Limoneno-1,2-epóxido hidrolasa

En enzimología, una limoneno-1,2-epóxido hidrolasa (EC 3.3.2.8) es una enzima que cataliza la reacción química.

limusina-1,2-epoxida + H₂O ${\displaystyle \rightleftharpoons }$ limusina-1,2-diol

Por lo tanto, los dos sustratos de esta enzima son el limoneno-1,2-epóxido y el H₂O, mientras que su producto es el limoneno-1,2-diol.

Esta enzima se encuentra en la bacteria Rhodococcus erythropolis DCL14, donde participa en la vía de degradación del limoneno, que permite a la bacteria catabolizarlo como fuente de carbono y energía. Pertenece a la familia de las hidrolasas, específicamente a las que actúan sobre enlaces éter (éter hidrolasas). El nombre sistemático de esta clase de enzimas es limoneno-1,2-epóxido hidrolasa. Esta enzima también se denomina limoneno óxido hidrolasa. Esta enzima presenta su actividad máxima a pH 7 y 50 °C, y participa en la degradación del limoneno y el pineno.Las epóxido hidrolasas catalizan la hidrólisis de epóxidos a los dioles correspondientes, lo cual es importante para la desintoxicación, la síntesis de moléculas señal o el metabolismo. La limoneno-1,2-epóxido hidrolasa (LEH) difiere de muchas otras epóxido hidrolasas (EH) en su estructura y su novedoso mecanismo catalítico de un solo paso. Las EH suelen contener pliegues de α/β-hidrolasa conservados y residuos catalíticos que contribuyen a la estabilización del epóxido y su posterior reacción de hidrólisis. Sin embargo, la baja masa molecular de la LEH, de 16 kDa, sugiere que es demasiado pequeña para albergar estos pliegues de α/β-hidrolasa y los motivos de tríada catalítica presentes en otras EH. Además, en comparación con otros EH, el LEH acepta una menor diversidad de sustratos y solo puede catalizar reacciones con limoneno-1,2-epóxido, óxido de 1-metilciclohexeno, óxido de ciclohexeno y óxido de indeno. Por lo tanto, el LEH se considera el miembro fundador de una nueva familia de EH, y sus detalles mecanísticos, estructurales y funcionales son de especial interés.

La hidrólisis epóxica del limoneno, catalizada por LEH, se produce mediante un mecanismo de un solo paso. El agua nucleófila ataca una de las dos posiciones electrofílicas del epóxido, abriendo el anillo de tres miembros para crear dioles vecinales. Estudios de mecánica cuántica y mecánica molecular han observado que la hidrólisis mediada por LEH ataca preferentemente al carbono epóxico más sustituido. Las energías de activación de ataque en los carbonos más y menos sustituidos son de 16,9 kcal/mol y 25,1 kcal/mol, respectivamente. Estos datos también sugieren que el mecanismo de LEH está catalizado por ácido, ya que las condiciones ácidas favorecen la hidrólisis en el carbono epóxico más sustituido, que tiene una mayor carga δ+.El mecanismo de hidrólisis de la LEH no utiliza un intermediario covalente enzima-sustrato, lo cual es distinto de otros EH. Sin embargo, sí recluta aminoácidos del sitio activo para el intercambio ácido-base de protones y la estabilización del sustrato. Según estudios de mutagénesis, la LEH contiene cinco residuos catalíticos cruciales: Asp101, Arg99, Asp132, Tyr53 y Asn55. Los tres primeros residuos catalíticos forman una tríada Asp-Arg-Asp que dona y acepta activamente protones de los sustratos en la reacción para impulsarla y facilitar su desarrollo. La evidencia del modelado computacional sugiere que la Asp132 actúa desprotonando el agua para aumentar su nucleofilicidad en la reacción, mientras que la Asp101 protona el oxígeno del epóxido para formar uno de los dos alcoholes en el producto diol. La Arg99, con carga positiva, contribuye estabilizando las cargas negativas en Asp101 y Asp132. Los dos últimos residuos catalíticos, Tyr53 y Asn55, ayudan a estabilizar y unir la molécula de agua mediante enlaces de hidrógeno para que alcance la orientación óptima para el ataque del epóxido.

La reacción catalizada por LEH produce una estereoquímica selectiva en sus carbonos quirales. El LEH produce enantiómeros puros del limoneno-1,2-diol al administrar una mezcla racémica del epóxido. Cuando el sustrato tiene un centro quiral R en el carbono 4 (4R), el producto es (1S,2S,4R)-limoneno-1,2-diol, independientemente de si el epóxido del sustrato está trans o cis respecto a la sustitución en el carbono 4. De forma similar, un sustrato con un centro quiral S en el carbono 4 (4S) produce únicamente el (1R,2R,4S)-limoneno-1,2-diol. Debido a la naturaleza enantioconvergente del LEH y a su capacidad para producir un solo producto enantiomérico, tiene importantes aplicaciones en la síntesis industrial.El LEH también presenta preferencia por estereoisómeros específicos de su sustrato. Reacciona con todos los epóxidos de limoneno (1R,2S) antes de iniciar la hidrólisis de los estereoisómeros (1S,2R). La presencia de sustratos (1S,2R) no disminuye la velocidad de reacción con los estereoisómeros preferidos, lo que sugiere que los epóxidos de limoneno (1S,2R) son inhibidores competitivos débiles.La estructura cristalina de la LEH contiene una lámina beta mixta de seis cadenas, con tres hélices alfa N-terminales empaquetadas a un lado para crear una cavidad que se extiende hacia el núcleo de la proteína. Una cuarta hélice se encuentra de tal manera que actúa como borde de esta cavidad. Aunque está revestida principalmente por residuos hidrofóbicos, esta cavidad presenta un conjunto de grupos polares que se encuentran en su punto más profundo y constituyen el sitio activo de la enzima. La LEH también es un dímero con dos subunidades en un ángulo de 179° entre sí. Las dos subunidades son en gran medida simétricas, excluyendo los aminoácidos en el extremo N-terminal que están próximos al pliegue principal.Si bien la estructura de la LEH es distinta a la de la mayoría de las EH, no es completamente irreconocible en comparación con todas ellas. Por ejemplo, la epóxido hidrolasa Rv2740, nativa de Mycobacterium tuberculosis, contiene un sitio activo y una tríada catalítica similar a la de la LEH, con tres hélices empaquetadas en una lámina beta curva de seis cadenas. Al igual que la LEH, carece del plegamiento α/β-hidrolasa presente en la mayoría de las EH. Con esta clase emergente de enzimas, la LEH y otras EH igualmente únicas podrían convertirse en herramientas novedosas con un gran potencial para la catálisis industrial.