Lipoxigenasa

Las Lipoxigenasas (EC 1.13.11.-) (LOX) son una familia de enzimas que contienen hierro (no hemo), más concretamente enzimas oxidativas, la mayoría de que catalizan la dioxigenación de ácidos grasos poliinsaturados en lípidos que contienen un cis,cis-1,4-pentadieno en agentes de señalización celular que desempeñan diversas funciones como señales autocrinas que regulan la función de sus células madre y señales paracrinas que regulan la función de las células cercanas. y señales endocrinas que regulan la función de células distantes.

Las lipoxigenasas están relacionadas entre sí en función de su estructura genética similar y su actividad de dioxigenación. Sin embargo, una lipoxigenasa, ALOXE3, aunque tiene una estructura genética de lipoxigenasa, posee relativamente poca actividad de dioxigenación; más bien, su actividad principal parece ser la de una isomerasa que cataliza la conversión de ácidos grasos hidroperoxiinsaturados en sus derivados hidroxilo 1,5-epóxido.

Las lipoxigenasas se encuentran en eucariotas (plantas, hongos, animales, protistas); Si bien el tercer dominio de la vida terrestre, las arqueas, posee proteínas con una ligera (~20%) similitud en la secuencia de aminoácidos con las lipoxigenasas, estas proteínas carecen de residuos de unión a hierro y, por lo tanto, no se prevé que posean actividad lipoxigenasa.

Bioquímica

Basado en análisis detallados de la 15-lipoxigenasa 1 y la 5-lipoxigenasa estabilizada, las estructuras de la lipoxigenasa consisten en un dominio de barril beta N-terminal de 15 kilodaltons, un interdominio conector pequeño (por ejemplo, ~0,6 kilodaltons) (consulte Dominio de proteínas § Dominios y flexibilidad de proteínas), y un dominio catalítico C-terminal relativamente grande que contiene el hierro no hemo crítico para las enzimas' actividad catalítica. La mayoría de las lipoxigenasas (excepto ALOXE3) catalizan la reacción ácido graso poliinsaturado + O₂ → hidroperóxido de ácido graso en cuatro pasos:

• el paso límite de velocidad de abstracción de hidrógeno de un carbono metilen bial para formar un radical ácido graso en ese carbono
• reorganización del radical a otro centro de carbono
• adición de oxígeno molecular (O₂) al centro radical de carbono reorganizado, formando así un vínculo peroxy radical(—OO·) con ese carbono
• reducción del peróxido radical a su anión correspondiente (OO⁻)

El residuo (—OO^-) puede luego ser protonado para formar un grupo hidroperóxido (—OOH) y metabolizado adicionalmente por la lipoxigenasa a, p. leucotrienos, hepoxilinas y varios mediadores pro-resolución especializados, o reducidos por glutatión peroxidasas celulares ubicuas a un grupo hidroxi, formando así ácidos grasos poliinsaturados hidroxilados (-OH) como los ácidos hidroxieicosatetraenoicos y HODE (es decir, ácidos hidroxioctadecaenoicos).

Los ácidos grasos poliinsaturados que sirven como sustratos para una o más de las lipoxigenasas incluyen los ácidos grasos omega 6, el ácido araquidónico, el ácido linoleico, el ácido dihomo-γ-linolénico y el ácido adrénico; los ácidos grasos omega-3, ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico y ácido alfa-linolénico; y el ácido graso omega-9, ácido hidromiel. Ciertos tipos de lipoxigenasas, p.ej. La 15-lipoxigenasa 1, 12-lipoxigenasa B y ALOXE3 humana y murina son capaces de metabolizar sustratos de ácidos grasos que son constituyentes de fosfolípidos, ésteres de colesterol o lípidos complejos de la piel. La mayoría de las lipoxigenasas catalizan la formación de productos hidroperoxi formados inicialmente que tienen quiralidad S. Las excepciones a esta regla incluyen las 12R-lipoxigenasas de humanos y otros mamíferos (ver más abajo).

Las lipoxigenasas dependen de la disponibilidad de sus sustratos de ácidos grasos poliinsaturados que, particularmente en células de mamíferos, normalmente se mantienen en niveles extremadamente bajos. En general, varias fosfolipasa A2 y diacilglicerol lipasas se activan durante la estimulación celular, liberan estos ácidos grasos de sus sitios de almacenamiento y, por lo tanto, son reguladores clave en la formación de metabolitos dependientes de la lipoxigenasa. Además, las células, cuando se activan de esta manera, pueden transferir sus ácidos grasos poliinsaturados liberados a células adyacentes o cercanas que luego los metabolizan a través de sus vías de lipoxigenasa en un proceso denominado metabolismo transcelular o biosíntesis transcelular.

Función biológica y clasificación

Estas enzimas son más comunes en plantas donde pueden estar involucradas en diversos aspectos de la fisiología vegetal, incluido el crecimiento y desarrollo, la resistencia a las plagas y la senescencia o respuestas a las heridas. En los mamíferos, varias isoenzimas lipoxigenasas participan en el metabolismo de los eicosanoides (como las prostaglandinas, los leucotrienos y los eicosanoides no clásicos). Los datos de secuencia están disponibles para las siguientes lipoxigenasas:

Lipoxigenasas vegetales

Las plantas expresan una variedad de lipoxigenasas citosólicas (EC 1.13.11.12; InterPro: IPR001246), así como lo que parece ser una isoenzima del cloroplasto. La lipoxigenasa vegetal junto con las hidroperóxido liasas son responsables de muchas fragancias y otros compuestos de señalización. Un ejemplo es el cis-3-hexenal, el olor a hierba recién cortada.

Lipoxigenasas humanas

Con la excepción del gen que codifica 5-LOX (ALOX5), que se encuentra en el cromosoma 10q11.2, los seis genes LOX humanos se encuentran en el cromosoma 17. .p13 y codifica una proteína de cadena sencilla de 75 a 81 kilodaltons que consta de 662 a 711 aminoácidos. Los genes LOX de mamíferos contienen 14 (ALOX5, ALOX12, ALOX15, ALOX15B) o 15 (ALOX12B, ALOXE3) exones con límites exón/intrón en posiciones altamente conservadas. Las 6 lipoxigenasas humanas junto con algunos de los principales productos que fabrican, así como algunas de sus asociaciones con enfermedades genéticas, son los siguientes:

• Arachidonate 5-lipoxygenase (ALOX5) (EC 1.13.11.34; Inter Pro: IPR001885), también llamado 5-lipoxigenasa, 5-LOX, y 5-LO. Principales productos: metaboliza el ácido araquidonico a 5-hidroperoxi-eicostetraeoico ácido (5-HpETE) que se convierte en 1) Ácido 5-hidroxiicosatetraenoico (5-HETE) y luego a ácido 5-oxo-eicosatetraenoico (5-oxo-ETE), 2) leukotriene A4 (LTA4) que puede ser convertido a leucotrieno B4 (LTB4) o leucotrieno C4 (LTC4) (LTC4 puede ser metabolizado más a leucotrieno D4 [LTD4] y luego a leucotrieno E4 [LTE4]), o 3) actuando en serie con ALOX15, a los mediadores especializados pro-resolver, lipoxinas A4 y B4. ALOX5 también metaboliza el ácido eicosapentaenoico a un conjunto de metabolitos que contienen 5 dobles límites (es decir, 5-HEPE, 5-oxo-EPE, LTB5, LTD5, y LTE5) en lugar de los 4 metabolitos de ácido araquidónico que contienen doble vínculo. La enzima, cuando actúa en serie con otras enzimas lipoxigenasa, ciclooxygenasa o citocromo P450, contribuye al metabolismo del ácido eicosapentaenoico a los resolvins de la serie E (ver Resolvin § Resolvin Es) y del ácido docosahexaenoico a los resolvins de la serie D (ver Resolvin § Resolvin Ds). Estos resolvíos también se clasifican como mediadores especializados en pro de la resolución.
• Arachidonate 12-lipoxygenase (ALOX12) (EC 1.13.11.31; Inter Pro: IPR001885), también llamado 12-lipoxigenasa, plaqueta tipo plaqueta lipoxygenasa (o 12-lipoxygenasa, tipo plaqueta) 12-LOX, y 12-LO. Se metaboliza el ácido araquidonico a 12-hidroperoxieiocsatetraeoico (12-HpETE) que se metaboliza aún más al ácido 12-hidroxieicosatetraenoico (12-HETE) o a varias hepoxilinas (también se ve ácido 12-hidroxieicosatetraenoico).
• Arachidonate 15-lipoxygenase-1 (ALOX15) (EC 1.13.11.33; Inter Pro: IPR001885), también denominado 15-lipoxygenasa-1, eritrocito tipo 15-lipoxygenasa (o 15-lipoxigenasa, tipo eritrocito), tipo reticulocito 15-lipoxygenasa (o 15-lipoxigenasa, tipo reticulocito), 15-LO-1 y 15-LOX-1. metaboliza el ácido araquidónico principalmente a 1) 15-hidroperoxieiocatetraenoico ácido (15-HpETE) que se metaboliza aún más al ácido 15-hidroxiicosatetraenoico (15-HETE) pero también a cantidades mucho más pequeñas 2) 12-hidroperoxieicosatetraenoico ácido (12-HpETE) que se metaboliza aún más a 12-hidroxieicosatetraenoico ácido y posiblemente las hepoxilinas. ALOX15 prefiere el ácido linoléico sobre el ácido araquidónico, metabolizando el ácido linoléico a 12-hidroperoxioctadecaenoico (13-HpODE) que se metaboliza aún más al ácido 13-hidroxioctadecadienoico (13-HODE). ALOX15 puede metabolizar ácidos grasos poliinsaturados que son esterificados a fosfolípidos y/o al colesterol, es decir, ésteres de colesterol, en lipoproteínas. Esta propiedad junto con su doble especificidad en metabolizar ácido araquidónico a 12-HpETE y 15-HpETE son similares a los del ratón Alox15 y ha llevado a ambas enzimas que se denominan 12/15-lipoxigenases.
• Arachidonate 15-lipoxygenase tipo II (ALOX15B), también llamado 15-lipoxygenase-2, 15-LOX-2 y 15-LOX-2. metaboliza el ácido araquidonico a 15-hidroperoxieicosatetraenoico (15-HpETE) que se metaboliza aún más al ácido 15-hidroxiicosatetraenoico. ALOX15B tiene poca o ninguna habilidad para metabolizar el ácido araquidónico a ácido 12-hidroperoxeiocosatetraenoico (12-(HpETE) y sólo capacidad mínima para metabolizar el ácido linoléico a ácido 13-hidroperoxioctadecaenoico (13-HpODE).
• Arachidonate 12-lipoxygenase, tipo 12R (ALOX12B), también llamado 12R-lipoxygenase, 12R-LOX, y 12R- Hola. metaboliza ácido araquidónico a 12R-hidroxieicosatetraenoico ácido pero lo hace sólo con baja actividad catalítica; su sustrato más fisiológicamente importante se cree que es una esfingosina que contiene una cadena muy larga (16-34 carbonos) ácido graso omega-hidroxil que está en unión de amida con la Sn-2 nitrógeno de esfingosina en su extremo carboxico y esterificado al ácido linoléico en su extremo hidroxilo omega. En las células epidérmicas de la piel, ALOX12B metaboliza el linoleato en esta esterificada omega-hidroxiacil-sphingosina (EOS) a su 9R-hidroperoxy analog. Las mutaciones inactivadoras de ALOX12B están asociadas con la enfermedad de la piel humana, la eritroderma congénita recesiva autosómica congénita (ARCI).
• Epidermis-type lipoxygenase (ALOXE3), también denominado eLOX3 y lipoxigenasa, tipo epidermis. A diferencia de otras lipoxigenasas, ALOXE3 exhibe sólo una actividad de dioxigenasa latente. Más bien, su actividad primaria es como una isomerasa hidroperoxida que metaboliza ciertos ácidos grasos hidroperoxidos insaturados a sus derivados correspondientes de alcohol epoxi y keto epoxi y, por lo tanto, también se clasifica como una sintasa de hepoxilina. Mientras que puede metabolizar 12S-hidroperoxyeicosatetraenoico ácido (12)S-HpETE) al R estereoisómeros de hepoxilinas A3 y B3, ALOXE3 favorece la metabolización R ácidos grasos insaturados hidroperoxi y convierte eficientemente los 9(R)-hidroperoxy análogo de EOS hecho por ALOX15B a su 9R(10)R),13R-trans-epoxy-11E,13R y 9-keto-10E,12Z Analógicos EOS. Se cree que ALOXE3 actúa con ALOX12B en epidermis de la piel para formar estos dos últimos análogos de EOS; mutaciones de inactivación de ALOX3 son, similares a inactivar mutaciones en ALOX12B, asociadas con la eritroderma congénita autosómica recesiva congénita en humanos. Las mutaciones de inactivación en ALOX3 también están asociadas con la ichtiosis de la enfermedad humana (véase Ichthyosis § Tipos – punto 5 en la tabla).

Dos lipoxigenasas pueden actuar en serie para producir productos dihidroxi o trihidroxi que tienen actividades bastante diferentes a las de cualquiera de las lipoxienasas. productos. Este metabolismo en serie puede ocurrir en diferentes tipos de células que expresan solo una de las dos lipoxigenasas en un proceso denominado metabolismo transcelular. Por ejemplo, ALOX5 y ALOX15 o, alternativamente, ALOX5 y ALOX12 pueden actuar en serie para metabolizar el ácido araquidónico en lipoxinas (ver Ácido 15-hidroxieicosatetraenoico §§ Metabolismo adicional y actividades de 15(S)-HpETE, 15(S)-HETE, 15(R)-HpETE, 15(R)-HETE y 15-oxo-ETE y lipoxina § Síntesis), mientras que ALOX15 y posiblemente ALOX15B pueden actuar con ALOX5 para metabolizar el ácido eicosapentaenoico a resolvina D's (ver Resolvina § Bioquímica y producción).

Lipoxigenasas de ratón

El ratón es un modelo común para examinar la función de la lipoxigenasa. Sin embargo, existen algunas diferencias clave entre las lipoxigenasas entre ratones y hombres que dificultan la extrapolación de los estudios con ratones a los humanos. A diferencia de las 6 lipoxigenasas funcionales en humanos, los ratones tienen 7 lipoxigenasas funcionales y algunas de estas últimas tienen actividades metabólicas diferentes a las de sus ortólogos humanos. En particular, el Alox15 de ratón, a diferencia del ALOX15 humano, metaboliza el ácido araquidónico principalmente a 12-HpETE y el Alox15b de ratón, a diferencia del ALOX15b humano, es principalmente una 8-lipoxigenasa, que metaboliza el ácido araquidónico a 8-HpETE; No existe una lipoxigenasa formadora de 8-HpETE comparable en humanos.

• Alox5 parece ser similar en función de ALOX5 humano.
• Alox12 difiere de ALOX12 humano, que metaboliza preferentemente el ácido araquidónico a 12-HpETE pero también a cantidades sustanciales de 15-HpETE, en que metaboliza el ácido araquidónico casi exclusivamente a 12-HpETE.
• Alox15 (también denominado leukocyte-type 12-Lox, 12-Lox-l, y 12/15-Lox) difiere de ALOX15 humano, que bajo condiciones de ensayo estándar metaboliza ácido araquidónico a 15-HpETE y 12-HpETE en un ratio 89 a 11, metaboliza ácido araquidónico a 15-Hpete. Además, el humano ALOX15 prefiere ácido linoléico sobre ácido araquidonico como sustrato, metabolizándolo a 13-HpODE mientras que Alox15 tiene poca o ninguna actividad en ácido linoléico. Alox15 puede metabolizar ácidos grasos poliinsaturados que son esterificados a fosfolípidos y colesterol (es decir, ésteres de colesterol). Esta propiedad junto con su doble especificidad en metabolizar el ácido araquidónico a 12-HpETE y 15-HpETE son similares a los de ALOX15 humano y ha llevado a ambas enzimas que se denominan 12/15-lipoxigenas.
• Alox15b (también denominado 8-lipoxygenasa, 8-lox y 15-lipoxygenasa tipo II), en contraste con ALOX15B que metaboliza el ácido araquidonico principalmente a 15-HpETE y en menor medida ácido linoléico a 13-HpODE, metaboliza el ácido araquidonico principalmente a 8S- HpETE y ácido linoléico a 9-HpODE. Alox15b es tan eficaz como ALOX5 en metabolizar 5-HpETE a leucotrinas.
• Alox12e (12-Lox-e, epidermal-type 12-Lox) es un ortolog al gen ALOX12P humano que ha sufrido mutaciones dañinas y no se expresa. ALox12e prefiere esteres de metil sobre sustratos de ácidos grasos poliinsaturados no esterificados, metabolizando ester de ácido linoléico a su contraparte 13-hidroperoxi y en menor medida ester de ácido araquidonico a su contraparte 12-hidroperoxy.
• Alox12b (e-LOX2, epidermis-type Lox-12) parece actuar de forma similar a ALOX12B para metabolizar la mezcla de ácido linoléico de EOS a su 9R-hidroperoxy contraparte y así contribuir a la integridad de la piel y la impermeabilidad del agua; ratones llenos de Alox12b desarrollan un grave defecto de la piel similar al eritroderma congénito ichthyosiform. A diferencia del humano ALOX12B que le cam metaboliza el ácido araquidónico a 12R-HETE a baja velocidad, Alox12b no metaboliza el ácido araquidónico como ácido libre pero dosis metaboliza el ácido araquidónico metil ester a su 12R- Contraparte hidroperoxi.
• Aloxe3 (epidermis-type Lox-3, eLox3) parece actuar de forma similar a ALOXe3 en la metabolización de los 9R-hidoperoxy-linoleate derivative of EOS to its epoxy and keto derivatives and to be involved in maintaining skin integrity and water impermeability. La eliminación de AloxE3 conduce a un defecto similar al ictiosiforme congénito eritroderma.

Estructura 3D

Se conocen varias estructuras de lipoxigenasa, entre ellas: lipoxigenasa de soja L1 y L3, 8-lipoxigenasa de coral, 5-lipoxigenasa humana, 15-lipoxigenasa de conejo y dominio catalítico de 12-lipoxigenasa de leucocitos porcinos. La proteína consta de un pequeño dominio PLAT N-terminal y un dominio catalítico C-terminal importante (consulte la base de datos de Pfam), que contiene el sitio activo. Tanto en las enzimas de plantas como de mamíferos, el dominio N-terminal contiene un barril β antiparalelo de ocho cadenas, pero en las lipoxigenasas de soja este dominio es significativamente mayor que en la enzima de conejo. Las lipoxigenasas vegetales se pueden escindir enzimáticamente en dos fragmentos que permanecen estrechamente asociados mientras la enzima permanece activa; La separación de los dos dominios conduce a la pérdida de actividad catalítica. El dominio C-terminal (catalítico) consta de 18-22 hélices y una (en enzimas de conejo) o dos (en enzimas de soja) láminas β antiparalelas en el extremo opuesto del barril β N-terminal.

Sitio activo

El átomo de hierro en las lipoxigenasas está unido por cuatro ligandos, tres de los cuales son residuos de histidina. Se conservan seis histidinas en todas las secuencias de lipoxigenasa, cinco de ellas se encuentran agrupadas en un tramo de 40 aminoácidos. Esta región contiene dos de los tres ligandos de zinc; Se ha demostrado que las otras histidinas son importantes para la actividad de las lipoxigenasas.

Las dos largas hélices centrales se cruzan en el sitio activo; Ambas hélices incluyen tramos internos de hélice π que proporcionan tres ligandos de histidina (His) al hierro del sitio activo. Dos cavidades en el dominio principal de la lipoxigenasa-1 de soja (cavidades I y II) se extienden desde la superficie hasta el sitio activo. La cavidad I en forma de embudo puede funcionar como un canal de dioxígeno; la cavidad II, larga y estrecha, es presumiblemente una bolsa de sustrato. La enzima de mamíferos más compacta contiene sólo una cavidad en forma de bota (cavidad II). En la lipoxigenasa-3 de soja hay una tercera cavidad que va desde el sitio del hierro hasta la interfaz del barril β y los dominios catalíticos. La cavidad III, el sitio del hierro y la cavidad II forman un pasaje continuo a través de la molécula de proteína.

El hierro del sitio activo está coordinado por N^ε de tres residuos de His conservados y un oxígeno del grupo carboxilo C-terminal. Además, en las enzimas de la soja, la cadena lateral de oxígeno de la asparagina está débilmente asociada con el hierro. En la lipoxigenasa de conejo, este residuo de Asn se reemplaza con His, que coordina el hierro a través del átomo N^δ. Por tanto, el número de coordinación del hierro es cinco o seis, con un ligando hidroxilo o agua para un hierro hexacoordinado.

Se revelaron detalles sobre la característica del sitio activo de la lipoxigenasa en la estructura del complejo del dominio catalítico de 12-lipoxigenasa de leucocitos porcinos. En la estructura 3D, el inhibidor del análogo del sustrato ocupaba un canal en forma de U abierto adyacente al sitio de hierro. Este canal podría acomodar ácido araquidónico sin muchos cálculos, definiendo los detalles de unión del sustrato para la reacción de la lipoxigenasa. Además, para la ruta del oxígeno se podría considerar un posible canal de acceso que intercepte el canal de unión al sustrato y se extienda hasta la superficie de la proteína.

Clasificación bioquímica

La lipoxigenasa 1 de soja exhibe el mayor efecto isotópico cinético H/D (KIE) sobre kcat (kH/kD) (81 cerca de la temperatura ambiente) reportado hasta ahora para un sistema biológico. Recientemente, se encontró un KIE extremadamente elevado de 540 a 730 en una lipoxigenasa de soja 1 doble mutante. Debido a la gran magnitud del KIE, la lipoxigenasa de soja 1 ha servido como prototipo para reacciones de túnel de hidrógeno catalizadas por enzimas.

Las proteínas humanas expresadas a partir de la familia de las lipoxigenasas incluyen ALOX12, ALOX12B, ALOX15, ALOX15B, ALOX5 y ALOXE3. Mientras que los humanos también poseen el gen ALOX12P, que es un ortólogo del gen Alox12P bien expresado en ratones, el gen humano es un pseudogén; en consecuencia, la proteína ALOX12P2 no se detecta en humanos.