Inmunofluorescencia

inmunofluorescencia es una técnica utilizada para microscopía óptica con un microscopio de fluorescencia y se utiliza principalmente en muestras biológicas. Esta técnica utiliza la especificidad de los anticuerpos contra su antígeno para dirigir tintes fluorescentes a biomoléculas específicas dentro de una célula y, por lo tanto, permite la visualización de la distribución de la molécula objetivo a través de la muestra. La región específica que un anticuerpo reconoce en un antígeno se llama epítopo. Se han realizado esfuerzos en el mapeo de epítopos, ya que muchos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo y los niveles de unión entre anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden variar. Además, la unión del fluoróforo al propio anticuerpo no puede interferir con la especificidad inmunológica del anticuerpo o la capacidad de unión de su antígeno. La inmunofluorescencia es un ejemplo ampliamente utilizado de inmunotinción (el uso de anticuerpos para teñir proteínas) y es un ejemplo específico de inmunohistoquímica (el uso de la relación anticuerpo-antígeno en los tejidos). Esta técnica utiliza principalmente fluoróforos para visualizar la ubicación de los anticuerpos.

La inmunofluorescencia se puede utilizar en secciones de tejido, líneas celulares cultivadas o células individuales, y se puede utilizar para analizar la distribución de proteínas, glicanos y pequeñas moléculas biológicas y no biológicas. Esta técnica se puede utilizar incluso para visualizar estructuras como filamentos de tamaño intermedio. Si aún no se ha determinado la topología de una membrana celular, la inserción de epítopos en proteínas se puede utilizar junto con la inmunofluorescencia para determinar las estructuras. La inmunofluorescencia también se puede utilizar como método "semicuantitativo" método para obtener información sobre los niveles y patrones de localización de la metilación del ADN, ya que es un método que requiere más tiempo que los verdaderos métodos cuantitativos y existe cierta subjetividad en el análisis de los niveles de metilación. La inmunofluorescencia se puede utilizar en combinación con otros métodos de tinción fluorescente sin anticuerpos, por ejemplo, el uso de DAPI para marcar el ADN. Se pueden utilizar varios diseños de microscopios para el análisis de muestras de inmunofluorescencia; el más simple es el microscopio de epifluorescencia y el microscopio confocal también se usa ampliamente. También se pueden utilizar varios diseños de microscopios de súper resolución que son capaces de alcanzar una resolución mucho mayor.

Tipos

Preparación de fluorescencia

Para producir anticuerpos marcados con fluorocromo, se debe conjugar ("etiquetar") un fluorocromo al anticuerpo. Asimismo, también se puede conjugar un antígeno al anticuerpo con una sonda fluorescente en una técnica denominada técnica de antígeno fluorescente. Los procedimientos de tinción pueden aplicarse tanto al antígeno fijado en el citoplasma como a los antígenos de la superficie celular de las células vivas, lo que se denomina "inmunofluorescencia de membrana". También es posible marcar el complemento del complejo anticuerpo-antígeno con una sonda fluorescente. Además del elemento al que se unen las sondas de fluorescencia, existen dos clases generales de técnicas de inmunofluorescencia: primaria y secundaria. Las siguientes descripciones se centrarán principalmente en estas clases en términos de anticuerpos conjugados.

Existen dos clases de técnicas de inmunofluorescencia, primaria (o directa) y secundaria (o indirecta).

Primario (directo)

La inmunofluorescencia primaria (directa) utiliza un único anticuerpo primario, unido químicamente a un fluoróforo. El anticuerpo primario reconoce la molécula objetivo (antígeno) y se une a una región específica llamada epítopo. Esto se logra mediante un proceso que manipula la respuesta inmune del organismo con inmunidad adaptativa. El fluoróforo adherido se puede detectar mediante microscopía fluorescente que, dependiendo del mensajero utilizado, emitirá una longitud de onda de luz específica una vez excitado. La inmunofluorescencia directa, aunque algo menos común, tiene ventajas notables sobre el procedimiento secundario (indirecto). La unión directa del mensajero al anticuerpo reduce la cantidad de pasos del procedimiento, lo que ahorra tiempo y reduce la señal de fondo no específica. Esto también limita la posibilidad de reactividad cruzada de anticuerpos y posibles errores durante todo el proceso. Sin embargo, existen algunas desventajas en este método. Dado que el número de moléculas fluorescentes que pueden unirse al anticuerpo primario es limitado, la inmunofluorescencia directa es sustancialmente menos sensible que la inmunofluorescencia indirecta y puede dar lugar a falsos negativos. La inmunofluorescencia directa también requiere el uso de muchos más anticuerpos primarios, lo cual es extremadamente costoso y a veces llega hasta los 400,00 dólares/ml.

Secundario (indirecto)

La inmunofluorescencia secundaria (indirecta) utiliza dos anticuerpos; el primer anticuerpo (primario) no marcado se une específicamente a la molécula diana, y el anticuerpo secundario, que porta el fluoróforo, reconoce el anticuerpo primario y se une a él. Múltiples anticuerpos secundarios pueden unirse a un único anticuerpo primario. Esto proporciona amplificación de la señal al aumentar la cantidad de moléculas de fluoróforo por antígeno. Este protocolo es más complejo y requiere más tiempo que el protocolo primario (o directo) anterior, pero permite más flexibilidad porque se puede utilizar una variedad de diferentes anticuerpos secundarios y técnicas de detección para un anticuerpo primario determinado.

Este protocolo es posible porque un anticuerpo consta de dos partes, una región variable (que reconoce el antígeno) y una región constante (que constituye la estructura de la molécula de anticuerpo). Es importante darse cuenta de que esta división es artificial y en realidad la molécula de anticuerpo consta de cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Un investigador puede generar varios anticuerpos primarios que reconocen varios antígenos (tienen diferentes regiones variables), pero todos comparten la misma región constante. Por tanto, todos estos anticuerpos pueden ser reconocidos por un único anticuerpo secundario. Esto ahorra el costo de modificar los anticuerpos primarios para transportar directamente un fluoróforo.

Por lo general, se generan diferentes anticuerpos primarios con diferentes regiones constantes al aumentar el anticuerpo en diferentes especies. Por ejemplo, un investigador podría crear anticuerpos primarios en una cabra que reconozcan varios antígenos y luego emplear anticuerpos secundarios de conejo acoplados a colorante que reconozcan la región constante del anticuerpo de cabra (anticuerpos anti-cabra de conejo). Luego, el investigador puede crear un segundo conjunto de anticuerpos primarios en un ratón que podría ser reconocido por un anticuerpo "anti-ratón de burro" anticuerpo secundario. Esto permite la reutilización de los anticuerpos acoplados a colorantes, difíciles de producir, en múltiples experimentos.

Limitaciones

Como ocurre con la mayoría de las técnicas de fluorescencia, un problema importante con la inmunofluorescencia es el fotoblanqueo. La pérdida de actividad causada por el fotoblanqueo se puede controlar reduciendo o limitando la intensidad o el período de exposición a la luz, aumentando la concentración de fluoróforos o empleando fluoróforos más robustos que sean menos propensos al blanqueo (p. ej., Alexa Fluors, Seta Fluors, o DyLight Fluores). Algunos problemas que pueden surgir de esta técnica incluyen autofluorescencia, fluorescencia específica extraña no deseada y fluorescencia no específica. La autofluorescencia incluye la fluorescencia emitida por el tejido de muestra o la propia célula. Se produce una fluorescencia específica extraña e indeseada cuando un antígeno objetivo es impuro y contiene contaminantes antigénicos. La fluorescencia inespecífica implica la pérdida de la especificidad de una sonda debido al fluoróforo, a una fijación inadecuada o a una muestra seca.

La inmunofluorescencia solo se limita a células fijas (es decir, muertas) cuando se deben visualizar estructuras dentro de la célula porque los anticuerpos no penetran la membrana celular cuando reaccionan con etiquetas fluorescentes. El material antigénico debe fijarse firmemente en el lugar de su localización natural dentro de la célula. Los anticuerpos intactos también pueden ser demasiado grandes para teñir las células cancerosas in vivo. Su tamaño da como resultado una penetración tumoral lenta y una vida media circulante prolongada. Se han realizado investigaciones sobre el uso de diacuerpos para sortear esta limitación. Los anticuerpos pueden unir las proteínas del sobrenadante o del exterior de la membrana celular; esto permite teñir células vivas. Dependiendo del fijador que se esté utilizando, las proteínas de interés pueden entrecruzarse y esto podría dar como resultado señales falsas positivas o falsas negativas debido a una unión no específica.

Un enfoque alternativo es utilizar proteínas recombinantes que contengan dominios de proteínas fluorescentes, por ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP). El uso de dichas etiquetas "etiquetadas" Las proteínas permiten determinar su localización en células vivas. Aunque esto parece ser una alternativa elegante a la inmunofluorescencia, las células deben transfectarse o transducirse con la etiqueta GFP y, como consecuencia, se convierten en organismos al menos S1 o superior que requieren estándares de seguridad más estrictos en un laboratorio. Esta técnica consiste en alterar la información genética de las células.

Avances

Muchas mejoras de este método radican en la mejora de los microscopios fluorescentes y los fluoróforos. Los métodos de superresolución generalmente se refieren a la capacidad de un microscopio para producir una resolución por debajo del límite de Abbe (un límite impuesto a la luz debido a su longitud de onda). Este límite de difracción es de unos 200-300 nm en dirección lateral y de 500-700 nm en dirección axial. Este límite es comparable o mayor que algunas estructuras de la célula y, en consecuencia, impidió a los científicos determinar detalles de su estructura. La superresolución en fluorescencia, más específicamente, se refiere a la capacidad de un microscopio para evitar la fluorescencia simultánea de fluoróforos adyacentes espectralmente idénticos. Este proceso agudiza efectivamente la función de dispersión de puntos del microscopio. Ejemplos de métodos de microscopio fluorescente de superresolución desarrollados recientemente incluyen la microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED), la microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM), la microscopía de localización de fotoactivación de fluorescencia (FPALM) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM).

Personas destacadas

• Cornelia Mitchell Downs (1892-1987), microbiólogo y periodista