Integrasa
La integrasa retroviral (IN) es una enzima producida por un retrovirus (como el VIH) que integra (forma enlaces covalentes entre) su información genética en la del huésped célula que infecta. Las IN retrovirales no deben confundirse con las integrasas de fago (recombinasas) utilizadas en biotecnología, como la integrasa de fago λ, como se describe en la recombinación específica del sitio.
El complejo macromolecular de una macromolécula IN unida a los extremos del ADN viral se ha denominado intosoma; IN es un componente clave en esto y en el complejo de preintegración retroviral.
Estructura
Todas las proteínas IN retrovirales contienen tres dominios canónicos, conectados por conectores flexibles:
● un dominio de unión a zinc HH-CC N-terminal (un haz de tres hélices estabilizado por la coordinación de un catión Zn(II))
● un dominio central catalítico (pliegue RNaseH)
● un dominio de unión a ADN C-terminal (pliegue SH3).
Se han informado estructuras cristalinas y de RMN de los dominios individuales y construcciones de 2 dominios de integrasas de HIV-1, HIV-2, SIV y Rous Sarcoma Virus (RSV), con las primeras estructuras determinadas en 1994. Datos bioquímicos y los datos estructurales sugieren que la IN retroviral funciona como un tetrámero (dímero de dímeros), siendo los tres dominios importantes para la multimerización y la unión al ADN viral. Además, se ha demostrado que varias proteínas celulares del huésped interactúan con la IN para facilitar el proceso de integración: por ejemplo, el factor del huésped, la proteína asociada a la cromatina humana LEDGF, se une fuertemente a la IN del VIH y dirige el complejo de preintegración del VIH hacia genes altamente expresados para integración.
El virus espumoso humano (HFV), un agente inofensivo para los humanos, tiene una integrasa similar a la IN del VIH y, por lo tanto, es un modelo de la función IN del VIH; Se ha determinado una estructura cristalina de 2010 de la integrasa HFV ensamblada en los extremos del ADN viral.
Función y mecanismo
La integración ocurre después de la producción del ADN viral lineal de doble cadena por la transcriptasa inversa de la ADN polimerasa dependiente de ARN/ADN viral.
La función principal de IN es insertar el ADN viral en el ADN cromosómico del huésped, un paso esencial para la replicación del VIH. La integración es un "punto de no retorno" para la célula, que se convierte en portadora permanente del genoma viral (provirus). La integración es en parte responsable de la persistencia de infecciones retrovirales. Después de la integración, la expresión del gen viral y la producción de partículas pueden tener lugar inmediatamente o en algún momento en el futuro, el momento depende de la actividad del locus cromosómico que alberga el provirus.
Los IN retrovirales catalizan dos reacciones:
● Procesamiento 3', en el que se eliminan dos o tres nucleótidos de uno o ambos 3' extremos del ADN viral para exponer un dinucleótido CA invariable en ambos extremos 3' del ADN viral.
● la reacción de transferencia de cadena, en la que el 3' Los extremos del ADN viral se ligan covalentemente al ADN cromosómico huésped.
Ambas reacciones se catalizan en el mismo sitio activo e implican la transesterificación sin la participación de un intermedio proteína-ADN covalente (a diferencia de las reacciones catalizadas por la recombinasa Ser/Tyr.
En VIH
VIH integrasa es una proteína viral de 32 kDa que consta de tres dominios: N-terminal, dominio central catalítico y C-terminal, cada uno de los cuales tiene propiedades y funciones distintas que contribuyen a la eficacia de la integrasa del VIH.
El extremo N se compone de 50 residuos de aminoácidos que contienen una secuencia conservada de histidina, histidina, citosina y citosina que quela los iones de zinc y, además, mejora la actividad enzimática del dominio central catalítico. Como la quelación de metales es vital en la eficacia de la integrasa, es un objetivo para el desarrollo de terapias retrovirales.
El dominio central catalítico, como el extremo N, contiene residuos de aminoácidos altamente conservados -Asp64, Asp116, Glu152- ya que el motivo DDE (Asp-Asp-Glu) conservado contribuye a las funciones de endonucleasa y polinucleótido transferasa de la integrasa. Las mutaciones en estas regiones inactivan la integrasa y evitan la integración del genoma.
El dominio C-terminal se une al ADN del huésped de forma no específica y estabiliza el complejo de integración.
Mecanismo de integración
Después de la síntesis del genoma del ADN de doble cadena del VIH, la integrasa se une a las largas repeticiones en tándem que flanquean el genoma en ambos extremos. Usando su actividad endonucleolítica, la integrasa escinde un di o trinucleótido de ambos 3' extremos del genoma en un procesamiento conocido como procesamiento 3'. La especificidad de la escisión se mejora mediante el uso de cofactores como Mn2+ y Mg2+ que interactúan con el motivo DDE del dominio central catalítico, actuando como cofactores para función integrasa.
Los grupos 3'OH recién generados interrumpen los enlaces fosfodiéster del ADN del huésped mediante un ataque nucleofílico de tipo SN2. El 3' extremos están unidos covalentemente al ADN diana. El 5' Luego, los restos del genoma viral se escinden utilizando enzimas de reparación del huésped, se cree que esas mismas enzimas son responsables de la integración del 5 & 39; terminan en el genoma huésped formando el provirus.
Terapia antirretroviral
En noviembre de 2005, los datos de un estudio de fase 2 de un inhibidor de la integrasa del VIH en investigación, MK-0518, demostraron que el compuesto tiene una potente actividad antiviral. El 12 de octubre de 2007, la Administración de Drogas y Alimentos (EE. UU.) aprobó el inhibidor de la integrasa Raltegravir (MK-0518, nombre comercial Isentress). El segundo inhibidor de la integrasa, elvitegravir, fue aprobado en los EE. UU. en agosto de 2012.