Mancha norteña
El northern blot, o RNA blot, es una técnica utilizada en la investigación de biología molecular para estudiar la expresión génica mediante la detección de RNA (o mRNA aislado) en una muestra.
Con la transferencia Northern es posible observar el control celular sobre la estructura y la función mediante la determinación de las tasas de expresión de genes particulares durante la diferenciación y la morfogénesis, así como en condiciones anormales o enfermas. La transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y la detección con una sonda de hibridación complementaria a una parte oa la secuencia diana completa. Estrictamente hablando, el término 'borrón norteño' se refiere específicamente a la transferencia capilar de ARN desde el gel de electroforesis a la membrana de transferencia. Sin embargo, todo el proceso se conoce comúnmente como transferencia Northern. La técnica de transferencia Northern fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford. La transferencia Northern toma su nombre de su similitud con la primera técnica de transferencia, la transferencia Southern, llamada así por el biólogo Edwin Southern. La principal diferencia es que en el Northern blot se analiza el ARN, en lugar del ADN.
Procedimiento
Un procedimiento de transferencia general comienza con la extracción del ARN total de una muestra de tejido homogeneizado o de células. A continuación, se puede aislar el ARNm eucariótico mediante el uso de cromatografía de oligo (dT) celulosa para aislar solo los ARN con una cola poli(A). A continuación, las muestras de ARN se separan mediante electroforesis en gel. Dado que los geles son frágiles y las sondas no pueden entrar en la matriz, las muestras de ARN, ahora separadas por tamaño, se transfieren a una membrana de nailon a través de un sistema de transferencia capilar o al vacío.
Una membrana de nailon con carga positiva es la más eficaz para usar en la transferencia Northern, ya que los ácidos nucleicos con carga negativa tienen una gran afinidad por ellos. El tampón de transferencia utilizado para la transferencia suele contener formamida porque reduce la temperatura de hibridación de la interacción sonda-ARN, lo que elimina la necesidad de altas temperaturas, que podrían provocar la degradación del ARN. Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza a través de un enlace covalente a la membrana mediante luz ultravioleta o calor. Una vez marcada una sonda, se hibrida con el ARN de la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficacia y la especificidad de la hibridación incluyen la fuerza iónica, la viscosidad, la longitud del dúplex, los pares de bases no coincidentes y la composición de bases. La membrana se lava para garantizar que la sonda se haya unido específicamente y para evitar que surjan señales de fondo. Luego, las señales híbridas se detectan mediante una película de rayos X y se pueden cuantificar mediante densitometría. Para crear controles para la comparación en una transferencia Northern, las muestras que no muestren el producto génico de interés se pueden usar después de la determinación mediante micromatrices o RT-PCR.
Geles
Las muestras de ARN se suelen separar en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del ARN para limitar la estructura secundaria. Los geles pueden teñirse con bromuro de etidio (EtBr) y observarse con luz ultravioleta para observar la calidad y la cantidad de ARN antes de la transferencia. La electroforesis en gel de poliacrilamida con urea también se puede usar en la separación de ARN, pero se usa más comúnmente para ARN fragmentado o microARN. A menudo, se ejecuta una escalera de ARN junto con las muestras en un gel de electroforesis para observar el tamaño de los fragmentos obtenidos, pero en las muestras de ARN total, las subunidades ribosómicas pueden actuar como marcadores de tamaño. Dado que la subunidad ribosómica grande es 28S (aproximadamente 5 kb) y la subunidad ribosómica pequeña es 18S (aproximadamente 2 kb), aparecen dos bandas prominentes en el gel, la más grande con casi el doble de intensidad que la más pequeña.
Sondas
Las sondas para Northern blotting están compuestas por ácidos nucleicos con secuencia complementaria a todo o parte del ARN de interés, pueden ser ADN, ARN u oligonucleótidos con un mínimo de 25 bases complementarias a la secuencia diana. Las sondas de ARN (ribosondas) que se transcriben in vitro son capaces de soportar pasos de lavado más rigurosos, evitando parte del ruido de fondo. Comúnmente, el ADNc se crea con cebadores marcados para que la secuencia de ARN de interés actúe como sonda en la transferencia Northern. Las sondas deben etiquetarse con isótopos radiactivos (32P) o con quimioluminiscencia en la que la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante (HRP) descomponen sustratos quimioluminiscentes produciendo una emisión de luz detectable. El marcaje quimioluminiscente puede ocurrir de dos maneras: la sonda se une a la enzima o la sonda se marca con un ligando (p. ej., biotina) para el cual el ligando (p. ej., avidina o estreptavidina) se une a la enzima (p. ej., HRP). La película de rayos X puede detectar tanto las señales radiactivas como las quimioluminiscentes y muchos investigadores prefieren las señales quimioluminiscentes porque son más rápidas, más sensibles y reducen los riesgos para la salud que conllevan las etiquetas radiactivas. La misma membrana se puede sondear hasta cinco veces sin una pérdida significativa del ARN objetivo.
Aplicaciones
La transferencia Northern permite observar el patrón de expresión de un gen en particular entre tejidos, órganos, etapas de desarrollo, niveles de estrés ambiental, infección por patógenos y durante el transcurso del tratamiento. La técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la regulación a la baja de genes supresores de tumores en células cancerosas en comparación con células "normales". tejido, así como la expresión génica en el rechazo de órganos trasplantados. Si se observa un gen regulado al alza por una gran cantidad de ARNm en la transferencia Northern, la muestra se puede secuenciar para determinar si los investigadores conocen el gen o si se trata de un hallazgo novedoso. Los patrones de expresión obtenidos en determinadas condiciones pueden proporcionar información sobre la función de ese gen. Dado que el ARN primero se separa por tamaño, si solo se usa un tipo de sonda, la variación en el nivel de cada banda en la membrana puede proporcionar información sobre el tamaño del producto, lo que sugiere productos de empalme alternativos del mismo gen o motivos de secuencia repetitivos. La variación en el tamaño de un producto génico también puede indicar deleciones o errores en el procesamiento de la transcripción. Al alterar el objetivo de la sonda utilizada a lo largo de la secuencia conocida, es posible determinar qué región del ARN falta.
Ventajas y desventajas
El análisis de la expresión génica se puede realizar mediante varios métodos diferentes, incluidos RT-PCR, ensayos de protección de RNasa, micromatrices, RNA-Seq, análisis en serie de la expresión génica (SAGE), así como transferencia Northern. Los microarreglos se usan con bastante frecuencia y suelen ser consistentes con los datos obtenidos de transferencias Northern; sin embargo, a veces la transferencia Northern puede detectar pequeños cambios en la expresión génica que los microarrays no pueden detectar. La ventaja que tienen los microarrays sobre las transferencias Northern es que se pueden visualizar miles de genes a la vez, mientras que la transferencia Northern generalmente analiza uno o una pequeña cantidad de genes.
Un problema en la transferencia Northern es a menudo la degradación de la muestra por las RNasas (tanto endógenas a la muestra como a través de la contaminación ambiental), que se puede evitar mediante la esterilización adecuada del material de vidrio y el uso de inhibidores de RNasa como DEPC (dietilpirocarbonato). Los productos químicos utilizados en la mayoría de las transferencias del norte pueden ser un riesgo para el investigador, ya que el formaldehído, el material radiactivo, el bromuro de etidio, el DEPC y la luz ultravioleta son dañinos bajo ciertas exposiciones. En comparación con la RT-PCR, la transferencia Northern tiene una baja sensibilidad, pero también una alta especificidad, lo que es importante para reducir los resultados falsos positivos.
Las ventajas de usar la transferencia Northern incluyen la detección del tamaño del ARN, la observación de productos de empalme alternativos, el uso de sondas con homología parcial, la calidad y la cantidad de ARN se pueden medir en el gel antes de la transferencia y las membranas se puede almacenar y reprobar durante años después de la transferencia.
Para la transferencia Northern para la detección de ARNm de acetilcolinesterasa, la técnica no radiactiva se comparó con una técnica radiactiva y se encontró que era tan sensible como la radiactiva, pero no requiere protección contra la radiación y consume menos tiempo.
Blot norte inverso
En ocasiones, los investigadores utilizan una variante del procedimiento conocida como transferencia Northern inversa. En este procedimiento, el ácido nucleico sustrato (que se adhiere a la membrana) es una colección de fragmentos de ADN aislados, y la sonda es ARN extraído de un tejido y marcado radiactivamente. El uso de micromatrices de ADN que se generalizó a fines de la década de 1990 y principios de la de 2000 es más parecido al procedimiento inverso, ya que implica el uso de fragmentos de ADN aislados adheridos a un sustrato y la hibridación con una sonda hecha de ARN celular.. Por lo tanto, el procedimiento inverso, aunque originalmente poco común, permitió que el análisis Northern evolucionara hacia el perfilado de expresión génica, en el que se puede controlar la expresión de muchos (posiblemente todos) los genes de un organismo.