Mezcla de ADN

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Las mutaciones de puntos provocan cambios de nucleótido único, mientras que las inserciones y las eliminaciones resultan en la adición o eliminación de nucleótidos, respectivamente. El brillo de ADN permite la recombinación de genes padres que aumenta drásticamente la tasa de evolución dirigida. El brillo de ADN es útil para generar proteínas con propiedades novedosas o combinaciones de propiedades deseadas.

La recombinación de ADN, también conocida como mejoramiento molecular, es un método de recombinación aleatoria in vitro para generar genes mutantes para la evolución dirigida y permitir un aumento rápido del tamaño de la biblioteca de ADN. Tres procedimientos para lograr la recombinación de ADN son el mejoramiento molecular que se basa en la recombinación homóloga o la similitud de las secuencias de ADN, las enzimas de restricción que se basan en sitios de restricción comunes y la recombinación aleatoria no homóloga que requiere el uso de horquillas. En todas estas técnicas, los genes parentales se fragmentan y luego se recombinan.

La recombinación de ADN utiliza la recombinación aleatoria en lugar de la mutagénesis dirigida a un sitio para generar proteínas con atributos únicos o combinaciones de características deseables codificadas en los genes parentales, como termoestabilidad y alta actividad. El potencial de la recombinación de ADN para producir nuevas proteínas se ejemplifica en la figura que se muestra a la derecha, que demuestra la diferencia entre mutaciones puntuales, inserciones y deleciones, y la recombinación de ADN. Específicamente, esta figura muestra el uso de la recombinación de ADN en dos genes parentales, lo que permite la generación de proteínas recombinantes que tienen una combinación aleatoria de secuencias de cada gen parental. Esto es distinto de las mutaciones puntuales en las que se ha cambiado, insertado o eliminado un nucleótido y las inserciones o deleciones en las que se ha añadido o eliminado una secuencia de nucleótidos, respectivamente. Como resultado de la recombinación aleatoria, la recombinación de ADN puede producir proteínas con nuevas cualidades o múltiples características ventajosas derivadas de los genes parentales.

En 1994, Willem P.C. Stemmer publicó el primer artículo sobre la reorganización del ADN. Desde la introducción de la técnica, la reorganización del ADN se ha aplicado a proteínas y fármacos de moléculas pequeñas, biorremediación, vacunas, terapia génica y virus evolucionados. Otras técnicas que producen resultados similares a la reorganización del ADN incluyen la quimeragénesis aleatoria en plantillas transitorias (RACHITT), la recombinación in vitro con impresión aleatoria (RPR) y el proceso de extensión escalonada (StEP).

Historia

La redistribución del ADN mediante cruzamiento molecular fue descrita por primera vez en 1994 por Willem P.C. Stemmer. Comenzó fragmentando el gen de la β-lactamasa que había sido amplificado con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la DNasa I, que corta el ADN de forma aleatoria. Luego completó una reacción de PCR modificada en la que no se emplearon cebadores, lo que dio como resultado la hibridación de fragmentos homólogos o fragmentos con secuencias similares. Finalmente, estos fragmentos fueron amplificados por PCR. Stemmer informó que el uso de la redistribución del ADN en combinación con el retrocruzamiento dio como resultado la eliminación de mutaciones no esenciales y un aumento en la producción del antibiótico cefotaxima. También enfatizó el potencial de evolución molecular con la redistribución del ADN. Específicamente, indicó que la técnica podría usarse para modificar proteínas.

Desde entonces, la redistribución de ADN se ha aplicado para generar bibliotecas de genes híbridos o quiméricos y ha inspirado la redistribución familiar, que se define como el uso de genes relacionados en la redistribución de ADN. Además, la redistribución de ADN se ha aplicado a proteínas y fármacos de moléculas pequeñas, biorremediación, terapia génica, vacunas y virus evolucionados.

Procedimientos

Reproducción molecular

En primer lugar, se utiliza la ADNasa I para fragmentar un conjunto de genes progenitores en segmentos de ADN de doble cadena que van desde 10-50 pb hasta más de 1 kpb. A esto le sigue una PCR sin cebadores. En la PCR, los fragmentos de ADN con secuencias suficientemente superpuestas se aparearán entre sí y luego serán extendidos por la ADN polimerasa. La extensión de la PCR no se producirá a menos que haya secuencias de ADN de alta similitud. Los factores importantes que influyen en las secuencias sintetizadas en la mezcla de ADN son la ADN polimerasa, las concentraciones de sal y la temperatura de apareamiento. Por ejemplo, el uso de la Taq polimerasa para la amplificación de un fragmento de 1 kpb en una PCR de 20 ciclos da como resultado que entre el 33% y el 98% de los productos contengan una o más mutaciones.

Se pueden utilizar varios ciclos de extensión de PCR para amplificar los fragmentos. Para amplificar aún más las secuencias con otra PCR, se añaden cebadores diseñados para ser complementarios a los extremos de los fragmentos extendidos. Se pueden elegir cebadores para que tengan secuencias adicionales añadidas en sus extremos 5', como secuencias para sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que son necesarias para la ligación en un vector de clonación.

Es posible recombinar porciones de los genes progenitores para generar híbridos o formas quiméricas con propiedades únicas, de ahí el término "reordenamiento de ADN". La desventaja del mejoramiento molecular es el requisito de similitud entre las secuencias, lo que ha inspirado el desarrollo de otros procedimientos de reordenamiento de ADN.

Enzimas de restricción

Se emplean enzimas de restricción para fragmentar los genes progenitores. Luego, los fragmentos se unen mediante ligación, que se puede lograr con la ADN ligasa. Por ejemplo, si dos genes progenitores tienen tres sitios de restricción, se pueden crear catorce híbridos génicos de longitud completa diferentes. La cantidad de híbridos de longitud completa únicos está determinada por el hecho de que un gen con tres sitios de restricción se puede dividir en cuatro fragmentos. Por lo tanto, hay dos opciones para cada una de las cuatro posiciones menos las combinaciones que recrearían los dos genes progenitores, lo que daría como resultado 24 - 2 = 14 genes híbridos de longitud completa diferentes.

La principal diferencia entre la recombinación de ADN con enzimas de restricción y la reproducción molecular es que la reproducción molecular se basa en la homología de las secuencias para la hibridación de las cadenas y la PCR para la extensión, mientras que al utilizar enzimas de restricción, se crean extremos de fragmentos que se pueden ligar. Las principales ventajas de utilizar enzimas de restricción incluyen el control sobre el número de eventos de recombinación y la falta de requisito de amplificación por PCR. La principal desventaja es el requisito de sitios de enzimas de restricción comunes.

Recobinación aleatoria no homologada

Para generar segmentos que van desde 10-50 pb hasta más de 1 kb, se utiliza la ADNasa I. Los extremos de los fragmentos se vuelven romos añadiendo la ADN polimerasa T4. Hacer romos los fragmentos es importante para combinar los fragmentos, ya que los extremos pegajosos incompatibles, o salientes, impiden la unión de los extremos. A continuación, se añaden horquillas con un sitio de restricción específico a la mezcla de fragmentos. A continuación, se emplea la ADN ligasa T4 para ligar los fragmentos y formar secuencias extendidas. La ligadura de las horquillas a los fragmentos limita la longitud de las secuencias extendidas al impedir la adición de más fragmentos. Por último, para eliminar los bucles de las horquillas, se utiliza una enzima de restricción.

La recombinación aleatoria no homóloga difiere del cruzamiento molecular en que no es necesaria la homología de las secuencias ligadas, lo que constituye una ventaja. Sin embargo, debido a que este proceso recombina los fragmentos aleatoriamente, es probable que una gran fracción de las secuencias de ADN recombinadas no tengan las características deseadas, lo que constituye una desventaja. La recombinación aleatoria no homóloga también difiere del uso de enzimas de restricción para la reorganización del ADN, ya que no se requieren sitios de enzimas de restricción comunes en los genes parentales y es necesario el uso de horquillas, lo que demuestra una ventaja y una desventaja de la recombinación aleatoria no homóloga sobre el uso de enzimas de restricción, respectivamente.

Aplicaciones

Medicamentos de proteína y molécula pequeña

Dado que la recombinación de ADN permite la recombinación de genes, se pueden mejorar las actividades de las proteínas. Por ejemplo, la recombinación de ADN se ha utilizado para aumentar la potencia de los interferones recombinantes expresados en fagos en células humanas y murinas. Además, la mejora de la proteína fluorescente verde (GFP) se logró con la recombinación de ADN mediante cría molecular, ya que se obtuvo una señal 45 veces mayor que el estándar para la fluorescencia de células completas. Además, la síntesis de diversos genes también puede dar como resultado la producción de proteínas con atributos novedosos. Por lo tanto, la recombinación de ADN se ha utilizado para desarrollar proteínas para desintoxicar sustancias químicas. Por ejemplo, el método de recombinación homóloga de recombinación de ADN mediante cría molecular se ha utilizado para mejorar la desintoxicación de atrazina y arseniato.

Bioremediación

La redistribución del ADN también se ha utilizado para mejorar la degradación de contaminantes biológicos. En concreto, se ha creado una cepa de E. coli recombinante mediante la redistribución del ADN mediante cría molecular para la biorremediación del tricloroetileno (TCE), un carcinógeno potencial, que es menos susceptible a los intermediarios tóxicos de epóxido.

Vacunas

La capacidad de seleccionar recombinantes deseables mediante la redistribución de ADN se ha utilizado en combinación con estrategias de selección para mejorar las vacunas candidatas contra infecciones, con énfasis en mejorar la inmunogenicidad, la producción de vacunas, la estabilidad y la reactividad cruzada con múltiples cepas de patógenos. Se han investigado algunas vacunas candidatas para Plasmodium falciparum, virus del dengue, alfavirus encefalíticos (incluidos: VEEV, WEEV y EEEV), virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) y virus de la hepatitis B (VHB).

Terapia genética y virus evolucionados

Los requisitos para las terapias génicas humanas incluyen alta pureza, alto título y estabilidad. La redistribución de ADN permite la fabricación de vectores retrovirales con estos atributos. Por ejemplo, la redistribución de ADN con cruzamiento molecular se aplicó a seis cepas ecotrópicas del virus de la leucemia murina (MLV), lo que dio como resultado la compilación de una extensa biblioteca de retrovirus recombinantes y la identificación de múltiples clones con mayor estabilidad. Además, la aplicación de la redistribución de ADN mediante cruzamiento molecular en múltiples vectores de virus adenoasociados (AAV) parentales se empleó para generar una biblioteca de diez millones de quimeras. Los atributos ventajosos obtenidos incluyen una mayor resistencia a la inmunoglobulina intravenosa humana (IVIG) y la producción de tropismo celular en los nuevos virus.

Comparación con otras técnicas

Si bien la reorganización del ADN se ha convertido en una técnica útil para la recombinación aleatoria, también se han desarrollado otros métodos, como RACHITT, RPR y StEP, para este propósito. A continuación, se presentan algunas ventajas y desventajas de estos otros métodos de recombinación.

RACHITT

En RACHITT, los fragmentos de genes parentales monocatenarios (ss) se hibridan con una plantilla ss, lo que da como resultado una menor discordancia, lo que constituye una ventaja. Además, RACHIIT permite recombinar genes con baja similitud de secuencia. Sin embargo, una desventaja importante es la preparación de los fragmentos ss de los genes parentales y la plantilla ss.

RPR

La RPR utiliza iniciadores aleatorios. Estos iniciadores aleatorios se unen al ADN molde y luego se extienden con el fragmento Klenow. A continuación, se eliminan los moldes y los fragmentos se ensamblan por homología en un proceso similar a la PCR. Algunos de los principales beneficios incluyen la menor necesidad de genes parentales debido al uso de moldes ss y una mayor diversidad de secuencias por errores de iniciación y de incorporación. Una desventaja de la RPR es la preparación del molde.

StEP

En StEP, se emplean ciclos breves de hibridación de cebadores con una plantilla y extensión por polimerasa para generar secuencias de longitud completa. Las principales ventajas de StEP son la simplicidad del método y la falta de purificación de fragmentos. Las desventajas de StEP incluyen que requiere mucho tiempo y homología de secuencias.

Véase también

  • SCOPE (proteína de ingeniería)

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