Lector de placas

Los lectores de placas, también conocidos como lectores de microplacas o fotómetros de microplacas, son instrumentos que se utilizan para detectar eventos biológicos, químicos o físicos de muestras en placas de microtitulación. Se utilizan ampliamente en investigación, descubrimiento de fármacos, validación de bioensayos, control de calidad y procesos de fabricación en la industria farmacéutica y biotecnológica y en organizaciones académicas. Las reacciones de las muestras se pueden analizar en placas de microtitulación con formato de 1-1536 pocillos. El formato de microplaca más común utilizado en laboratorios de investigación académica o laboratorios de diagnóstico clínico es el de 96 pocillos (matriz de 8 por 12) con un volumen de reacción típico de entre 100 y 200 μl por pocillo. Las microplacas de mayor densidad (microplacas de 384 o 1536 pocillos) se utilizan normalmente para aplicaciones de detección, cuando el rendimiento (número de muestras procesadas por día) y el costo del ensayo por muestra se convierten en parámetros críticos, con un volumen de ensayo típico entre 5 y 50 μL por pocillo. . Los modos de detección comunes para los ensayos de microplacas son la absorbancia, la intensidad de la fluorescencia, la luminiscencia, la fluorescencia resuelta en el tiempo y la polarización de la fluorescencia.

Métodos

Absorbancia

La detección de absorbancia ha estado disponible en lectores de microplacas durante más de 3 décadas y se utiliza para ensayos como ensayos ELISA, cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos o ensayos de actividad enzimática (es decir, en el ensayo MTT para la viabilidad celular). Una fuente de luz ilumina la muestra usando una longitud de onda específica (seleccionada mediante un filtro óptico o un monocromador) y un detector de luz ubicado en el otro lado del pozo mide cuánta luz inicial (100%) se transmite a través de la muestra. : la cantidad de luz transmitida normalmente estará relacionada con la concentración de la molécula de interés. Se han miniaturizado varios análisis colorimétricos convencionales para que funcionen cuantitativamente en un lector de placas, con un rendimiento adecuado para fines de investigación. Ejemplos de análisis convertidos a métodos de lectura de placas incluyen varios para amonio, nitrato, nitrito, urea, hierro (II) y ortofosfato. Se han desarrollado químicas colorimétricas más recientes directamente para su uso en lectores de placas.

Fluorescencia

La detección de la intensidad de la fluorescencia se ha desarrollado ampliamente en el formato de microplacas durante las últimas dos décadas. La gama de aplicaciones es mucho más amplia que cuando se utiliza la detección de absorbancia, pero la instrumentación suele ser más cara. En este tipo de instrumentación, un primer sistema óptico (sistema de excitación) ilumina la muestra utilizando una longitud de onda específica (seleccionada mediante un filtro óptico o un monocromador). Como resultado de la iluminación, la muestra emite luz (fluorescente) y un segundo sistema óptico (sistema de emisión) recoge la luz emitida, la separa de la luz de excitación (mediante un filtro o sistema monocromador) y mide la señal mediante un detector de luz como un tubo fotomultiplicador (PMT). Las ventajas de la detección por fluorescencia sobre la detección por absorbancia son la sensibilidad y el rango de aplicación, dada la amplia selección de etiquetas fluorescentes disponibles en la actualidad. Por ejemplo, una técnica conocida como imágenes de calcio mide la intensidad de fluorescencia de tintes sensibles al calcio para evaluar los niveles de calcio intracelular.

Luminiscencia

La luminiscencia es el resultado de una reacción química o bioquímica. La detección de luminiscencia es ópticamente más simple que la detección de fluorescencia porque la luminiscencia no requiere una fuente de luz para la excitación ni una óptica para seleccionar longitudes de onda de excitación discretas. Un sistema óptico de luminiscencia típico consta de una cámara de lectura hermética y un detector PMT. Algunos lectores de placas utilizan un detector PMT analógico, mientras que otros tienen un detector PMT con recuento de fotones. El conteo de fotones es ampliamente aceptado como el medio más sensible para detectar luminiscencia. Algunos lectores de placas ofrecen rueda de filtros o sistemas ópticos monocromadores de longitud de onda sintonizable para seleccionar longitudes de onda luminiscentes específicas. La capacidad de seleccionar múltiples longitudes de onda, o incluso rangos de longitud de onda, permite la detección de ensayos que contienen múltiples enzimas informadoras luminiscentes, el desarrollo de nuevos ensayos de luminiscencia, así como un medio para optimizar la relación señal-ruido.

Las aplicaciones comunes incluyen ensayos de expresión genética basados en luciferasa, así como ensayos de viabilidad celular, citotoxicidad y biorritmo basados en la detección luminiscente de ATP.

Fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF)

La medición de fluorescencia resolviendo el tiempo (TRF) es muy similar a la medición de intensidad de fluorescencia (FI). La única diferencia es el momento del proceso de excitación/medición. Al medir la FI, los procesos de excitación y emisión son simultáneos: la luz emitida por la muestra se mide mientras se produce excitación. A pesar de que los sistemas de emisión son muy eficientes en la eliminación de la luz de excitación antes de que llegue al detector, la cantidad de luz de excitación en comparación con la luz de emisión es tal que las mediciones FI siempre exhiben señales de fondo bastante elevadas. TRF ofrece una solución a este problema. Se basa en el uso de moléculas fluorescentes muy específicas, llamadas lanthanides, que tienen la propiedad inusual de emitir durante largos períodos de tiempo (medida en milisegundos) después de la excitación, cuando la mayoría de los tintes fluorescentes estándar (por ejemplo, fluoresceína) emiten dentro de unos pocos nanosegundos de excitación. Como resultado, es posible excitar lanthanides usando una fuente de luz pulsada (Lámpara flash Xenon o láser pulsado por ejemplo) y medir después del pulso de excitación. Esto resulta en fondos de medición más bajos que en ensayos FI estándar. Los inconvenientes son que la instrumentación y los reactivos son generalmente más caros, y que las aplicaciones tienen que ser compatibles con el uso de estos tintes de lantanoide muy específicos. El uso principal de TRF se encuentra en aplicaciones de detección de drogas, bajo un formulario llamado TR-FRET (transferencia energética de fluorescencia resolvida por el tiempo). Los ensayos TR-FRET son muy robustos (sensibilidad limitada a varios tipos de interferencia de ensayo) y se minimizan fácilmente. Robustness, la capacidad de automatizar y minimizar son características que son muy atractivas en un laboratorio de detección.

Polarización de fluorescencia

La medición de la polarización de fluorescencia también está muy cerca de la detección de FI. La diferencia es que el sistema óptico incluye filtros polarizadores en el camino de la luz: las muestras en la microplaca se excitan usando luz polarizada (en lugar de luz no polarizada en los modos FI y TRF). Dependiendo de la movilidad de las moléculas fluorescentes que se encuentran en los pocillos, la luz emitida estará polarizada o no. Por ejemplo, las moléculas grandes (por ejemplo, proteínas) en solución, que giran relativamente lentamente debido a su tamaño, emitirán luz polarizada cuando se exciten con luz polarizada. Por otro lado, la rápida rotación de moléculas más pequeñas provocará una despolarización de la señal. El sistema de emisión del lector de placas utiliza filtros polarizadores para analizar la polaridad de la luz emitida. Un nivel bajo de polarización indica que pequeñas moléculas fluorescentes se mueven libremente en la muestra. Un alto nivel de polarización indica que el fluorescente está unido a un complejo molecular más grande. Como resultado, una de las aplicaciones básicas de la detección de FP son los ensayos de unión molecular, ya que permiten detectar si una pequeña molécula fluorescente se une (o no) a una molécula más grande y no fluorescente: la unión da como resultado una velocidad de rotación más lenta de la molécula fluorescente, y en un aumento de la polarización de la señal.

Dispersión de la luz y nefelometría

La dispersión de la luz y la nefelometría son métodos para determinar la turbidez de una solución (es decir, partículas insolubles en una solución). Un haz de luz atraviesa la muestra y la luz es dispersada por las partículas suspendidas. La luz dispersada hacia adelante medida indica la cantidad de partículas insolubles presentes en la solución. Las aplicaciones comunes de nefelometría/dispersión de luz incluyen la detección automatizada de solubilidad de fármacos HTS, la cinética de crecimiento microbiano a largo plazo, la floculación, la agregación y el seguimiento de la polimerización y precipitación, incluida la inmunoprecipitación.

Instrumentos y ensayos

Muchos de los modos de detección (absorbancia, intensidad de fluorescencia, luminiscencia, fluorescencia resuelta en el tiempo y polarización de fluorescencia) están disponibles de forma independiente en lectores de placas dedicados, pero hoy en día se encuentran muy a menudo combinados en un solo instrumento (placas multimodo). lector). También existen instrumentos para medir la luz dinámica o estática dispersada por muestras en una microplaca. La gama de aplicaciones para lectores de placas multimodo es extremadamente amplia. Algunos de los ensayos más comunes son:

• ELISA
• Ensayos de proteína y crecimiento celular
• Proteína: interacciones proteínas
• Reporter assays
• quantitación de ácido nucleico
• Interacciones moleculares
• Actividad enzimática
• Toxicidad celular, proliferación y viabilidad
• Cuantificación ATP
• Inmunoassays
• Examen de alto rendimiento de compuestos y objetivos en el descubrimiento de drogas (Etiqueta Alfa en la mayoría de los instrumentos)
• Bead-Based Epitope Assay
• Subida celular de nanopartículas

Mientras el "lector de placas" generalmente se refiere a los dispositivos descritos anteriormente, hay muchas variaciones disponibles. Algunos ejemplos de otros dispositivos que funcionan con el formato de microplacas son:

• Los lectores de placas ELISPOT, solían contar los puntos de color que se forman en el curso de ensayos ELISPOT.
• Imágenes de alto rendimiento que pueden medir todos los pozos de un microplato a la vez
• Sistemas de detección de alto contenido (HCS) que imagenan cada pozo con alta resolución, para ver las poblaciones celulares
• Instrumentos libres de etiquetas que utilizan microplatas especializadas para medir eventos vinculantes sin el uso de marcadores químicos