Mancha occidental
El western blot (a veces llamado inmunotransferencia de proteínas), o western blot, es una técnica analítica ampliamente utilizada en biología molecular e inmunogenética. para detectar proteínas específicas en una muestra de tejido homogeneizado o extracto. Además de detectar las proteínas, esta técnica también se utiliza para visualizar, distinguir y cuantificar las diferentes proteínas en una combinación complicada de proteínas.
La técnica de Western blot utiliza tres elementos para lograr su tarea de separar una proteína específica de un complejo: separación por tamaño, transferencia de la proteína a un soporte sólido y marcación de la proteína objetivo utilizando un anticuerpo primario y secundario para visualizar. Se crea un anticuerpo sintético o de origen animal (conocido como anticuerpo primario) que reconoce y se une a una proteína diana específica. La membrana de electroforesis se lava en una solución que contiene el anticuerpo primario, antes de eliminar el exceso de anticuerpo. Se añade un anticuerpo secundario que reconoce y se une al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se visualiza a través de varios métodos, como tinción, inmunofluorescencia y radiactividad, lo que permite la detección indirecta de la proteína diana específica.
Otras técnicas relacionadas incluyen análisis dot blot, dot blot cuantitativo, inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, donde se utilizan anticuerpos para detectar proteínas en tejidos y células mediante inmunotinción y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
El nombre western blot es un juego de Southern blot, una técnica para la detección de ADN que lleva el nombre de su inventor, el biólogo inglés Edwin Southern. De manera similar, la detección de ARN se denomina transferencia Northern. El término "Western blot" fue dado por W. Neal Burnette en 1981, aunque el método en sí fue inventado de forma independiente en 1979 por Jaime Renart, Jakob Reiser y George Stark en Stanford, y por Harry Towbin, Theophil Staehelin y Julian Gordon en el Instituto Friedrich Miescher en Basilea, Suiza. Entre 1979 y 2019 "se ha mencionado en los títulos, resúmenes y palabras clave de más de 400 000 publicaciones incluidas en PubMed" y todavía puede ser la técnica de análisis de proteínas más utilizada.
Aplicaciones
El western blot se usa ampliamente en bioquímica para la detección cualitativa de proteínas individuales y modificaciones de proteínas (como modificaciones postraduccionales). Se estima que al menos entre el 8% y el 9% de todas las publicaciones relacionadas con proteínas aplican transferencias de Western. Se utiliza como método general para identificar la presencia de una sola proteína específica dentro de una mezcla compleja de proteínas. Se puede derivar una estimación semicuantitativa de una proteína a partir del tamaño y la intensidad del color de una banda de proteína en la membrana de transferencia. Además, se puede usar la aplicación de una serie de diluciones de una proteína purificada de concentraciones conocidas para permitir una estimación más precisa de la concentración de proteína. El western blot se usa habitualmente para verificar la producción de proteínas después de la clonación. También se utiliza en diagnósticos médicos, por ejemplo, en la prueba de VIH o la prueba de EEB.
La prueba de confirmación del VIH emplea un western blot para detectar anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Las proteínas de células infectadas por VIH conocidas se separan y se transfieren a una membrana como antes. Luego, el suero a analizar se aplica en el paso de incubación del anticuerpo primario; el anticuerpo libre se elimina por lavado y se agrega un anticuerpo antihumano secundario vinculado a una señal enzimática. Las bandas teñidas indican las proteínas contra las que el suero del paciente contiene anticuerpos. Un western blot también se usa como prueba definitiva para la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, un tipo de enfermedad priónica relacionada con el consumo de carne contaminada de ganado con encefalopatía espongiforme bovina (BSE, comúnmente conocida como 'enfermedad de las vacas locas' 39;). Otra aplicación es en el diagnóstico de la tularemia. Una evaluación de la capacidad del western blot para detectar anticuerpos contra F. tularensis reveló que su sensibilidad es casi del 100% y la especificidad es del 99,6%. Algunas formas de pruebas de la enfermedad de Lyme emplean transferencia Western. Un western blot también se puede utilizar como prueba de confirmación para la infección por hepatitis B y la infección por HSV-2 (herpes tipo 2). En medicina veterinaria, a veces se usa un Western blot para confirmar el estado FIV+ en gatos.
Otras aplicaciones de la técnica de western blot incluyen su uso por parte de la Agencia Mundial Antidopaje (AMA). El dopaje sanguíneo es el uso indebido de ciertas técnicas y/o sustancias para aumentar la masa de glóbulos rojos, lo que permite que el cuerpo transporte más oxígeno a los músculos y, por lo tanto, aumente la resistencia y el rendimiento. Existen tres sustancias o métodos ampliamente conocidos que se utilizan para el dopaje sanguíneo, a saber, la eritropoyetina (EPO), los transportadores de oxígeno sintéticos y las transfusiones de sangre. Cada uno está prohibido por la Lista de Sustancias y Métodos Prohibidos de la AMA. La técnica de western blot se utilizó durante la Copa Mundial de la FIFA 2014 en la campaña antidopaje de ese evento. En total, Reichel, et al. recolectaron y analizaron más de 1000 muestras. en el Laboratorio acreditado por la AMA de Lausana, Suiza. Investigaciones recientes que utilizan la técnica de transferencia Western mostraron una detección mejorada de EPO en sangre y orina basada en los novedosos geles horizontales prefabricados Velum SAR optimizados para análisis de rutina. Con la adopción del SAR-PAGE horizontal en combinación con los geles Velum SAR prefabricados con soporte de película, se mejoró significativamente la capacidad discriminatoria de la aplicación de microdosis de rEPO.
Además de la aplicación de western blot en la investigación científica, también se utiliza en áreas de investigación clínica. Dado que se puede aplicar al proceso de identificación directa de proteínas, el western blot se considera una poderosa herramienta de diagnóstico que se usa con frecuencia en el entorno clínico. Las técnicas de detección de proteínas y WB se pueden utilizar para encontrar biomarcadores de enfermedades como proteínas o anticuerpos específicos. Se cree que es un método viable para identificar proteínas particulares durante el diagnóstico de enfermedades como el cáncer, las enfermedades autoinmunes y los trastornos priónicos. La detección de varios biomarcadores utilizados en el diagnóstico de enfermedades neurológicas y oncológicas por Western Blot es un procedimiento común. Por ejemplo, se cree ampliamente que el advenimiento de la resistencia a múltiples fármacos (MDR) ha hecho que la terapia eficaz contra el cáncer sea extremadamente desafiante. Por lo tanto, el descubrimiento temprano, preciso y sensible del mecanismo MDR es esencial, al igual que la búsqueda de enfoques quimioterapéuticos más efectivos para su aplicación en entornos clínicos. La expresión de la glicoproteína MDR-1/P en las líneas celulares P388/ADR, P388 y HCT-15 se examina mediante la técnica WB. WB también ha identificado los niveles de MRP1.
Por otro lado, dado que el western blot tiene el potencial de distinguir diferentes isoformas de proteínas, puede usarse para diagnosticar enfermedades relacionadas con priones e isoformas de proteínas, como el cáncer. Por ejemplo, el análisis de transferencia Western del patrón de isoformas de las proteínas 14-3-3 en el líquido cerebral puede identificar la enfermedad de Creutzfeld-Jacob. Además, la enfermedad pulmonar de Farmer es una afección pulmonar provocada por la respiración de partículas antigénicas, y los estudios han indicado que el western blot puede ser una opción útil para identificar proteínas inmunorreactivas relacionadas con la enfermedad pulmonar de Farmer. Además, el western blot también se utiliza para identificar proteínas en líquido sinovial y suero, lo que permite el diagnóstico de síntomas clínicos de osteoartritis y artritis reumatoide. Western blot se utiliza para evaluar los niveles de expresión de la proteína FSTL1 en personas con osteoartritis de rodilla, que sirve como un biomarcador potencial de daño articular. Además, se utiliza para identificar proteínas en líquido sinovial y suero, lo que permite el diagnóstico de síntomas clínicos de osteoartritis y artritis reumatoide. Se utiliza para evaluar los niveles de expresión de la proteína FSTL1 en personas con artrosis de rodilla, que sirve como biomarcador potencial de daño articular.
Identificación de la localización de proteínas en las células
Para el desarrollo de medicamentos, la identificación de objetivos terapéuticos y la investigación biológica, es esencial comprender dónde se encuentran las proteínas dentro de una célula. Las ubicaciones subcelulares de las proteínas dentro de la célula y sus funciones están estrechamente relacionadas. La relación entre la función y la localización de las proteínas sugiere que cuando las proteínas se mueven, sus funciones pueden cambiar o adquirir nuevas características. La ubicación subcelular de una proteína se puede determinar mediante una variedad de métodos. Se han creado y utilizado numerosas herramientas y estrategias computacionales eficientes y confiables para identificar la localización subcelular de proteínas. Con la ayuda de métodos de fraccionamiento subcelular, WB continúa siendo un método fundamental importante para la investigación y comprensión de la localización de proteínas.
Mapeo de epítopos
Debido a sus diversos epítopos, los anticuerpos han ganado interés tanto en la investigación básica como en la clínica. La base de la caracterización y validación de anticuerpos es el mapeo de epítopos. El procedimiento de identificación de los sitios de unión de un anticuerpo (epítopos) en la proteína diana se denomina 'mapeo de epítopos'. Encontrar el epítopo de unión de un anticuerpo es esencial para el descubrimiento y la creación de nuevas vacunas, diagnósticos y terapias. Como resultado, se han creado varios métodos para mapear epítopos de anticuerpos. En este punto, la especificidad del Western blotting es la característica principal que lo distingue de otras técnicas de mapeo de epítopos. Hay varias aplicaciones de western blot para el mapeo de epítopos en muestras de piel humana, virus de enfermedades hemorrágicas.
Procedimiento
El método western blot se compone de una electroforesis en gel para separar proteínas nativas por estructura tridimensional o proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido, seguida de una transferencia electroforética a una membrana (principalmente PVDF o nitrocelulosa) y un procedimiento de inmunotinción. para visualizar una cierta proteína en la membrana de transferencia. SDS-PAGE se utiliza generalmente para la separación electroforética desnaturalizante de proteínas. El SDS generalmente se usa como tampón (así como en el gel) para dar a todas las proteínas presentes una carga negativa uniforme, ya que las proteínas pueden tener carga positiva, negativa o neutra. Este tipo de electroforesis se conoce como SDS-PAGE (SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida). Antes de la electroforesis, las muestras de proteínas a menudo se hierven para desnaturalizar las proteínas presentes. Esto garantiza que las proteínas se separen en función del tamaño y evita que las proteasas (enzimas que descomponen las proteínas) degraden las muestras. Después de la separación electroforética, las proteínas se transfieren a una membrana (típicamente nitrocelulosa o PVDF). Luego, la membrana a menudo se tiñe con Ponceau S para visualizar las proteínas en la transferencia y garantizar que se haya producido una transferencia adecuada. A continuación, las proteínas se bloquean con leche (u otros agentes bloqueadores) para evitar la unión de anticuerpos no específicos y luego se tiñen con anticuerpos específicos para la proteína objetivo. Por último, la membrana se tiñe con un anticuerpo secundario que reconoce la tinción del primer anticuerpo, que luego se puede usar para la detección mediante una variedad de métodos. El paso de electroforesis en gel se incluye en el análisis de transferencia Western para resolver el problema de la reactividad cruzada de los anticuerpos.
Preparación de muestras
Como paso importante en la realización de un western blot, la preparación de la muestra debe realizarse de manera eficaz, ya que la interpretación de este ensayo está influenciada por la preparación de proteínas, que se compone de procesos de extracción y purificación de proteínas. Para lograr una extracción de proteínas eficiente, se debe elegir un método de homogeneización adecuado debido a que es responsable de romper la membrana celular y liberar los componentes intracelulares. Además de eso, se necesita el tampón de lisis ideal para adquirir cantidades sustanciales de contenido de proteína objetivo porque el tampón lidera el proceso de solubilización de proteínas y previene la degradación de proteínas. Después de completar la preparación de la muestra, el contenido de proteína está listo para ser separado mediante la utilización de electroforesis en gel.
Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel. La separación de proteínas puede ser por punto isoeléctrico (pI), peso molecular, carga eléctrica o una combinación de estos factores. La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
Con mucho, el tipo más común de electroforesis en gel emplea geles de poliacrilamida y tampones cargados con dodecilsulfato de sodio (SDS). SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida SDS) mantiene los polipéptidos en un estado desnaturalizado una vez que han sido tratados con agentes reductores fuertes para eliminar la estructura secundaria y terciaria (por ejemplo, enlaces disulfuro [S-S] a grupos sulfhidrilo [SH y SH]) y, por lo tanto, Separación de proteínas por su masa molecular. Las proteínas muestreadas se cubren con el SDS cargado negativamente, convirtiéndose efectivamente en aniónico, y migran hacia el ánodo cargado positivamente (voltaje más alto) (generalmente con un cable rojo) a través de la malla de acrilamida del gel. Las proteínas más pequeñas migran más rápido a través de esta malla y, por lo tanto, las proteínas se separan según el tamaño (generalmente medido en kilodaltons, kDa). La concentración de acrilamida determina la resolución del gel: cuanto mayor sea la concentración de acrilamida, mejor será la resolución de las proteínas de menor peso molecular. Cuanto menor sea la concentración de acrilamida, mejor será la resolución de las proteínas de mayor peso molecular. Las proteínas viajan solo en una dimensión a lo largo del gel para la mayoría de las transferencias.
Las muestras se cargan en pocillos en el gel. Por lo general, se reserva un carril para un marcador o escalera, que es una mezcla disponible comercialmente de proteínas de pesos moleculares conocidos, típicamente teñidas para formar bandas coloreadas visibles. Cuando se aplica voltaje a lo largo del gel, las proteínas migran a través de él a diferentes velocidades dependiendo de su tamaño. Estas diferentes tasas de avance (diferentes movilidades electroforéticas) se separan en bandas dentro de cada carril. Luego, las bandas de proteínas se pueden comparar con las bandas de escalera, lo que permite estimar el peso molecular de la proteína.
También es posible utilizar un gel bidimensional que esparce las proteínas de una sola muestra en dos dimensiones. Las proteínas se separan según el punto isoeléctrico (pH en el que tienen una carga neta neutra) en la primera dimensión y según su peso molecular en la segunda dimensión.
Transferir
Para que las proteínas sean accesibles para la detección de anticuerpos, se mueven desde el interior del gel a una membrana, un soporte sólido, que es una parte esencial del proceso. Hay dos tipos de membrana: nitrocelulosa (NC) o difluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana NC tiene una alta afinidad por las proteínas y sus capacidades de retención. Sin embargo, NC es frágil y no permite que la transferencia se use para volver a probar, mientras que la membrana de PVDF permite que la transferencia se vuelva a probar. El método más utilizado para transferir las proteínas se denomina electrotransferencia. La electrotransferencia utiliza una corriente eléctrica para extraer las proteínas con carga negativa del gel hacia el ánodo con carga positiva y hacia la membrana de PVDF o NC. Las proteínas se mueven desde el interior del gel hacia la membrana mientras mantienen la organización que tenían dentro del gel. Un método más antiguo de transferencia consiste en colocar una membrana encima del gel y una pila de papeles de filtro encima. Toda la pila se coloca en una solución tampón que sube por el papel por acción capilar, trayendo consigo las proteínas. En la práctica, este método no se usa comúnmente debido al largo tiempo del procedimiento.
Como resultado de cualquiera de los procesos de transferencia, las proteínas quedan expuestas en una fina capa de membrana para su detección. Ambas variedades de membrana se eligen por sus propiedades de unión a proteínas no específicas (es decir, se une a todas las proteínas por igual). La unión a proteínas se basa en interacciones hidrofóbicas, así como en interacciones cargadas entre la membrana y la proteína. Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, pero son mucho más frágiles y no pueden resistir los sondeos repetidos.
Tinción de proteínas totales
La tinción de proteínas totales permite visualizar la proteína total que se ha transferido con éxito a la membrana, lo que permite al usuario comprobar la uniformidad de la transferencia de proteínas y realizar la normalización posterior de la proteína objetivo con la cantidad de proteína real por carril. Normalización con el llamado "control de carga" se basó en la inmunotinción de proteínas domésticas en el procedimiento clásico, pero recientemente se dirige hacia la tinción de proteínas totales, debido a los múltiples beneficios. Se han descrito al menos siete enfoques diferentes para la tinción de proteínas totales para la normalización de transferencia Western: Ponceau S, técnicas sin manchas, Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R-350, Amido Black y Cy5. Para evitar el ruido de la señal, la tinción de proteína total debe realizarse antes del bloqueo de la membrana. Sin embargo, también se han descrito tinciones posteriores al anticuerpo.
Bloqueo
Dado que la membrana se ha elegido por su capacidad para unir proteínas y que tanto los anticuerpos como la diana son proteínas, se deben tomar medidas para evitar las interacciones entre la membrana y el anticuerpo utilizado para la detección de la proteína diana. El bloqueo de la unión no específica se logra colocando la membrana en una solución diluida de proteína, generalmente albúmina de suero bovino (BSA) al 3-5% o leche en polvo sin grasa (ambas son económicas) en solución salina tamponada con tris (TBS) o I-Block, con un porcentaje minucioso (0,1%) de detergente como Tween 20 o Triton X-100. Aunque se prefiere la leche descremada en polvo debido a su disponibilidad, se necesita una solución de bloqueo adecuada, ya que no todas las proteínas de la leche son compatibles con todas las bandas de detección. La proteína en la solución diluida se adhiere a la membrana en todos los lugares donde las proteínas diana no se han adherido. Por lo tanto, cuando se agrega el anticuerpo, no puede unirse a la membrana y, por lo tanto, el único sitio de unión disponible es la proteína diana específica. Esto reduce el fondo en el producto final del western blot, lo que genera resultados más claros y elimina los falsos positivos.
Incubación
Durante el proceso de detección, la membrana se "sondea" para la proteína de interés con un anticuerpo modificado que está unido a una enzima indicadora; cuando se expone a un sustrato apropiado, esta enzima impulsa una reacción colorimétrica y produce un color. Por una variedad de razones, esto tradicionalmente se lleva a cabo en un proceso de dos pasos, aunque ahora hay métodos de detección de un solo paso disponibles para ciertas aplicaciones.
Anticuerpo primario
Los anticuerpos primarios se generan cuando una especie huésped o un cultivo de células inmunitarias se exponen a la proteína de interés (o una parte de la misma). Normalmente, esto es parte de la respuesta inmune, mientras que aquí se recolectan y se utilizan como herramientas de detección sensibles y específicas que se unen directamente a la proteína.
Después del bloqueo, una solución de anticuerpo primario (generalmente entre 0,5 y 5 microgramos/ml) diluida en tampón de lavado PBS o TBST se incuba con la membrana con agitación suave durante una hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC. b>°C. También se puede incubar a diferentes temperaturas, y las temperaturas más bajas se asocian con una mayor unión, tanto específica (a la proteína objetivo, la 'señal') como no específica ('ruido'). Después de la incubación, la membrana se lava varias veces en tampón de lavado para eliminar el anticuerpo primario no unido y, por lo tanto, minimizar el fondo. Normalmente, la solución tampón de lavado se compone de solución salina tamponada con un pequeño porcentaje de detergente y, a veces, con leche en polvo o BSA.
Anticuerpo secundario
Después de enjuagar la membrana para eliminar el anticuerpo primario no unido, la membrana se expone a otro anticuerpo conocido como anticuerpo secundario. Los anticuerpos provienen de fuentes animales (o cultivos de hibridomas de origen animal). El anticuerpo secundario reconoce y se une a la porción específica de especie del anticuerpo primario. Por lo tanto, un anticuerpo secundario anti-ratón se unirá a casi cualquier anticuerpo primario procedente de ratón y puede denominarse "anti-especie". anticuerpo (por ejemplo, anti-ratón, anti-cabra, etc.). Para permitir la detección de la proteína objetivo, el anticuerpo secundario se une comúnmente a la biotina oa una enzima indicadora, como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante. Esto significa que varios anticuerpos secundarios se unirán a un anticuerpo primario y mejorarán la señal, lo que permitirá la detección de proteínas en una concentración mucho más baja que la que sería visible solo con SDS-PAGE.
La peroxidasa de rábano picante suele vincularse a anticuerpos secundarios para permitir la detección de la proteína diana mediante quimioluminiscencia. La peroxidasa de rábano picante escinde el sustrato quimioluminiscente, lo que da como resultado la producción de luminiscencia. Por lo tanto, la producción de luminiscencia es proporcional a la cantidad de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y, por lo tanto, mide indirectamente la presencia de la proteína diana. Se coloca una hoja sensible de película fotográfica contra la membrana y la exposición a la luz de la reacción crea una imagen de los anticuerpos unidos a la mancha. Un enfoque más económico pero menos sensible utiliza una tinción de 4-cloronaftol con peróxido de hidrógeno al 1%; la reacción de los radicales peróxido con 4-cloronaftol produce una mancha de color púrpura oscuro que se puede fotografiar sin utilizar una película fotográfica especializada.
Al igual que con los procedimientos ELISPOT y ELISA, se puede proporcionar a la enzima una molécula de sustrato que la enzima convertirá en un producto de reacción coloreado que será visible en la membrana (ver la figura a continuación con bandas azules).
Otro método de detección de anticuerpos secundarios utiliza un anticuerpo unido a un fluoróforo en el infrarrojo cercano. La luz producida por la excitación de un tinte fluorescente es estática, lo que hace que la detección fluorescente sea una medida más precisa y precisa de la diferencia en la señal producida por anticuerpos marcados unidos a proteínas en un western blot. Las proteínas se pueden cuantificar con precisión porque la señal generada por las diferentes cantidades de proteínas en las membranas se mide en un estado estático, en comparación con la quimioluminiscencia, en la que la luz se mide en un estado dinámico.
Una tercera alternativa es utilizar un marcador radiactivo en lugar de una enzima acoplada al anticuerpo secundario, como marcar una proteína de unión a anticuerpos como la proteína A de estafilococo o la estreptavidina con un isótopo radiactivo de yodo. Dado que otros métodos son más seguros, más rápidos y más baratos, este método ahora rara vez se usa; sin embargo, una ventaja de este enfoque es la sensibilidad de las imágenes basadas en autorradiografías, que permiten una cuantificación de proteínas de alta precisión cuando se combinan con software óptico (p. ej., Optiquant).
Un paso
Históricamente, el proceso de sondeo se realizaba en dos pasos debido a la relativa facilidad de producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto brinda a los investigadores y corporaciones enormes ventajas en términos de flexibilidad, reducción de costos y agrega un paso de amplificación al proceso de detección. Sin embargo, dado el advenimiento del análisis de proteínas de alto rendimiento y los límites de detección más bajos, ha habido interés en desarrollar sistemas de sondeo de un solo paso que permitirían que el proceso ocurra más rápido y con menos consumibles. Esto requiere una sonda de anticuerpo que reconozca la proteína de interés y contenga una etiqueta detectable, sondas que a menudo están disponibles para etiquetas de proteínas conocidas. La sonda primaria se incuba con la membrana de manera similar a la del anticuerpo primario en un proceso de dos pasos y luego está lista para la detección directa después de una serie de pasos de lavado.
Detección y visualización
Después de lavar las sondas no unidas, el western blot está listo para la detección de las sondas que están marcadas y unidas a la proteína de interés. En términos prácticos, no todos los westerns revelan proteína solo en una banda de una membrana. Las aproximaciones de tamaño se toman comparando las bandas teñidas con las del marcador o escalera cargada durante la electroforesis. El proceso se suele repetir para una proteína estructural, como la actina o la tubulina, que no debería cambiar entre muestras. La cantidad de proteína diana se normaliza a la proteína estructural para controlar entre grupos. Una estrategia superior es la normalización a la proteína total visualizada con tricloroetanol o epicocconona. Esta práctica asegura la corrección de la cantidad de proteína total en la membrana en caso de errores o transferencias incompletas. (ver normalización de western blot)
Detección colorimétrica
El método de detección colorimétrica depende de la incubación del western blot con un sustrato que reacciona con la enzima informadora (como la peroxidasa) que está unida al anticuerpo secundario. Esto convierte el colorante soluble en una forma insoluble de un color diferente que precipita junto a la enzima y, por lo tanto, tiñe la membrana. A continuación, se detiene el desarrollo de la mancha lavando el tinte soluble. Los niveles de proteína se evalúan mediante densitometría (la intensidad de la mancha) o espectrofotometría.
Detección quimioluminiscente
Los métodos de detección quimioluminiscentes dependen de la incubación del western blot con un sustrato que se iluminará cuando se exponga al indicador del anticuerpo secundario. Luego, la luz es detectada por cámaras CCD que capturan una imagen digital del western blot o película fotográfica. El uso de película para la detección de transferencia Western está desapareciendo lentamente debido a la falta de linealidad de la imagen (cuantificación no precisa). La imagen se analiza mediante densitometría, que evalúa la cantidad relativa de tinción de proteínas y cuantifica los resultados en términos de densidad óptica. El software más nuevo permite un mayor análisis de datos, como el análisis del peso molecular, si se utilizan los estándares apropiados.
Detección radiactiva
Las etiquetas radiactivas no requieren sustratos enzimáticos, sino que permiten la colocación de una película de rayos X médica directamente contra el western blot, que se desarrolla a medida que se expone a la etiqueta y crea regiones oscuras que corresponden a las bandas de proteína de interés. (ver imagen arriba). La importancia de los métodos de detección radiactiva está disminuyendo debido a su radiación peligrosa, porque es muy costosa, los riesgos para la salud y la seguridad son altos y la ECL (quimioluminiscencia mejorada) proporciona una alternativa útil.
Detección fluorescente
La sonda marcada con fluorescencia es excitada por la luz y la emisión de la excitación es luego detectada por un fotosensor como una cámara CCD equipada con filtros de emisión apropiados que capturan una imagen digital del western blot y permiten un mayor análisis de datos como molecular análisis de peso y un análisis de Western blot cuantitativo. La fluorescencia se considera uno de los mejores métodos de cuantificación, pero es menos sensible que la quimioluminiscencia.
Sondaje secundario
Una de las principales diferencias entre las membranas de nitrocelulosa y PVDF se relaciona con la capacidad de cada una para soportar el "desprendimiento" eliminar los anticuerpos y reutilizar la membrana para las sondas de anticuerpos posteriores. Si bien existen protocolos bien establecidos disponibles para pelar membranas de nitrocelulosa, el PVDF más resistente permite un pelado más fácil y una mayor reutilización antes de que el ruido de fondo limite los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe empaparse en etanol al 95 %, isopropanol o metanol antes de su uso. Las membranas de PVDF también tienden a ser más gruesas y más resistentes al daño durante el uso.
Especificación de requisitos mínimos para Western Blot
Para garantizar que los resultados de las transferencias Western sean reproducibles, es importante informar los diversos parámetros mencionados anteriormente, incluida la preparación de la muestra, la concentración de proteína utilizada para la carga, el porcentaje de gel y las condiciones de funcionamiento, varios métodos de transferencia, tratando de bloquear las condiciones, la concentración de anticuerpos, y los métodos de identificación y determinación cuantitativa. Muchos de los artículos que se han publicado no cubren todas estas variables. Por lo tanto, es crucial describir diferentes circunstancias o parámetros experimentales para aumentar la repetibilidad y precisión de WB. Para aumentar la repetibilidad de WB, se requiere un criterio mínimo de información.
Electroforesis en gel bidimensional
La SDS-PAGE bidimensional utiliza los principios y técnicas descritos anteriormente. 2-D SDS-PAGE, como sugiere su nombre, implica la migración de polipéptidos en 2 dimensiones. Por ejemplo, en la primera dimensión, los polipéptidos se separan según el punto isoeléctrico, mientras que en la segunda dimensión, los polipéptidos se separan según su peso molecular. El punto isoeléctrico de una proteína determinada está determinado por el número relativo de aminoácidos cargados positivamente (p. ej., lisina, arginina) y negativamente (p. ej., glutamato, aspartato), con aminoácidos cargados negativamente que contribuyen a un punto isoeléctrico bajo y aminoácidos cargados positivamente contribuyendo a un punto isoeléctrico alto. Las muestras también podrían separarse primero en condiciones no reductoras utilizando SDS-PAGE y en condiciones reductoras en la segunda dimensión, que rompe los enlaces disulfuro que mantienen unidas las subunidades. SDS-PAGE también podría combinarse con urea-PAGE para un gel bidimensional.
En principio, este método permite la separación de todas las proteínas celulares en un solo gel grande. Una gran ventaja de este método es que a menudo distingue entre diferentes isoformas de una proteína en particular, p. una proteína que ha sido fosforilada (mediante la adición de un grupo cargado negativamente). Las proteínas que se han separado se pueden cortar del gel y luego analizar por espectrometría de masas, que identifica su peso molecular.
Problemas relacionados con Western Blot
Problemas de detección
Puede haber una señal débil o ausente en la banda por varias razones relacionadas con la cantidad de anticuerpo y antígeno que se usa. Este problema podría resolverse usando las concentraciones y diluciones ideales de antígeno y anticuerpo especificadas en la hoja de datos del proveedor. Aumentar el período de exposición en el software del sistema de detección puede abordar las bandas débiles causadas por concentraciones más bajas de muestras y anticuerpos.
Problemas de bandas múltiples
Cuando las proteasas descomponen la proteína, pueden aparecer varias bandas distintas de las bandas previstas de bajo peso molecular. El desarrollo de numerosas bandas se puede prevenir preparando adecuadamente las muestras de proteínas con suficientes inhibidores de proteasa. Pueden aparecer múltiples bandas en la región de alto peso molecular porque algunas proteínas forman dímeros, trímeros y multímeros; este problema podría resolverse calentando la muestra durante períodos de tiempo más prolongados. Las proteínas con modificaciones postraduccionales (PTM) o numerosas isoformas hacen que aparezcan varias bandas en diversas áreas de peso molecular. Los PTM se pueden eliminar de una muestra con productos químicos específicos, que también eliminan las bandas adicionales.
Fondo alto
Las concentraciones de anticuerpos fuertes, el bloqueo inadecuado, el lavado inadecuado y el tiempo de exposición excesivo durante la obtención de imágenes pueden dar como resultado un fondo alto en las transferencias. Se podría evitar un fondo alto en las transferencias solucionando estos problemas.
Bandas irregulares y desiguales
Se ha afirmado que se han producido una variedad de bandas extrañas y desiguales, incluidos puntos negros, manchas o bandas blancas y bandas curvas. Los puntos de bloque se eliminan de las manchas mediante un bloqueo efectivo. Se desarrollan parches blancos como resultado de las burbujas entre la membrana y el gel. Aparecen bandas blancas en las transferencias cuando los anticuerpos principal y secundario están presentes en concentraciones significativas. Debido al alto voltaje utilizado durante la ejecución del gel y la rápida migración de proteínas, aparecen bandas sonrientes en las transferencias. Las bandas extrañas en la mancha se resuelven al resolver estos problemas.
Mejoras para problemas relacionados con Western Blot
Durante el western blotting, podría haber varios problemas relacionados con los diferentes pasos de este ensayo. Esos problemas podrían originarse en un paso de análisis de proteínas, como la detección de proteínas modificadas poco o después de la traducción. Además, pueden basarse en la selección de anticuerpos ya que la calidad de los anticuerpos juega un papel importante en la detección de proteínas específicamente. Debido a la presencia de este tipo de problemas, se están produciendo una variedad de mejoras en los campos de preparación de lisados celulares y procedimientos de transferencia para generar resultados confiables. Además, para lograr un análisis más sensible y superar los problemas asociados con la transferencia Western, se han desarrollado y utilizado varias técnicas diferentes, como la transferencia Far-Western, la transferencia por difusión, la transferencia Western con resolución unicelular y la transferencia Western microfluídica automatizada.
Presentación
Los investigadores utilizan diferentes software para procesar y alinear secciones de imágenes para una presentación elegante de los resultados de Western blot. Las herramientas populares incluyen Sciugo, Microsoft PowerPoint, Adobe Illustrator y GIMP.
Blot occidental mejorada
(feminine)Desde 1980, el western blot se ha convertido en el método más utilizado en biología molecular para determinar la presencia y cantidad de una determinada proteína. A lo largo de los años, muchas funciones "avanzadas" y "optimizado" Se han desarrollado métodos sistemáticos. Estos desarrollos brindan resultados avanzados y más sensibles, con la ayuda de tecnologías de imagen más avanzadas y métodos modernos de etiquetado fluorescente.
Transferencia-transferencia occidental
El método con la tasa de adopción más alta para determinar las proteínas de unión al ADN y las interacciones proteína-ADN es la prueba de cambio de movilidad electroforética. Los complejos proteína-ADN se analizan mediante shift-WB. Se crea mediante la transferencia de complejos proteína-ADN, en los que el ADN de la membrana cargada se coloca debajo de la membrana de nitrocelulosa mientras que las proteínas se mantienen en la membrana. Luego, se usan anticuerpos específicos para identificar las proteínas y se usa una marca radiactiva para identificar el ADN. Además, las proteínas y el ADN transmitidos se pueden recuperar y examinar con mayor detalle.
Western blot de una sola célula
El WB unicelular (scWB), además del WB convencional, se considera un gran avance en el estudio de la localización subcelular de proteínas y en la evaluación de proteínas unicelulares. Cuando se miden los niveles y las condiciones de expresión de proteínas de una célula a otra, se utiliza. Con la ayuda del WB de una sola célula, la selectividad y la especificidad del western blot se ampliaron para incluir el análisis de proteínas de una sola célula. Esta técnica supera las limitaciones de precisión y sensibilidad de los anticuerpos. Además, debido a su versatilidad, se puede utilizar para medir numerosas proteínas diana al mismo tiempo de diferentes líneas celulares y células individuales.
Western blot cuantificable basado en fluorescencia
El desarrollo conocido como WB cuantificable basado en fluorescencia (QFWB) permite a los investigadores llevar a cabo análisis de expresión comparativos con mayor sensibilidad y precisión que nunca. Cuantificable en QFWB se refiere a genuinamente cuantitativo con mayor sensibilidad. Este método se emplea para identificar las mínimas variaciones de expresión entre varias muestras. Con la ayuda de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, QFWB produce un perfil de detección lineal. Las técnicas modernas de QFWB permiten el etiquetado dual simultáneo y son más sensibles para identificar variaciones mínimas.
Western blot informatizado cuantitativo
Western blot computarizado cuantitativo analiza la reactividad de anticuerpos individuales a antígenos específicos para identificar determinantes inmunodominantes e inmunorrecesivos utilizando dos medidas, como la intensidad de banda neta y la intensidad de carril total del WB. La identificación de ciertos antígenos inmunodominantes posibilita la creación de pruebas rápidas de serodiagnóstico y vacunas eficientes. El estudio busca marcadores serológicos para el diagnóstico precoz de enfermedades cancerosas, virales y autoinmunes mediante western blot computarizado cuantitativo.
Western blot de alto rendimiento (DigiWest)
Es una técnica que combina la resolución de proteínas SDS-PAGE convencional con una plataforma de micromatrices basada en perlas que inmoviliza proteínas en microesferas. Esta combinación de separación de proteínas, uniformidad y sensibilidad permite la cuantificación rápida de una serie de objetivos de proteínas diferentes, así como sus cambios. La ventaja de DigiWest es que el western blot se lleva a cabo utilizando micromatrices basadas en perlas, lo que permite la detección y el análisis simultáneos de cientos de proteínas distintas y sus cambios utilizando una amplia gama de anticuerpos variados.
Western blot de microfluidos
Para detectar muchas proteínas en un único chip de microfluidos, se lleva a cabo un western blot de microfluidos mediante una serie de procesos, incluido el enriquecimiento de la muestra, el tamaño de la proteína, el depósito de la proteína y, luego, el sondeo de anticuerpos in situ. Un gel de poliacrilamida fotorreactivo (luz ultravioleta) y una superficie fotomodelable (luz azul) son la base de este procedimiento de varios pasos. Debido a las mejoras en el rendimiento analítico, WB ahora se puede completar en 10 a 60 minutos mientras se mantienen límites de detección de alta sensibilidad (50 picomoles) y niveles de detección de componentes multiplexados (femtogramos). Por lo tanto, al fusionar una excelente especificidad y los beneficios de alto rendimiento de la multiplexación, WB crea una piedra angular para la proteómica rápida.
Western blot multitira
Una técnica mejorada de WB llamada multistrip WB se basa en la transferencia simultánea de diferentes proteínas desde varias tiras de gel de poliacrilamida a una sola membrana de difluoruro de polivinilideno o nitrocelulosa. Multistrip WB permite el monitoreo simultáneo de hasta nueve proteínas separadas de la misma carga de la muestra y un aumento de hasta diez veces en la salida de datos para un solo ciclo de WB. La biología de sistemas, la investigación de señalización celular y el diagnóstico biomédico se beneficiarían del uso de esta técnica.
Western blot basado en electroforesis capilar de microchip
El western blot basado en electroforesis capilar y de microchip se creó para reducir la cantidad de muestras de proteínas y la cantidad de tiempo que lleva ejecutar el western blot. Contribuye a la medición más sensible y precisa de varios objetivos proteicos de cualquier lisado de una sola célula realizado en un microchip. 400 nanogramos de lisado celular es todo lo que se necesita para identificar y cuantificar once proteínas diferentes.