Inmunodifusión radial

La inmunodifusión radial (RID), inmunodifusión de Mancini o ensayo de inmunodifusión radial simple, es una técnica de inmunodifusión utilizada en inmunología para determinar la cantidad o concentración de un antígeno en una muestra.

Se añade una solución que contiene el anticuerpo a un medio calentado, como agar o agarosa disuelta en solución salina normal tamponada. A continuación, el medio fundido se vierte sobre un portaobjetos de microscopio o en un recipiente abierto, como una placa de Petri, y se deja enfriar y formar un gel. A continuación, se coloca una solución que contiene el antígeno en un pocillo perforado en el gel. A continuación, se cubre el portaobjetos o el recipiente, se cierra o se coloca en una caja de humedad para evitar la evaporación.

El antígeno se difunde radialmente en el medio, formando un círculo de precipitina que marca el límite entre el anticuerpo y el antígeno. El diámetro del círculo aumenta con el tiempo a medida que el antígeno se difunde en el medio, reacciona con el anticuerpo y forma complejos de precipitina insolubles. El antígeno se cuantifica midiendo el diámetro del círculo de precipitina y comparándolo con los diámetros de los círculos de precipitina formados por cantidades o concentraciones conocidas del antígeno.

Los complejos antígeno-anticuerpo son pequeños y solubles cuando hay un exceso de antígeno. Por lo tanto, la precipitación cerca del centro del círculo suele ser menos densa que cerca del borde exterior del círculo, donde el antígeno está menos concentrado.

La expansión del círculo alcanza un punto final y se detiene cuando se agota el antígeno libre y cuando el antígeno y el anticuerpo alcanzan la equivalencia. Sin embargo, la claridad y la densidad del borde exterior del círculo pueden seguir aumentando después de que el círculo deje de expandirse.

Para la mayoría de los antígenos, el área y el cuadrado del diámetro del círculo en el punto final del círculo son directamente proporcionales a la cantidad inicial de antígeno y son inversamente proporcionales a la concentración de anticuerpo. Por lo tanto, un gráfico que compara las cantidades o concentraciones de antígeno en las muestras originales con las áreas o los cuadrados de los diámetros de los círculos de precipitina en un gráfico de línea de mejor ajuste generalmente será una línea recta después de que todos los círculos hayan alcanzado sus puntos finales (método de equivalencia).

Los círculos que forman pequeñas cantidades de antígeno llegan a sus puntos finales antes que los círculos que forman grandes cantidades. Por lo tanto, si se miden las áreas o los diámetros de los círculos mientras algunos, pero no todos, los círculos han dejado de expandirse, dicho gráfico será recto en la parte cuyos pocillos contenían inicialmente las cantidades o concentraciones más pequeñas de antígeno y será curvo en la parte cuyos pocillos contenían las cantidades o concentraciones más grandes.

Mientras los círculos se están expandiendo, un gráfico que compara las cantidades o concentraciones iniciales del antígeno en una escala logarítmica con los diámetros o áreas de los círculos en una escala lineal puede ser una línea recta (método cinético). Sin embargo, los círculos del precipitado son más pequeños y menos nítidos durante la expansión que cuando la expansión ha terminado. Además, la temperatura afecta la velocidad de expansión, pero no afecta el tamaño de un círculo en su punto final. Además, el rango de diámetros de círculo para las mismas cantidades o concentraciones iniciales de antígeno es más pequeño mientras algunos círculos se están expandiendo que cuando todos los círculos han alcanzado sus puntos finales.

La cantidad y concentración de complejos antígeno-anticuerpo insolubles en el borde exterior del círculo aumentan con el tiempo. Por lo tanto, la claridad y densidad del borde exterior del círculo también aumentan con el tiempo. Como resultado, las mediciones de los tamaños de los círculos y los gráficos producidos a partir de estas mediciones suelen ser más precisos después de que los círculos hayan dejado de expandirse que cuando los círculos aún se están agrandando. Por esas razones, a menudo es más deseable tomar mediciones después de que todos los círculos hayan alcanzado sus puntos finales que tomar mediciones mientras algunos o todos los círculos aún se están agrandando.

Las mediciones de círculos grandes son más precisas que las de círculos pequeños. Por lo tanto, a menudo es conveniente ajustar la concentración de anticuerpos y las cantidades iniciales de antígeno para garantizar que los anillos de precipitina sean grandes.

Se puede determinar la concentración de antígeno en una muestra cuya concentración se desconoce al encontrar su ubicación en un gráfico que representa los diámetros de los círculos de precipitina producidos por tres o más muestras de referencia con concentraciones de antígeno conocidas. Dos técnicas producen a menudo líneas rectas en dichos gráficos. Las técnicas producen esas líneas en diferentes tipos de gráficos.

Las técnicas y sus gráficas son:

• Círculos de medición mientras todos se están expandiendo (método cinético): logaritmos de gráficos de concentraciones iniciales de antígeno vs. diámetros de círculos de precipitina en una parcela semi-logarítmica mejorada.
• Círculos de medición después de que todos lleguen a sus puntos finales (método de equivalencia): gráficas gráficas gráficas de concentraciones iniciales de antígeno vs. cuadrados de diámetros de círculos precipitin en una trama de línea óptima.

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