos interferencia de agentes no-transmisores. interacciones específicas.
Detección
Los métodos de detección de matrices de proteínas deben proporcionar una señal alta y un fondo bajo. El método de detección más común y ampliamente utilizado es el etiquetado fluorescente, que es altamente sensible, seguro y compatible con escáneres láser de microarrays disponibles. Se pueden utilizar otros marcadores, tales como marcadores de afinidad, fotoquímicos o radioisótopos. Estas etiquetas están adheridas a la propia sonda y pueden interferir con la reacción de la proteína objetivo-sonda. Por lo tanto, se encuentran disponibles varios métodos de detección sin etiquetas, como la resonancia de plasmón superficial (SPR), los nanotubos de carbono, los sensores de nanocables de carbono (donde la detección se produce a través de cambios en la conductancia) y los voladizos de sistemas microelectromecánicos (MEMS). Todos estos métodos de detección sin etiquetas son relativamente nuevos y aún no son adecuados para la detección de interacciones de proteínas de alto rendimiento; sin embargo, ofrecen muchas promesas para el futuro. Inmunoensayos en tiol-eno "papel sintético" Se ha demostrado que los andamios de micropilares generan una señal de fluorescencia superior.
La cuantificación de proteínas en portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa puede utilizar la detección fluorescente por infrarrojos cercanos. Esto limita las interferencias debidas a la autofluorescencia de la nitrocelulosa en las longitudes de onda UV utilizadas para las sondas de detección fluorescentes estándar.
Aplicaciones
Hay cinco áreas principales donde se aplican las matrices de proteínas: diagnóstico, proteómica, análisis funcional de proteínas, caracterización de anticuerpos y desarrollo de tratamientos.
El diagnóstico implica la detección de antígenos y anticuerpos en muestras de sangre; el perfilado de sueros para descubrir nuevos biomarcadores de enfermedades; el seguimiento de estados patológicos y respuestas a la terapia en medicina personalizada; la vigilancia del medio ambiente y la alimentación. El bioensayo digital es un ejemplo del uso de microarrays de proteínas con fines de diagnóstico. En esta tecnología, una serie de micropocillos en un chip de vidrio/polímero se siembran con perlas magnéticas (recubiertas con anticuerpos marcados con fluorescencia), se someten a antígenos específicos y luego se caracterizan mediante un microscopio mediante el conteo de pocillos fluorescentes. Recientemente se ha demostrado una plataforma de fabricación rentable (que utiliza polímeros OSTE) para este tipo de matrices de micropocillos y el sistema modelo de bioensayo se ha caracterizado con éxito.
La proteómica se refiere al perfil de expresión de proteínas, es decir, qué proteínas se expresan en el lisado de una célula en particular.
El análisis funcional de proteínas es la identificación de interacciones proteína-proteína (p. ej., identificación de miembros de un complejo proteico), interacciones proteína-fosfolípido, dianas de moléculas pequeñas, sustratos enzimáticos (particularmente los sustratos de quinasas) y ligandos de receptores.
La caracterización de anticuerpos consiste en caracterizar la reactividad cruzada, la especificidad y el mapeo de epítopos.
El desarrollo de tratamientos implica el desarrollo de terapias de antígenos específicos para la autoinmunidad, el cáncer y las alergias; la identificación de dianas de moléculas pequeñas que potencialmente podrían usarse como nuevos fármacos.
Desafíos
A pesar de las considerables inversiones realizadas por varias empresas, los chips de proteínas aún no han inundado el mercado. Los fabricantes han descubierto que las proteínas son bastante difíciles de manipular. La producción de proteínas confiables, consistentes y de alto rendimiento que estén correctamente plegadas y funcionales está plagada de dificultades, ya que a menudo dan como resultado un bajo rendimiento de proteínas debido a la disminución de la solubilidad y la formación de cuerpos de inclusión. Un chip de proteína requiere muchos más pasos en su creación que un chip de ADN.
Hay varios enfoques para este problema que difieren fundamentalmente según si las proteínas se inmovilizan mediante interacciones no específicas y mal definidas, o mediante un conjunto específico de interacciones conocidas. El primer enfoque es atractivo por su simplicidad y es compatible con proteínas purificadas derivadas de fuentes nativas o recombinantes, pero adolece de varios riesgos. Los más notables se relacionan con la naturaleza incontrolada de las interacciones entre cada proteína y la superficie; en el mejor de los casos, esto podría dar lugar a una población heterogénea de proteínas en la que los sitios activos a veces están ocluidos por la superficie; en el peor de los casos, podría destruir la actividad por completo debido al despliegue parcial o completo mediado por la superficie de la proteína inmovilizada.
Los desafíos incluyen: 1) encontrar una superficie y un método de unión que permita a las proteínas mantener su estructura secundaria o terciaria y, por lo tanto, su actividad biológica y sus interacciones con otras moléculas, 2) producir una matriz con una larga vida útil para que que las proteínas del chip no se desnaturalicen en poco tiempo, 3) identificar y aislar anticuerpos u otras moléculas de captura contra cada proteína del genoma humano, 4) cuantificar los niveles de proteína unida asegurando la sensibilidad y evitando el ruido de fondo, 5) extraer la proteína detectada del chip para analizarla más a fondo, 6) reducir la unión no específica por parte de los agentes de captura, 7) la capacidad del chip debe ser suficiente para permitir una representación lo más completa posible del proteoma a visualizar ; Las proteínas abundantes abruman la detección de proteínas menos abundantes, como las moléculas de señalización y los receptores, que generalmente son de mayor interés terapéutico.