La transcriptasa inversa

Una transcriptasa inversa (RT) es una enzima que se utiliza para generar ADN complementario (ADNc) a partir de una plantilla de ARN, un proceso denominado transcripción inversa. Las transcriptasas inversas son utilizadas por virus como el VIH y la hepatitis B para replicar sus genomas, por elementos genéticos móviles retrotransposones para proliferar dentro del genoma del huésped y por células eucariotas para extender los telómeros en los extremos de sus cromosomas lineales. Contrariamente a una creencia generalizada, el proceso no viola los flujos de información genética descritos por el dogma central clásico, ya que las transferencias de información del ARN al ADN se consideran explícitamente posibles.

La RT retroviral tiene tres actividades bioquímicas secuenciales: actividad de polimerasa de ADN dependiente de ARN, ribonucleasa H (RNasa H) y actividad de polimerasa de ADN dependiente de ADN. Colectivamente, estas actividades permiten que la enzima convierta el ARN monocatenario en ADNc bicatenario. En los retrovirus y los retrotransposones, este ADNc puede luego integrarse en el genoma del huésped, a partir del cual se pueden hacer nuevas copias de ARN mediante la transcripción de la célula huésped. La misma secuencia de reacciones se usa ampliamente en el laboratorio para convertir el ARN en ADN para su uso en clonación molecular, secuenciación de ARN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o análisis del genoma.

Historia

Las transcriptasas inversas fueron descubiertas por Howard Temin en la Universidad de Wisconsin-Madison en viriones de sarcoma de Rous y David Baltimore las aisló de forma independiente en 1970 en el MIT a partir de dos virus tumorales de ARN: el virus de la leucemia murina y nuevamente Rous virus del sarcoma Por sus logros, compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1975 (con Renato Dulbecco).

Las transcriptasas inversas bien estudiadas incluyen:

• VIH-1 transcripción inversa del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (PDB: 1HMV) tiene dos subunidades, que tienen pesos moleculares respectivos de 66 y 51 kDas.
• La transcripción reversa M-MLV del virus de la leucemia murina Moloney es un monomero de 75 kDa.
• La transcripción inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar también tiene dos subunidades, una subunidad de 63 kDa y una subunidad de 95 kDa.
• Telomerasa transcripción inversa que mantiene los telómeros de cromosomas eucariotas.

Función en virus

La transcripción inversa se muestra con sus regiones de dedo, palma y pulgar. Los aminoácidos catalíticos del sitio activo RNase H y el sitio activo de la polimerasa se muestran en forma de bola y palo.

Las enzimas son codificadas y utilizadas por virus que utilizan la transcripción inversa como un paso en el proceso de replicación. Los virus de ARN de transcripción inversa, como los retrovirus, utilizan la enzima para transcribir de forma inversa sus genomas de ARN en ADN, que luego se integra en el genoma del huésped y se replica junto con él. Los virus de ADN de transcripción inversa, como los hepadnavirus, pueden permitir que el ARN sirva como plantilla para ensamblar y fabricar hebras de ADN. El VIH infecta a los humanos con el uso de esta enzima. Sin la transcriptasa inversa, el genoma viral no podría incorporarse a la célula huésped, lo que provocaría una falla en la replicación.

Proceso de transcripción inversa o retrotranscripción

La transcriptasa inversa crea ADN de doble cadena a partir de una plantilla de ARN.

En las especies de virus con transcriptasa inversa que carecen de actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN, la creación de ADN de doble cadena posiblemente se puede realizar mediante la ADN polimerasa δ codificada por el huésped, confundiendo el ADN-ARN viral con un cebador y sintetizando un ADN de doble cadena. ADN por un mecanismo similar al de la eliminación de cebadores, donde el ADN recién sintetizado desplaza la plantilla de ARN original.

El proceso de transcripción inversa, también llamado retrotranscripción o retrotras, es extremadamente propenso a errores y es durante este paso que pueden ocurrir mutaciones. Tales mutaciones pueden causar resistencia a los medicamentos.

Transcripción inversa retroviral

Mecanismo de transcripción inversa en el VIH. Los números de paso no coinciden.

Los retrovirus, también conocidos como virus ssRNA-RT de clase VI, son virus de transcripción inversa de ARN con un intermedio de ADN. Sus genomas consisten en dos moléculas de ARN monocatenario de sentido positivo con un 5' tapa y 3' cola poliadenilada. Los ejemplos de retrovirus incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus linfotrópico T humano (HTLV). La creación de ADN de doble cadena ocurre en el citosol como una serie de estos pasos:

1. Lysyl tRNA actúa como una cartilla e híbrida a una parte complementaria del genoma RNA virus llamado el sitio de unión de la cartilla o PBS.
2. La transcripción inversa añade nucleótidos de ADN al final de 3' de la imprimación, sintetizando ADN complementario a la U5 (región no codificación) y región R (repetición directa encontrada en ambos extremos de la molécula RNA) del ARN viral.
3. Un dominio sobre la enzima transcriptasa inversa llamada RNAse H degrada las regiones U5 y R en el extremo 5 del ARN.
4. El primer tRNA luego "jumps" al final de 3' del genoma viral, y los recién sintetizados hilos de ADN híbridos a la región R complementaria en el ARN.
5. El ADN complementario (cDNA) añadido en (2) se amplía aún más.
6. La mayoría de ARN viral es degradada por RNAse H, dejando sólo la secuencia PP.
7. La síntesis de la segunda cadena de ADN comienza, utilizando el fragmento PP restante del ARN viral como una cartilla.
8. El primer tRNA sale y ocurre un "golpe". El PBS del segundo hilo híbrido con el PBS complementario en el primer hilo.
9. Ambas hebras se extienden para formar una copia completa de ADN de doble filo del genoma original del ARN viral, que puede ser incorporada al genoma del host por la enzima integradora.

La creación de ADN de doble cadena también implica la transferencia de cadena, en la que hay una translocación del producto de ADN corto desde la síntesis inicial de ADN dependiente del ARN a las regiones de la plantilla aceptora en el otro extremo del genoma. que luego son alcanzados y procesados por la transcriptasa inversa para su actividad de ADN dependiente de ADN.

El ARN retroviral está dispuesto en el extremo 5' al extremo 3'. El sitio donde el cebador se hibrida con el ARN viral se denomina sitio de unión del cebador (PBS). El extremo 5' del ARN del sitio PBS se denomina U5, y el extremo 3' del ARN del PBS se denomina líder. El cebador de ARNt se desenrolla entre 14 y 22 nucleótidos y forma un dúplex de pares de bases con el ARN viral en PBS. El hecho de que el PBS esté ubicado cerca del extremo 5' del ARN viral es inusual porque la transcriptasa inversa sintetiza el ADN desde el extremo 3' del cebador en la dirección 5' a 3' (con respecto a la cadena de ADN recién sintetizada). Por lo tanto, el cebador y la transcriptasa inversa deben reubicarse en el extremo 3' del ARN viral. Para lograr esta reposición, se necesitan múltiples pasos y varias enzimas, incluidas la ADN polimerasa, la ribonucleasa H (RNasa H) y el desenrollado de polinucleótidos.

La transcriptasa inversa del VIH también tiene actividad de ribonucleasa que degrada el ARN viral durante la síntesis de ADNc, así como actividad de polimerasa de ADN dependiente de ADN que copia la cadena de ADNc sentido en un ADN antisentido para formar un intermedio de ADN viral de doble cadena (vDNA). Los elementos estructurales del ARN viral del VIH regulan la progresión de la transcripción inversa.

En la vida celular

Los tramos autorreplicantes de genomas eucarióticos conocidos como retrotransposones utilizan la transcriptasa inversa para moverse de una posición en el genoma a otra a través de un intermediario de ARN. Se encuentran abundantemente en los genomas de plantas y animales. La telomerasa es otra transcriptasa inversa que se encuentra en muchos eucariotas, incluidos los humanos, que lleva su propia plantilla de ARN; este ARN se utiliza como molde para la replicación del ADN.

Los informes iniciales de transcriptasa inversa en procariotas se remontan a 1971 en Francia (Beljanski et al., 1971a, 1972) y unos años más tarde en la URSS (Romashchenko 1977). Desde entonces, estos se han descrito ampliamente como parte de Retrons bacterianos, secuencias distintas que codifican para la transcriptasa inversa y se utilizan en la síntesis de msDNA. Para iniciar la síntesis de ADN, se necesita un cebador. En las bacterias, el cebador se sintetiza durante la replicación.

Valerian Dolja del estado de Oregón argumenta que los virus, debido a su diversidad, han jugado un papel evolutivo en el desarrollo de la vida celular, con la transcriptasa inversa jugando un papel central.

Estructura

La transcriptasa inversa emplea una "mano derecha" estructura similar a la que se encuentra en otras polimerasas de ácido nucleico viral. Además de la función de transcripción, las transcriptasas inversas retrovirales tienen un dominio perteneciente a la familia RNase H, que es vital para su replicación. Al degradar la plantilla de ARN, permite que se sintetice la otra hebra de ADN. Algunos fragmentos de la digestión también sirven como cebador para la ADN polimerasa (ya sea la misma enzima o una proteína huésped), responsable de producir la otra cadena (más).

Fidelidad de replicación

Hay tres sistemas de replicación diferentes durante el ciclo de vida de un retrovirus. El primer proceso es la síntesis de transcriptasa inversa de ADN viral a partir de ARN viral, que luego forma cadenas de ADN complementarias recién creadas. El segundo proceso de replicación ocurre cuando la ADN polimerasa celular del huésped replica el ADN viral integrado. Por último, la ARN polimerasa II transcribe el ADN proviral en ARN, que se empaquetará en viriones. La mutación puede ocurrir durante uno o todos estos pasos de replicación.

La transcriptasa inversa tiene una alta tasa de error al transcribir el ARN en ADN ya que, a diferencia de la mayoría de las otras ADN polimerasas, no tiene capacidad de corrección. Esta alta tasa de error permite que las mutaciones se acumulen a un ritmo acelerado en relación con las formas de replicación corregidas. Las transcriptasas inversas disponibles comercialmente producidas por Promega se citan en sus manuales con índices de error en el rango de 1 en 17.000 bases para AMV y 1 en 30.000 bases para M-MLV.

Además de crear polimorfismos de un solo nucleótido, también se ha demostrado que las transcriptasas inversas están involucradas en procesos como las fusiones de transcritos, el barajado de exones y la creación de transcritos antisentido artificiales. Se ha especulado que esta actividad de cambio de plantilla de la transcriptasa inversa, que se puede demostrar completamente in vivo, puede haber sido una de las causas de encontrar varios miles de transcritos sin anotar en el genomas de organismos modelo.

Cambio de plantilla

Se empaquetan dos genomas de ARN en cada partícula de retrovirus, pero, después de una infección, cada virus genera solo un provirus. Después de la infección, la transcripción inversa se acompaña de un cambio de plantilla entre las dos copias del genoma (recombinación de elección de copia). Hay dos modelos que sugieren por qué la ARN transcriptasa cambia de plantilla. El primero, el modelo de elección de copia forzada, propone que la transcriptasa inversa cambia la plantilla de ARN cuando encuentra una muesca, lo que implica que la recombinación es obligatoria para mantener la integridad del genoma del virus. El segundo, el modelo de elección dinámica, sugiere que la transcriptasa inversa cambia las plantillas cuando la función de la ARNasa y la función de la polimerasa no están sincronizadas en cuanto a la velocidad, lo que implica que la recombinación ocurre al azar y no en respuesta al daño genómico. Un estudio de Rawson et al. admitió ambos modelos de recombinación. En cada ciclo de replicación ocurren de 5 a 14 eventos de recombinación por genoma. El cambio de plantilla (recombinación) parece ser necesario para mantener la integridad del genoma y como mecanismo de reparación para salvar genomas dañados.

Aplicaciones

La estructura molecular de zidovudine (AZT), un fármaco utilizado para inhibir la transcripción inversa

Medicamentos antivirales

Como el VIH utiliza la transcriptasa inversa para copiar su material genético y generar nuevos virus (parte de un círculo de proliferación de retrovirus), se han diseñado fármacos específicos para interrumpir el proceso y, por lo tanto, suprimir su crecimiento. En conjunto, estos medicamentos se conocen como inhibidores de la transcriptasa inversa e incluyen los análogos de nucleósidos y nucleótidos zidovudina (nombre comercial Retrovir), lamivudina (Epivir) y tenofovir (Viread), así como inhibidores no nucleósidos, como la nevirapina (Viramune).

Biología molecular

La transcriptasa inversa se usa comúnmente en la investigación para aplicar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa al ARN en una técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). La técnica clásica de PCR solo se puede aplicar a las hebras de ADN, pero, con la ayuda de la transcriptasa inversa, el ARN se puede transcribir en ADN, lo que hace posible el análisis por PCR de las moléculas de ARN. La transcriptasa inversa también se usa para crear bibliotecas de ADNc a partir de ARNm. La disponibilidad comercial de la transcriptasa inversa mejoró enormemente el conocimiento en el área de la biología molecular, ya que, junto con otras enzimas, permitió a los científicos clonar, secuenciar y caracterizar el ARN.